Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Yakın Kızılötesi Hassas, Çekirdek Kabuğu Aşı Dağıtım Platformu Üretimi

doi: 10.3791/60569 Published: October 20, 2020

Summary

Bu makalede, gecikmiş seri sürüm sağlamak için yeni bir aşı dağıtım platformu olan "polybubbles"ı üretmek için kullanılan protokoller açıklanmaktadır. Polikonik (laktik-koglikolik asit) ve polikaprolakon gibi polikrolakon polikasını oluşturmak için polyesterler, küçük moleküller ve antijen ler kargo olarak kullanıldı.

Abstract

Yeni salınım profilleri sağlarken kargonun organik çözücüye maruz kalmasını sınırlandırabilen aşı dağıtım stratejileri, dünya çapında bağışıklama kapsamının iyileştirilmesi için çok önemlidir. Burada, polibubbles adı verilen aşı dağıtım platformu sağlayan yeni bir enjekte edilebilir, ultraviyole- tedavi edilebilir ve gecikmiş patlama salınımı tanıtıldı. Kargo% 10 karboksimethycellulose tabanlı sulu çözelti oluşturulan polyester bazlı polibubbles içine enjekte edildi. Bu kağıt polikabarcıklar küresel şeklini korumak ve polikabarcıklar içinde kargo miktarını en üst düzeye çıkarmak için kargo yerleşimi ve tutma optimize etmek için protokoller içerir. Güvenliği sağlamak için polikasındaki klorlu çözücü içeriği nötron aktivasyon analizi kullanılarak analiz edildi. Serbest bırakma çalışmaları, gecikmiş patlama salınımını onaylamak için polikağın içinde kargo olarak küçük moleküllerle yapılmıştır. Kargonun isteğe bağlı teslimat potansiyelini daha fazla göstermek için, altın nanorodlar yakın kızılötesi lazer aktivasyonu sağlamak için polimer kabuk içinde karıştırıldı.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Sınırlı bağışıklama kapsamı özellikle aşı yla önlenebilir hastalıklardan kaynaklanan 3 milyon kişinin ölümüyle sonuçlanır1. Yetersiz depolama ve taşıma koşulları fonksiyonel aşıların israfına yol açar ve böylece küresel bağışıklamanın azalmasına katkıda bulunur. Buna ek olarak, gerekli aşı programlarına bağlı kalarak değil eksik aşılama da sınırlı aşı kapsama neden olur, özellikle gelişmekte olan ülkelerde2. Tıbbi personele birden fazla ziyaret güçlendirici çekim almak için önerilen süre içinde gereklidir, böylece tam aşı ile nüfus yüzdesi sınırlayan. Bu nedenle, bu zorlukları aşmak için kontrollü aşı teslimatı için yeni stratejiler geliştirmek için bir ihtiyaç vardır.

Aşı dağıtım teknolojileri geliştirmeye yönelik mevcut çabalar emülsiyon tabanlı polimerik sistemleri içerir3,4. Ancak, kargo genellikle potansiyel olarak toplama ve denatürasyona neden olabilir organik çözücü daha fazla miktarda maruz, özellikle protein bazlı kargo bağlamında5,6. Biz yeni bir aşı dağıtım platformu geliştirdik, "polybubbles", potansiyel olarak solvent maruz kalan kargo hacmini en aza indirirken birden fazla kargo bölmeleri ev olabilir7. Örneğin, polikasını çekirdek kabuğu platformumuzda, çapı 0,38 mm (SEM) olan bir kargo cebi, 1 mm'lik polikasının ortasına enjekte edilir. Bu durumda organik çözücüye maruz kalan kargonun yüzey alanı yaklaşık 0,453 mm2olacaktır. Kürelerin (mikro partiküllerin) bir küre (kargo deposu) içindeki ambalaj yoğunluğu göz önüne alındığında, depoya sığabilecek mikro partiküllerin (103μm çapında) gerçek hacmi 0,17 mm 3'tür. Bir mikropartikülün hacmi 5,24x10-8 mm3 olup depoya sığabilecek partikül lerin sayısı ~3.2x106 partikültür. Her mikropartikülün 0,25 μm çapında 20 kargo cebi (çift emülsiyon sonucu) varsa, organik çözücüye maruz2kalan kargonun yüzey alanı 1274 mm 2'dir. Böylece polikabaron içindeki kargo deposu, mikro partiküllerde organik çözücüye maruz kalan organik çözücüye göre ~2800 kat daha az yüzey alanına sahip olacaktır. Polyester bazlı platformumuz böylece organik çözücüye maruz kalan kargo miktarını potansiyel olarak azaltabilir ve bu da kargo toplama ve kararsızlığa neden olabilir.

Polikasında, organik fazdaki polyesterin küresel bir kabarcıkla sonuçlanan sulu bir çözeltiye enjekte edildiği faz ayırma prensibine göre oluşur. Sulu fazdaki kargo daha sonra polikanın ortasına enjekte edilebilir. Başka bir kargo bölmesi potansiyel polimer kabuk ile farklı bir kargo karıştırılarak polikasını içinde elde edilebilir. Bu aşamada polikabar dövülebilir olacak ve daha sonra ortasında kargo ile sağlam bir polikabarcık yapısı neden tedavi edilecektir. Küresel polikasını, polikağın genel boyutunu en aza indirirken polikağın içindeki kargo kapasitesini artırmak için diğer geometrik şekiller in üzerine seçilmiştir. Merkezinde kargo ile Polybubbles gecikmiş patlama serbest göstermek için seçildi. Polybubbles da yakın kızılötesi ile dahil edildi (NIR)- duyarlı (yani, theranostic-sağlayan) ajan, yani altın nanorods (AuNR), polikabarcıkların sıcaklık artışına neden. Bu etki potansiyel olarak daha hızlı bozulmayı kolaylaştırabilir ve gelecekteki uygulamalarda kinetik kontrolü için kullanılabilir. Bu yazıda, polikabarcıklar oluşturmak ve karakterize etmek, polibubbles gecikmiş patlama sürümü elde etmek ve NIR aktivasyonu neden polikabarcıklar içinde AuNR dahil etmek için yaklaşımımızı açıklar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Policaprolacyone triakrilat (PCLTA) sentezi

  1. Kuru 3.2 mL 400 Da policaprolacyone (PCL) triol bir gecede 50 °C açık 200 mL yuvarlak alt şişe ve K2CO3 90 °C'de bir cam şişe.
  2. Trikoyu 6,4 mL diklorometan (DCM) ve 4,246 g potasyum karbonat (K2CO3)ile argon altında karıştırın.
  3. 27,2 mL DCM'de 2,72 mL akrilosil klorür karıştırın ve 5 dk'nın üzerindeki şişedeki reaksiyon karışımına damla yama ekleyin.
  4. Reaksiyon karışımını alüminyum folyo ile kaplayın ve oda sıcaklığında 24 saat argon altında rahatsız edilmeden bekletin.
  5. 24 saat sonra, fazla reaktifleri atmak için vakum altında bir Buchner hunisi üzerinde bir filtre kağıdı kullanarak reaksiyon karışımı filtre.
  6. Diethyl eter kaldırmak için bir 1:3 (vol / vol) ve rotovape 30 °C'de diethyl eter içinde endcapped polimer içeren adım 1.5 filtrat çökeltmek.

2. Polikasının oluşumu

NOT: Deiyonize (DI) suya polimer enjekte etmek, polikabarcıkların şişenin dibine göç etmesini ve bunun sonucunda da düzleşmeye neden olur. Polikabarın düzlemesi önlemek için %10 (wt/vol) karboksimetil selüloz (CMC) yerine cam şişeyi doldurun.

  1. DI suda %10 (wt/vol) CMC çözeltisi hazırlayın.
  2. 0,92 mL'lik cam şişeyi 1 mL transfer pipet kullanarak %10 CMC'nin 0,8 mL'si ile doldurun.
  3. 1000 mg/mL 14 kDa PCL'yi DCM'de karıştırın ve PCLTA'yı 200 μL'lik toplam hacim için 1:3 (vol/vol) sentezlayın veya kloroformda 5 kDa polisi (laktik-koglikolik asit) diyakrilat (PLGADA) 1000 mg/mL 200mg/mL hazırlayın.
  4. Mix 2-hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-metilpropiophenone (fotoproinitiator) polimer ile (PLGADA veya PCL/PCLTA) karışımı 0.005:1 (vol/vol).
  5. 0,016 inç iç çapı olan paslanmaz çelik bir boruya bağlı bir şırınga pompasıüzerine monte edilmiş 1 mL cam şırınga içine 200 μL polimer karışımı yükleyin.
  6. Polimer tüpün ileri ve geri hareketini kontrol etmek için bir mikromotor kullanın ve polimeri cam şişedeki %10 CMC'ye enjekte edin ve polikabunu oluşturun.
  7. 2 W/cm 2'de 60 s için 254 nm dalga boyunda2ultraviyole (UV) altında polibubbles Cure .
  8. Flaş sıvı nitrojen polikabarcıklar dondurma ve 0.010 mBar vakum gecede ve -85 °C lyophilize.
  9. Polybubbles'ı forseps kullanarak kurutulmuş CMC'den ayırın ve artık CMC'yi temizlemek için polikabarcıkları DI su ile yıkayın. Diğer polimerler serbest kinetiği değiştirmek için değişiklikler ile büyük olasılıkla kullanılabilir unutmayın.

3. Polikabarcık çapının modülasyonu

  1. 0,92 mL'lik cam şişeyi 1 mL transfer pipet kullanarak %10 CMC ile doldurun.
  2. 1000mg/mL 14kDa PCL ile 1:3 (vol/vol) ile PCL/PCLTA'yı karıştırın ve PCLTA sentezedin. 0.005:1 (vol/vol) ile fotoinitiator'u polimer karışımıile karıştırın.
  3. Polimer karışımını, 0,016 inç iç çapı olan paslanmaz çelik bir boruya bağlı bir şırınga pompasına monte edilmiş 1 mL cam şırıngaya yükleyin.
  4. Polimer tüpün ileri ve geri hareketini kontrol etmek için bir mikromotor kullanın ve polimeri cam şişedeki %10 CMC'ye enjekte edin ve polikabunu oluşturun.
  5. Çeşitli çaplarda polikasını elde etmek için dağıtım oranını 0,0005'ten 1 μL/s'ye göre değiştirin.
  6. Farklı çapta polikabarcıklar ile şişe görüntüleri alın.
  7. Polybubbles çapını ölçmek ve ölçek olarak şişe boyutunu kullanmak için ImageJ kullanın.

4. Polybubble içinde kargo merkezleme

  1. K2CO3kullanılarak PCL/PCLTA viskozitesinin modülasyonu :
    NOT: 1000 mg/mL'de 5 kDa PLAGDA'nın viskozitesi kargonun merkezalınması için yeterli olduğundan PLGADA'nın viskozitesi K2CO3 kullanılarak değiştirilmemektedir.
    1. 0 mg/mL, 10 mg/mL, 20 mg/mL, 40 mg/mL ve 60 mg/mL dahil olmak üzere çeşitli konsantrasyonlarda PCLTA'ya K2CO3 (PCLTA reaksiyonundan sonra izole edildi) ekleyin.
    2. Reometri kullanarak kesme hızını 0'dan 1000'e 1/s'ye değiştirerek çözeltilerin dinamik viskozitelerini ölçün.
    3. Farklı K2CO3 (adım 4.1.1) konsantrasyonlarında PCL/PCLTA çözeltileri kullanılarak oluşturulan polikasınıların ortasına kargoyu el ile enjekte edin (kargo karışımını hazırlamak için adım 4.2'ye bakın). Adım 4.1.1'den hangi çözeltinin kargonun ortada tutulmasına neden olabileceğini gözlemleyerek K2CO3'ün optimum konsantrasyonunun belirlenmesi.
  2. CMC ile kargonun (küçük moleküllerle zaten gösterilen fizibilite) merkeze
    1. Kargonun viskozitesini artırmak için kargoyu bir rotatorda bir gecede %5 (wt/vol) CMC ile karıştırın.
    2. Polybubble'a 2 μL kargo karışımını elle enjekte edin ve 2 W/cm2'de60 s için 254 nm dalga boyunda UV kürleme ile devam edin.
    3. Flaş 30 s için sıvı nitrojen polikabarcıklar dondurma ve 0.010 mBar vakum gecede lyophilize ve -85 °C.
    4. Forseps kullanarak kurutulmuş CMC'den polikabarcıkları ayırın ve artık CMC'yi çıkarmak için DI suyuyla yıkayın.
    5. Polybubble'ı ikiye kesin ve kargonun ortalanması için konfokal mikroskopi kullanarak yarıları görüntüleyin (uyarma ve emisyon dalga boyları için 6. adıma bakın).

5. Kargo Formülasyonu

NOT: Polikabarcık formülasyonu küçük moleküller, proteinler ve nükleik asitler de dahil olmak üzere çeşitli kargo tipleri ev olabilir.

  1. Önceki çalışmalara dayanarak, protein kargo durumunda, polietilen glikol dahil excipients kullanın (PEG)6, polivinilpyrrolidone (PVP), ve glikopolimerler6 polikabarcık formülasyonu sırasında protein istikrarını artırmak için.
  2. 2. adımdaki protokole göre çok kabarcıklar oluştur.
  3. 625 μL HIV gp120/41 antijenine 17,11 g trehalose ekleyerek antijen çözeltisini hazırlayın.
  4. Polybubble ortasında 1 μL antijen çözeltisi elle enjekte edin.
  5. 0, 7, 14 ve 21 gün açık polikabarcıklar ve uyarma ve emisyon dalga boyları ile antijen floresan kayıt 497 nm ve 520 nm, sırasıyla.
  6. Enzime bağlı immünosorbent tsay (ELISA) kullanarak antijenin işlevselliğini belirleyin ve %5 yağsız sütü bloke edici tampon olarak kullanın.

6. Kargonun serbest bırakılması

NOT: Küçük molekül veya antijen kargo tipi olarak kullanılabilir

  1. Küçük molekül
    1. 37 °C'de 400 μL fosfat tampon salini (PBS), PLGADA polikabarcıkları için 50 °C ve PCL/PCLTA polikasında 70 °C'de ortalanmış acriflavine ile inkübatör polikasını.
      NOT: Vücut ısılarının üzerinde test yapmanızı önermemizin nedeni, PCL ve PLGA içindeki altın nanorodları (AUNR) lazerle rken polikağın ulaştığı sıcaklığı (50 °C) simüle etmektir; ve b) PCL'nin (50 °C, 70 °C) bozulma sürecini hızlandırır.
    2. Her zaman noktasında, supernatants toplamak ve taze PBS 400 μL ile değiştirin.
    3. Toplanan süpernatantlarda floresan yoğunlukları ölçmek için bir plaka okuyucu kullanın.
      NOT: Acriflavine için 416 nm/514 nm ex/em kullanın.
  2. Antijen
    1. 37 °C'de 400 μL PBS'de ortalanmış büyükbaş albumin serumu (BSA)-488, PLGADA polikasında 50 °C ve PCL/PCLTA polikasında 50 °C'de kuluçka polikasında.
    2. Her zaman noktasında, supernatants toplamak ve 400 μL taze PBS ile değiştirin.
    3. Toplanan süpernatantlarda floresan yoğunlukları ölçmek için bir plaka okuyucu kullanın. BSA-488 için 497 nm/520 nm ex/em kullanın.
      NOT: Antijenin aşırı sıcaklığa maruz kalmaması için PCL/PCLTA polikasını 70 °C'de serbest bırakma çalışması yapılmamalıdır.

7. Toksisite

  1. Nötron aktivasyon analizi (NAA) kullanılarak polikabarcıklarda klor içeriğinin ölçülmesi
    1. Bu çalışma için 0,010 mBar vakum ve -85 °C'de 2, 4, 6, 20 ve 24 saat için lyophilized polibubbles kullanın.
    2. Ölçü 5-9 polikabarcıklar mg ve LDPE ışınlama şişeleri üzerine yerleştirin.
    3. Ulusal standartlar ve teknoloji enstitüsünden (NIST) izlenebilir kalibrasyon çözeltisinden 1000 g/mL klor kalibrasyon çözeltisi hazırlayın.
    4. 1- megawatt Triga reaktörünün her numuneüzerinde nötron ışınlamalarını 9,1 × 1012/cm 2·s 600 s için nötron ışınlamaları gerçekleştirin.
    5. Polikasını ışınlanmamış şişelere aktarın.
    6. 360 s çürüme aralıklarından sonra 500 s için gama ışını spektrumları elde etmek için HPGe dedektörü kullanın.
    7. Verileri analiz etmek için canberra Industries'in NAA yazılımını kullanın.
  2. NAA kullanarak polikabarcıklardan salınan klor içeriğinin ölçülmesi
    1. Bir gecede (0.010 mBar vakumve -85 °C'de) 37 °C'de 400 μL PBS'de liyofilize edilen polikasında inküpoliz polikasında.
    2. Kuluçkadan sonra 1, 2 ve 3.
    3. Adım 7.1'de açıklandığı gibi yukarıdaki yöntemi kullanarak NAA kullanarak klor içeriği için süpernatantları analiz edin.

8. Kittler, S., ve ark.8 tarafından AuNR Sentezi

  1. AuNR tohumlama çözeltisini 250 μL 10 mM kloroaurik asit (HAuCl4), 7,5 mL 100 mM setrimonyum bromür (CTAB) ve 600 μL 10 mM buz gibi sodyum borohidrit (NaBH4)karıştırarak hazırlayın.
  2. 100 mM CTAB'ın 40 mL'si, 10 mM HAuCl4,250 μL gümüş nitrat (AgNO3)ve 270 μL 17,6 mg/mL askorbik asidi bir tüpe karıştırarak Büyüme çözeltisini hazırlayın.
  3. 1 dk için 1200 rpm'de 420 μL tohum çözeltisini büyüme çözeltisi ile şiddetle karıştırın. Daha sonra 16 saat tepki vermek için karışımı rahatsız edilmeden bırakın.
  4. 10 dk için 8000 × g santrifüj tarafından karışımdan fazla reaktifler çıkarın ve supernatant atın.

9. AuNR'ların Soliman, M.G., ve diğerleri tarafından hidrofobikleştirilmesi9

  1. 1 mM sodyum hidroksit (NaOH) kullanarak sentezlenmiş CTAB stabilize AUNR'ların 1,5 mL'lik pH'ını 10'a ayarlayın.
  2. Çözeltiyi 0,1 mL 0,3 mM metillenmiş PEG (mPEG) tiol ile bir gecede 400 rpm'de karıştırın.
  3. 4 gün boyunca 500 rpm kloroform 0.4 M dodecylamine (DDA) ile PEGYlated AuNRs karıştırın.
  4. Hidrofobik AUNR içeren üst organik katmanı dışarı boru ve 4 ° C'de saklayın ileride kullanıma kadar.

10. Polikasıların NIR aktivasyonu

  1. Polimer (PLGADA veya PCL/PCLTA) çözeltisini hidrofobik AUNR ile 1:9 (vol/vol) karıştırın.
  2. 0.005:1 (vol/vol) ile polimer-AuNR karışımına fotoinitiator ekleyin.
  3. Polimer-AuNR karışımını %10 CMC (wt/vol) ile 0,92 mL cam şişeye enjekte ederek polikabarcıklar oluşturur (adım 2'ye bakın).
  4. 2W/cm2'de 60 s için 254 nm dalga boyunda polikabarcıkları iyileştirin.
  5. 30 s için sıvı nitrojen de flaş dondurma ve 0.010 mBar vakum gecede lyophilize ve -85 °C.
  6. Forseps kullanarak kurutulmuş polikabarcıkları ayırın ve artık CMC'yi çıkarmak için DI suyuyla yıkayın.
  7. Polikasını 37 °C'de 400 μL PBS'de kuluçkaya yatırın.
  8. Her Pazartesi, Çarşamba ve Cuma 5 dakika boyunca 8A 801 nm NIR lazer kullanarak polibubbles etkinleştirin.
  9. Sıcaklık değerlerini elde etmek için lazer aktivasyonundan önce ve sonra polikasının ileriye dönük kızılötesi (FLIR) görüntülerini alın.
  10. FLIR görüntülerinden alınan sıcaklık değerlerini temel alan, lazer aktivasyonu öncesi ve sonrası arasındaki sıcaklık farklarını hesaplayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Polybubbles yaygın SEM ve NAA kullanılarak karakterize edildi. Kargo başarılı bir gecikme li serbest bırakılması ile sonuçlanması için ortalandı. Polikabarcıklar da başarılı bir şekilde lazer aktive polikabarcıklar içinde AuNR varlığı nedeniyle aktive edildi.

Polybubble karakterizasyonu
CMC olmadan sulu bir çözeltiye enjekte edilen polikalar, cam şişenin alt kısmıyla temasları nedeniyle düzleştirilmiş bir polikasını ortaya çıkarır (Şekil 1A,B). DI su yerine %5 CMC bazlı sulu çözelti kullanıldığında kısmi düzleme gözlenmiştir(Şekil 1C). Daha sonra, cam şişedeki %10 CMC bazlı sulu çözelti, çözeltide polikağın askıya alınmasına ve böylece polikağın fplititinin başarılı bir şekilde sürdürülmesine neden olmuştur(Şekil 1D).

Kargo merkezleme
CMC yokluğunda polikabuna kargo enjeksiyonu, polikasında kargonun bekletilmemesine neden olan sızıntıya neden olur(Şekil 3). Bu soruna karşı iki yaklaşım kullanılmıştır: 1) PCLTA'nın viskozitesi, PCL triol'ü triakrilatla sonlandırDıktan sonra izole edilen K2CO3 kullanılarak başarıyla artırıldı(Şekil 2), ve 2) kargonun viskozitesi %5 CMC ile karıştırıldıktan sonra başarıyla artırıldı(Şekil 3, Şekil 4). PLGADA polikabarcıklarının viskozitesi kargonun merkezlemasını kolaylaştırmak için yeterliydi ve bu nedenle K2CO3kullanılarak modüle edilmedi.

Antijen işlevselliği
HIV gp120/41 antijeni polikabuna enjekte edilmeden önce trehalose ile karıştırıldı ve trehalose olmadan(Şekil 5). Antikorların antijene bağlanma etkinliğinin (işlevsellik olarak da anılır) trehalose li ve trehalose'siz istatistiksel olarak anlamlı bir fark olmadığı gözlenmiştir.

Lazer aktivasyonu olmadan serbest bırakma çalışmaları
Plgada polikabarcıklarında sırasıyla 37 °C(Şekil 6A) ve 50 °C (Şekil 6 B)(Şekil 6B)olarak kuluçkaya yatan polikabarcıklar için 19 ve 5 gün ortalarında acriflavine ile gecikmiş patlama sayılmaları gözlendi. 50 °C (Şekil 7A) ve 70 °C(Şekil 7B)(Şekil 7B)olarak kuluçkaya yatırılamış polikabarcıklar için 160 ve 60 gün ortalarında acriflavine bulunan PCL/PCLTA polikabarcıklarında da gecikmeli patlama salınımları gözlendi. Bu salınım çalışmaları lazer-aktivatif AUNR yokluğunda yapılmıştır.

Polikabarların in vitro lazer aktivasyonu
Kabukta AuNR'lar bulunan polikasiler PLGADA polikabarcıklarında(Şekil 8A)ve PCL/PCLTA polikabarcıklarında(Şekil 8B)birçok kez başarılı bir şekilde lazerle aktive edildi. Lazer aktivasyonu öncesi ve sonrası sıcaklık değişimleri 10 ± 1 °C ve 5 ± 1 °C idi PCL/PCLTA polikabaronklarında kabukta sırasıyla daha yüksek ve daha düşük AuNR konsantrasyonu vardı. Lazer aktivasyonu öncesi ve sonrası gözlenen sıcaklık değişimleri, kabukta sırasıyla daha yüksek ve daha düşük AuNR konsantrasyonu bulunan PLGADA polikabarcıklarında 11 ± 2 °C ve 6 ± 1 °C idi.

Figure 1
Şekil 1: Çok kabarcıkların her biri kadar devam eder. (A) 14 kDa PCL/300 Da PCLTA'nın SEM görüntüleri, polikağın cam şişenin dibi ile teması nedeniyle düzleştirilmiş polikasını; (B) 14 kDa PCL/300 Da PCLTA polikasını cam alt ile temas halinde olmayan üstten; (C) PCL/PCLTA polikabarcıkları, DI su çözeltisine kıyasla %5'lik bir CMC çözeltisine enjekte edildiğinde daha az düzleştirici dereceye sahip olan poliklara, şişeyle temas noktasında yarımküre benzeri bir şekil oluşmasına neden olur; (D) %10'luk bir CMC çözeltisine enjekte edildiğinde cam şişenin dibine ulaşmayan polikasını oluşturan ve küresel şeklin korunmasını sağlayan polikabar. Belirtilen ölçek çubuklarının tümü 500 μm'dir. Bu rakam Lee ve ark.7'dendeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: PCLTA viskozitesinin modülasyonu. PCLTA'da K2CO3 konsantrasyonu 0 mg/mL'den 80 mg/mL'ye çıkarıldı ve K2CO3konsantrasyonu ile orantılı olarak dinamik viskozitenin arttığı gözlendi. Bu rakam Arun Kumar ve ark10değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: CMC ile ve cmc olmadan polikabuna kargo enjeksiyonu. Üst panel, CMC yokluğunda enjeksiyon sırasında kargo sızıntısı video çıkarılan çerçeveleri gösterir. Alt panel% 5 CMC varlığında polikasında kargo tutma video çıkarılan çerçeveleri gösterir. Bu rakam Lee ve ark.7'dendeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Merkezli kargo. Floresan mikroskop görüntüleri (A) PCL/PCLTA polikasını ortalanmış kargo, (B) PCL/PCLTA polikasını kabukta kargo ile ve floresan olmayan boya merkezli. Bu rakam Arun Kumar ve ark10değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: Trehalose ile antijen işlevselliği. Hiv gp120/41 işlevselliği ile ve polikabarcık içinde trehalose olmadan ELISA kullanılarak analiz edildi. Bir antikorun proteine bağlanma etkinliği genellikle proteinin işlevselliği için bir gösterge olarak kabul edilir. Bu çalışmada antijenin işlevselliğini tartıştığımız zaman, bu antijenin ilgi proteinini bağlayan antikorlara yardımcı olması (protein işlevselliğinin bir göstergesidir). İki grup arasında istatistiksel anlamlılık gözlenmedi. Güven aralıkları katı ve noktalı çizgilerle gösterilir. Bu rakam Lee ve ark.7'dendeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 6
Şekil 6: PLGADA polikabarcıklarından gecikmiş patlama salınımı.. PLGADA polikabarcıklarından(A) 37 °C, (B) 50 °C'de acriflavine ile gecikmiş patlama salınımlarını gösteren salınım çalışmaları. Düz çizgi, veri noktalarına göre elde edilen uygun eğriyi gösterir. Bu rakam Arun Kumar ve ark10değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 7
Şekil 7: PCL/PCLTA polikabarcıklarından gecikmeli serisalınımı. (A) 50 °C, (B) 70 °C. ortasında acriflavine bulunan PCL/PCLTA polikabarcıklarından gecikmiş patlama salınımlarını gösteren yayın çalışmaları.  Bu rakam Arun Kumar ve ark10değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 8
Şekil 8: Polikasitlerin NIR lazer aktivasyonu. (A) PLGADA polikabarcıklarında NIR lazer aktivasyonundan önce ve sonra gözlenen sıcaklık değişimi, (B) PCL/PCLTA polikasını polimer kabuğunda aunr'ların daha yüksek ve daha düşük konsantrasyonuna sahip. Sıcaklıktaki bu artış, kargonun daha erken serbest bırakılmasına yol açan polimer bozulmasını hızlandırmak için kullanılabilir. Bu rakam Arun Kumar ve ark10değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Güncel teknolojiler ve zorluklar
Emülsiyon bazlı mikro ve nano tanecikleri yaygın olarak ilaç dağıtım taşıyıcıları olarak kullanılmaktadır. Bu cihazlardan kargo serbest kinetik kapsamlı olarak çalışılmıştır rağmen, patlama serbest kinetik kontrol büyük bir sorun olmuştur11. Kargo çok yönlülüğü ve işlevselliği, aşırı sulu ve organik çözücülere maruz kalma nedeniyle emülsiyon tabanlı sistemlerde de sınırlıdır. Protein bazlı kargo genellikle mikro ve nano tanecikleri kargo denatürasyon ve toplama olasılığı nedeniyle uyumlu değildir12. Kargo stabilitesinin yanı sıra, serodönüşüme yol açan güçlendirici çekimlere duyulan ihtiyaç nedeniyle, kargo kinetikleri aşılar bağlamında özellikle önemlidir. Tek enjeksiyon aşı sistemleri kavramı birkaç on yıldır var ve henüz klinik olarak tercüme edilmemiştir gibi aşı teslim bu sorunları ele almak için önceki çabaları, yeterince başarılı olmamıştır.

Polibubble aşı dağıtım platformumuz, maruz kalan kargo hacmini en aza indirerek kargonun organik çözücüye daha fazla maruz kalmasıyla zorlukların üstesinden gelebilir. Bu teknoloji potansiyel olarak en az iki kargo bölmesini barındırabilir: merkezdeki kabuktaki kargo ve kargo. Ortalanmış kargo ile Polybubbles küçük moleküller ve antijen de dahil olmak üzere farklı kargo türleri, uyumlu olurken kargo patlama serbest kontrol etmek için kullanılabilir. Bu çalışmada, gecikmeli patlama salınımını göstermek için yük tipi olarak polimer taşıyıcılar ve acriflavine (küçük molekül) olarak, değişen bozulma süreleri, PLGADA (daha kısa bozulma süresi) ve PCL/PCLTA (daha uzun bozulma süresi) olan polizonlar kullanıldı. Aşağıdaki bölümlerde, özellikle gelecekteki isteğe bağlı teslimat uygulamaları için hem gecikmiş seri sürüm hem de NIR aktivasyonuna olanak tanıyan polikabarcıklar oluşturmada önemli adımları açıklıyoruz.

Polybubble içinde kargo merkezleme
Kargo merkezleme polikabarcıkların formülasyonu sırasında karşılaşılan önemli zorluklardan biriydi. Enjeksiyondan hemen sonra kargo yüzeye taşınır ve sulu %10 CMC çözeltisine patlamadan kargo cebi stabilize edilir. Bu tür merkezsiz kargo ile Polybubbles kargo çevreleyen polimer olmayan tektip kalınlığı nedeniyle daha erken serbest neden olabilir. Polimer ve kargonun viskozitesinin modülasyonu böylece kargo merkezliliği ile ilgili sorunların çözümünde çok önemliydi. Kargo çözeltisinin %5 CMC ile karıştırılmasıyla kargonun viskozitesi artırıldı. Polimerin viskozitesini artırmak için, polimerin moleküler ağırlığı değiştirilmiş olabilir. Ancak, artan molekül ağırlığı genellikle yavaş polimer bozulması ile sonuçlanır ve böylece kargo nun salınımında daha fazla gecikmeye neden olur. Böylece polimerin viskozitesi polimerin konsantrasyonu artırılarak değiştirilmiştir. Yüksek konsantrasyon (1000 mg/mL) PLGADA viskozitesini artırmak için yeterliydi. Ancak, PCL/PCLTA'nın viskozitesi kargoyu ortada tutmak için yeterli değildi. Böylece PCLTA'nın konkositititini artırmak için PCLTA'nın son lama reaksiyonundan sonra izole edilen K2CO3 kullanılmıştır.

Roman gecikmiş sürüm
Merkezli kargo ile polibubbles kullanılarak yapılan salınım çalışmalarından gecikmiş patlama salınımı gözlenmiştir. Küçük molekül (acriflavine) serbest profili incelemek için polikabarcıklar merkezli kargo olarak kullanılmıştır. Polimerlerin bozulma süresindeki farklılık nedeniyle kullanılan polyestere göre benzersiz salınım profilleri gözlenmiştir. PLGADA polikabarcıklarında PCL/PCLTA polikabarcıklarına göre patlama salınımı daha önce gözlenmiştir. PLGA PCL13ile karşılaştırıldığında daha hızlı bozulur çünkü erken kargo serbest PLGADA polikabarcıklar gözlendi. İki tip polyester ile serbest bırakma kinetiklerinin başarılı modülasyonu üzerine, kargonun isteğe bağlı olarak serbest bırakılmasını sağlamak için polikasını daha da tasarlamak istedik.

Polikabarların NIR aktivasyonu
Hastaların ihtiyaçlarının zamanlaması ile ilgili kargonun isteğe bağlı olarak serbest bırakılması mevcut teslimat stratejileri14kullanarak elde etmek için zor olmuştur. Talep üzerine kargo salınımını hızlandırmanın, NIR'ye duyarlı (yani teranostik etkin) ajanların kullanımı yoluyla polimer bozulmasını hızlandırarak mümkün olabileceğini varsaverdik. AuNR kapsamlı deri15ile birkaç santimetre seyahat edebilir NIR lazer kullanılarak aktive olma yetenekleri için çalışılmıştır. CTAB stabilize AuNR'lar böylece Kittler, S, ve diğerleri tarafından protokole göre hazırlanmış ve Solimon, M.G., ve ark. tarafından yayınlanan yöntemlere göre hidrofobikleştirilmiştir. Kabukta hidrofobik AUNR'lar bulunan polikasonlar, sıcaklık değişimini gözlemlemek için istenilen zaman noktalarında NIR lazer ile ışınlandı. Lazer öncesi ve sonrası sıcaklıklar FLIR görüntülerine göre ölçüldü. Kürlenmiş polimer kabuk lazer aktivasyonu sırasında AuNR'ların şeklinin korunmasına yardımcı oldu ve böylece polikasonlara birden fazla NIR aktivasyonu sağladı. Önceki literatürde, AuNR genellikle lazer aktivasyonu nedeniyle çubuk benzeri şekil (NIR aktivasyonu için çok önemli) kaybetmek bilinmektedir çünkü bu ilginç bir gözlem16. AuNR ile polibubbles başarılı lazer aktivasyonu polybubbles yeni nesil kargo on-demand serbest kontrol etmek için yol açabilir.

Önemi ve gelecekteki uygulamalar
Bu çalışmadan elde edilen sonuçlar, polikabarcıkların yeni bir aşı dağıtım platformu olarak kullanılma potansiyeline sahip olduğunu göstermektedir. Bu yazıda açıklanan polikonları hazırlanması, diğer araştırmacıların diğer terapötik uygulamalar için bir dağıtım platformu olarak polikonları kullanmalarını sağlayacaktır. Örneğin, aşı teslim ek olarak, polibubbles da potansiyel olarak salınım kinetik değişen sinerjik terapötik ajanlar teslim için kullanılabilir. Ayrıca, polibubbles biyobozunur ve birçok FDA onaylı tıbbi cihazlarda kullanılan polyesterler yapılır. Biz daha fazla polikabarcıklar serbest klor EPA17tarafından önerilen güvenlik seviyeleri içinde olduğunu göstererek polikabarcıklar güvenliğini doğruladı. Böylece, bizim roman, enjekte edilebilir, UV-tedavi polybubble platformu kargo türleri çeşitli için güvenli ve etkili bir ilaç dağıtım platformu olarak kullanılmak üzere potansiyele sahiptir.

Bu teknolojinin sınırlamaları
Polybubble platform teknolojisi potansiyel kontrollü serbest bırakılması sağlayan bir aşı dağıtım platformu olarak kullanılabilir. Çalışmalarımız, antijenler ve küçük moleküller de dahil olmak üzere farklı kargo tipleri sunabilen bu platformun çok yönlülüğünü vurgulamaktadır. Ancak, bu teknolojinin mevcut sınırlamalarından biri kargo şu anda elle enjekte ediliyor olmasıdır. Ölçekleme amacıyla, şu anda polikabarın içinde kargonun enjeksiyonuna (yani bir dizi olarak) olanak sağlayacak ve potansiyel olarak bu teknolojinin geçirilebilirliği yle ilgili endişeleri hafifletmeye yardımcı olacak otomatik bir platform tasarlamaktayız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgments

Nötron aktivasyon analizine (NAA) yardımcı olan TAMU kimya bölümündeki elemental analiz laboratuarına bağlı Dr. Bryan E. Tomlin'e teşekkür ederiz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-Step Ultra Tetramethylbezidine (TMB)-Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) Substrate Solution Thermo scientific 34028
2-Hydroxy-2-methylpropiophenone TCI AMERICA H0991
450 nm Stop Solution for TMB Substrate Abcam ab17152
Acryloyl chloride Sigma Aldrich A24109-100G
Acriflavine Chem-Impex International 22916
Anhydrous ethyl ether Fisher Chemical E138-500
Anti-HIV1 gp120 antibody conjugated to horseradish peroxidase (HRP)
Bovine serum albumin (BSA) Fisher BioReagents BP9700100
BSA-CF488 dye conjugates Invitrogen A13100
Bromosalicylic acid Acros Organics AC162142500
Carboxymethylcellulose (CMC) Millipore Sigma 80502-040
Centrimonium bromide (CTAB) MP Biomedicals ICN19400480
Chloroform Fisher Chemical C2984
Coating buffer Abcam ab210899
Dichloromethane (DCM) Sigma Aldrich 270997-1L
Diethyl ether Fisher Chemical E1384
Dodeacyl Amine Acros Organics AC117665000
Doxorubicin hydrochloride Fisher BioReagents BP251610
L-ascorbic acid Acros Organics A61 100
Legato 100 Syringe Pump KD Scientific 14 831 212
mPEG thiol Laysan Bio NC0702454
Nonfat dry milk Andwin Scientific NC9022655
Potassium carbonate Acros Organics AC424081000
Phosphate saline buffer Fisher BioReagents BP3991
(Poly(caprolactone) Sigma Aldrich 440744-250G
(Poly(caprolactone) triol Acros Organics AC190730250
Poly (lactic-co-glycolic acid) diacrylate CMTec 280050
Potassium carbonate Acros Organics AC424081000
Recombinant HIV1 gp120 + gp41 protein Abcam ab49054
Silver nitrate Acros Organics S181 25
Sodium borohydride Fisher Chemical S678 10
Tetrachloroauric acid Fisher Chemical G54 1
Trehalose Acros Organics NC9022655
Triethyl amine Acros Organics AC157910010

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. World Health Organization. Global Immunization: Worldwide Disease Incidence. Children's Hospital of Philadelphia. https://www.chop.edu/centers-programs/vaccine-education-center/global-immunization/diseases-and-vaccines-world-view (2018).
  2. Paul, A., Bera, M., Gupta, P., Singh, N. D. P. o-Hydroxycinnamate for sequential photouncaging of two different functional groups and its application in releasing cosmeceuticals. Organic and Biomolecular Chemistry. 17, (33), 7689-7693 (2019).
  3. Kumari, A., Yadav, S. K., Yadav, S. C. Biodegradable polymeric nanoparticles based drug delivery systems. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 75, (1), 1-18 (2010).
  4. Dai, C., Wang, B., Zhao, H. Microencapsulation peptide and protein drugs delivery system. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 41, (2-3), 117-120 (2005).
  5. Souery, W. N., et al. Controlling and quantifying the stability of amino acid-based cargo within polymeric delivery systems. Journal of Control Release. 300, 102-113 (2019).
  6. Wang, W. Advanced protein formulations. Protein Science. 24, (7), 1031-1039 (2015).
  7. Lee, J., et al. An ultraviolet-curable, core-shell vaccine formed via phase separation. Journal of Biomedical Materials Research Part A. (2019).
  8. Kittler, S., Hickey, S. G., Wolff, T., Eychmüller, A. Easy and Fast Phase Transfer of CTAB Stabilised Gold Nanoparticles from Water to Organic Phase. Zeitschrift für Physikalische Chemie. 229, 235 (2015).
  9. Soliman, M. G., Pelaz, B., Parak, W. J., del Pino, P. Phase Transfer and Polymer Coating Methods toward Improving the Stability of Metallic Nanoparticles for Biological Applications. Chemistry of Materials. 27, (3), 990-997 (2015).
  10. Arun Kumar, S., Good, J., Hendrix, D., Yoo, E., Kim, D., Deo, K. A., Jhan, Y. Y., Gaharwar, A. K., Bishop, C. J. Nanoengineered Light-Activatable Polybubbles for On?Demand Therapeutic Delivery. Adv. Funct. Mater. 2003579 (2020).
  11. Wuthrich, P., Ng, S. Y., Fritzinger, B. K., Roskos, K. V., Heller, J. Pulsatile and delayed release of lysozyme from ointment-like poly(ortho esters). Journal of Controlled Release. 21, (1), 191-200 (1992).
  12. Wang, W. Instability, stabilization, and formulation of liquid protein pharmaceuticals. International Journal of Pharmaceutics. 185, (2), 129-188 (1999).
  13. Wong, D. Y., Hollister, S. J., Krebsbach, P. H., Nosrat, C. Poly(epsilon-caprolactone) and poly (L-lactic-co-glycolic acid) degradable polymer sponges attenuate astrocyte response and lesion growth in acute traumatic brain injury. Tissue Engineering. 13, (10), 2515-2523 (2007).
  14. Davoodi, P., et al. Drug delivery systems for programmed and on-demand release. Advanced Drug Delivery Reviews. 132, 104-138 (2018).
  15. Huang, Y. C., Lei, K. F., Liaw, J. W., Tsai, S. W. The influence of laser intensity activated plasmonic gold nanoparticle-generated photothermal effects on cellular morphology and viability: a real-time, long-term tracking and monitoring system. Photochemical and Photobiological Sciences. 18, (6), 1419-1429 (2019).
  16. Link, S., Burda, C., Nikoobakht, B., El-Sayed, M. A. Laser-Induced Shape Changes of Colloidal Gold Nanorods Using Femtosecond and Nanosecond Laser Pulses. The Journal of Physical Chemistry B. 104, (26), 6152-6163 (2000).
  17. U.S. Environmental Protection Agency. Chlorine. https://www.epa.gov/sites/production/files/2016-09/documents/chlorine.pdf (2000).
Yakın Kızılötesi Hassas, Çekirdek Kabuğu Aşı Dağıtım Platformu Üretimi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Arun Kumar, S., Lee, J., Bishop, C. J. Production of Near-Infrared Sensitive, Core-Shell Vaccine Delivery Platform. J. Vis. Exp. (164), e60569, doi:10.3791/60569 (2020).More

Arun Kumar, S., Lee, J., Bishop, C. J. Production of Near-Infrared Sensitive, Core-Shell Vaccine Delivery Platform. J. Vis. Exp. (164), e60569, doi:10.3791/60569 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter