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Biology

근적외선 민감성 코어 쉘 백신 전달 플랫폼 생산

doi: 10.3791/60569 Published: October 20, 2020

Summary

이 문서에서는 지연된 버스트 릴리스를 가능하게 하기 위해 새로운 백신 전달 플랫폼인 "폴리버블"을 생성하는 데 사용되는 프로토콜에 대해 설명합니다. 폴리에스테르(젖산-공동 글리콜산) 및 폴리카폴락톤을 포함하는 폴리에스테르는 폴리버블을 형성하기 위해 사용되었고 소분자 및 항원은 화물로 사용되었다.

Abstract

새로운 방출 프로필을 가능하게 하면서 유기 용매에 화물의 노출을 제한할 수 있는 백신 전달 전략은 전 세계적으로 예방 접종 범위를 개선하는 데 매우 중요합니다. 여기서, 새로운 주사용, 자외선-치료 가능 및 지연된 버스트 방출-폴리버블이라는 백신 전달 플랫폼이 도입된다. 화물은 10% 카박스시메틸셀룰로오스-기반 수성 용액으로 형성된 폴리에스테르 기반 의 폴리버블에 주입되었다. 이 백서에는 폴리버블의 구형 형태를 유지하고 화물 배치 및 유지를 최적화하여 폴리버블 내화물의 양을 최대화하는 프로토콜이 포함되어 있습니다. 안전을 보장하기 위해 중성자 활성화 분석을 사용하여 폴리버블 내의 염소 처리된 용매 함량을 분석하였다. 방출 연구는 지연 된 버스트 방출을 확인하기 위해 폴리 버블 내의화물로 작은 분자로 수행되었다. 화물의 온디맨드 납품 가능성을 더욱 보여주기 위해, 금 나노로드는 근적외선 레이저 활성화를 가능하게 하기 위해 폴리머 쉘 내에서 혼합되었다.

Introduction

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제한된 예방 접종 적용은 백신 예방 가능한 질환1로인한 3백만 명의 사망을 초래합니다. 부적절한 저장 및 운송 조건은 기능성 백신의 낭비로 이어지므로 글로벌 예방 접종을 줄이는 데 기여합니다. 또한, 필요한 백신 스케줄을 준수하지 않기 때문에 불완전한 예방 접종은 특히 개발도상국에서 제한된 백신 적용을 유발한다2. 부스터 샷을 받는 데 권장되는 기간 내에 의료진을 여러 번 방문해야 하므로 완전한 예방 접종을 통해 인구의 비율을 제한할 수 있습니다. 따라서 이러한 과제를 우회하기 위해 통제 된 백신 전달을위한 새로운 전략을 개발할 필요가 있습니다.

백신 전달 기술 개발을 위한 현재의 노력에는 에멀젼 계 중고체 시스템3,,4가포함된다. 그러나, 화물은 단백질 기반화물5,,6의맥락에서 잠재적으로 응집 및 데아포화를 일으킬 수 있는 더 많은 양의 유기 용매에 종종 노출된다. 우리는 용매7에노출되는 화물의 양을 최소화하면서 잠재적으로 여러화물 구획을 수용 할 수있는 새로운 백신 전달 플랫폼인 "폴리 버블"을 개발했습니다. 예를 들어, 폴리버블 코어 쉘 플랫폼에서 직경 0.38mm(SEM)의 화물 주머니 1개가 1mm 폴리버블의 중앙에 주입됩니다. 이 경우 유기 용매에 노출된 화물의 표면적은 약 0.453 mm2입니다. 구체(화물창고) 내의 구체(마이크로입자)의 포장밀도를 고려한 후, 창고에 들어갈 수 있는 실제 미세먼지(직경 10μm)의 실제 부피는 0.17 mm3이다. 하나의 미세 입자의 부피는 5.24x10-8mm 3이며, 따라서 창고에 맞을 수있는 입자 미세 입자의 수는 ~ 3.2x106 입자입니다. 각 마이크로입자의 직경 0.25 μm의 20개의 화물 주머니(이중 에멀젼의 결과)가 있는 경우 유기 용매에 노출된 화물의 표면적은 1274mm2입니다. 따라서 폴리버블 내의 화물 창고는 미세 입자에서 유기 용매에 노출된 화물에 비해 유기 용매에 노출되는 표면적 ~2800배 이하의 표면적을 갖게 된다. 따라서 폴리에스테르 기반 플랫폼은 유기 용매에 노출된 화물의 양을 잠재적으로 줄일 수 있으므로 화물 응집 및 불안정을 유발할 수 있습니다.

폴리버블은 유기상에서 폴리에스테르를 수성 용액으로 주입하여 구형 버블을 초래하는 위상 분리 원리에 기초하여 형성된다. 수성 상에서화물은 폴리 버블의 중심에 주입 될 수있다. 다른 화물 구획은 다른 화물과 폴리머 쉘을 혼합하여 폴리버블 내에서 잠재적으로 달성될 수 있습니다. 이 단계에서 폴리 버블은 가단될 것이고 중간에화물이있는 고체 폴리 버블 구조를 초래하기 위해 치료됩니다. 구형 폴리버블은 폴리버블의 전체 크기를 최소화하면서 폴리버블 내화물 용량을 늘리기 위해 다른 기하학적 모양에 선택되었습니다. 중앙에 화물이 있는 폴리버블이 지연된 버스트 방출을 시연하도록 선택되었습니다. 폴리버블은 또한 근적외선(NIR)-민감한(즉, 테라노스틱-가능하게 하는) 제제, 즉 금 나노로드(AuNR)와 통합되어 폴리버블의 온도 증가를 야기하였다. 이 효과는 잠재적으로 더 빠른 저하를 용이하게 할 수 있으며 향후 응용 프로그램에서 운동학을 제어하는 데 사용할 수 있습니다. 이 논문에서는 폴리버블의 형성 및 특성화, 폴리버블의 지연된 버스트 방출을 달성하고, 폴리버블 내에 AuNR을 통합하여 NIR 활성화를 유발하는 우리의 접근 방식을 설명합니다.

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Protocol

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1. 폴리 카펠라시온 삼각삼국 (PCLTA) 합성

  1. 건조 3.2 mL 의 400 다 폴리 카프라시온 (PCL) 트리올 은 오픈 200 mL 라운드 바닥 플라스크와 K2CO3에서 50 ° C에서 하룻밤 동안 유리 바이알에서 90 °C.
  2. 트리오를 6.4mL의 디클로로메탄(DCM)과 4.246 g의 탄산칼륨(K22CO3)과아르곤 산하에 섞는다.
  3. Acryloyl 염화물 2.72mL을 DCM 27.2 mL에 혼합하고 5 분 이상 플라스크에서 반응 혼합물에 드롭 와이즈를 추가합니다.
  4. 반응 혼합물을 알루미늄 호일로 덮고 아르곤 아래에서 24 시간 동안 실온에서 방해받지 않고 둡니다.
  5. 24시간 후, 진공 아래 부흐너 깔때기에 필터 종이를 사용하여 반응 혼합물을 필터링하여 과도한 시약을 폐기한다.
  6. 1단계에서 1.3(vol/vol) 및 로토바페에서 다이틸 에테르에 단막된 폴리머를 포함하는 1.5단계에서 여과를 침전하여 디틸 에테르를 제거한다.

2. 폴리 버블형성

참고: 디온화된(DI) 물에 폴리머를 주입하면 폴리버블이 유리병 바닥으로 이동하여 바닥이 평평해질 수 있습니다. 10% (wt/vol) 카복티메틸 셀룰로오스(CMC)를 사용하여 유리 바이알을 채우는 대신 폴리버블 플래밍을 방지합니다.

  1. DI 워터에서 10%(wt/vol) CMC 솔루션을 준비합니다.
  2. Fill a 0.92 mL glass vial with 0.8 mL of 10% CMC using a 1 mL transfer pipet.
  3. 14kDa PCL의 1000 mg/mL을 DCM에 혼합하고 PCLTA를 1:3(vol/vol)에 1:3(vol/vol)로 합성하여 총 부피 200μL을 준비하거나 5kDa 폴리(젖소-공동-글리콜산) 디아크레이트(PLAGAD)의 1000 mg/mL를 준비한다.
  4. 2-하이드록시-4′-(2-하이드록스테톡시)-2-메틸프로필피오페논(photoinitiator)을 고분자(PLGADA 또는 PCL/PCLTA) 혼합물과 0.005:1(vol/vol)에 섞는다.
  5. 내경0.016인치의 디스펜싱 스테인리스 스틸 튜브에 연결된 주사기 펌프에 장착된 1mL 유리 주사기에 폴리머 혼합물 200 μL을 적재한다.
  6. 마이크로모터를 사용하여 폴리머 튜브의 전방 및 후진 운동을 제어하여 유리 유리병에서 10% CMC에 폴리머를 주입하여 폴리버블을 형성한다.
  7. 자외선(UV) 하에서 2W/cm2에서60s의 자외선(UV)을 치료한다.
  8. 플래시는 액체 질소에서 폴리 버블을 동결하고 0.010 mBar 진공 및 -85 °C에서 하룻밤 동안 lyophilize합니다.
  9. 포셉을 사용하여 건조 된 CMC에서 폴리 버블을 분리하고 DI 물로 폴리 버블을 세척하여 잔류 CMC를 제거하십시오. 다른 폴리머는 방출 운동학을 변경하기 위해 수정과 함께 사용할 수 있습니다.

3. 폴리 버블 직경의 변조

  1. Fill a 0.92 mL glass vial with 10% CMC using a 1 mL transfer pipet.
  2. 1000mg/mL 14kDa PCL과 1:3(vol/vol)에 PCL/PCLTA를 혼합하고 PCLTA를 합성합니다. 광신염을 폴리머 혼합물과 0.005:1 (vol/vol)에 섞는다.
  3. 고분자 혼합물을 0.016 인치의 내경을 가진 디스펜싱 스테인레스 스틸 튜브에 연결된 주사기 펌프에 장착 된 1 mL 유리 주사기에 적재하십시오.
  4. 마이크로모터를 사용하여 폴리머 튜브의 전방 및 후진 운동을 제어하여 유리 유리병에서 10% CMC에 폴리머를 주입하여 폴리버블을 형성한다.
  5. 다양한 직경의 폴리버블을 얻으려면 분주 속도가 0.0005에서 1 μL/s로 다양합니다.
  6. 직경이 다른 폴리버블로 바이알의 이미지를 가져 가라.
  7. ImageJ를 사용하여 폴리버블의 직경을 정량화하고 바이알크기를 스케일로 사용합니다.

4. 폴리버블 내화물 센터링

  1. K2CO3를이용한 PCL/PCLTA 점도 변조:
    참고: PLGADA의 점도는K2CO3를 사용하여 수정할 필요가 없습니다.
    1. 추가 K2CO3 (PCLTA 반응 후 격리 된) PCLTA에 포함 하 여 다양 한 농도에서 0 mg/mL, 10 mg/mL, 20 mg/mL, 40 mg/mL, 그리고 60 mg/mL.
    2. rheometry를 사용하여 전단 속도를 0에서 1000 1/s로 변경하여 솔루션의 동적 점도를 측정합니다.
    3. K2CO3(Step 4.1.1)의 농도가 다른 PCL/PCLTA 용액을 이용하여 형성된 폴리버블의 중간에2화물을 수동으로 주입한다(4.2단계). 4.1.1 단계에서 어떤 용액이 중간에 화물을 보유할 수 있는지 관찰하여K2CO3의 최적의 농도를 결정합니다.
  2. CMC를 가진 화물의 중심 (이미 작은 분자와 타당성을 보여 주었다)
    1. 화물의 점도를 높이기 위해 하룻밤 동안 회전기에서 5 % (wt / vol) CMC와 화물을 혼합합니다.
    2. 폴리버블에 화물 혼합물 2μL을 수동으로 주입하고 2W/cm2에서60s에 대한 254 nm 파장에서 UV 경화로 진행한다.
    3. 플래시는 30s용 액체 질소로 폴리버블을 동결하고 0.010mBar 진공 및 -85°C에서 하룻밤 동안 lyophilize합니다.
    4. 폴리버블을 포셉을 사용하여 말린 CMC로부터 분리하고 DI 물로 세척하여 잔류 CMC를 제거합니다.
    5. 폴리버블을 반으로 자르고 공초점 현미경 검사를 사용하여 반쪽을 이미지하여 화물이 중심이 되도록 합니다(발암 및 배출 파장의 경우 6단계를 참조).

5. 화물 제형

참고: 폴리버블 제형은 소분자, 단백질 및 핵산을 포함한 다양한 화물 유형을 수용할 수 있습니다.

  1. 이전 연구에 따르면, 단백질 화물의 경우 폴리에틸렌 글리콜(PEG)6,폴리비닐피로돈(PVP), 글리코폴리머(6)를 포함한 부형제를 사용하여 폴리버블 제형 시 단백질의 안정성을 향상시킨다.6
  2. 2단계에서 프로토콜을 기반으로 폴리버블을 형성합니다.
  3. 17.11 g의 트레할로오스를 HIV gp120/41 항원의 625 μL에 추가하여 항원 용액을 준비한다.
  4. 폴리버블 중간에 항원 용액 1μL을 수동으로 주입합니다.
  5. 일 0, 7, 14 및 21일에 폴리 버블을 열고, 각각 497 nm 및 520 nm, 내분 및 방출 파장 497 nm및 520 nm와 항원의 형광을 기록한다.
  6. 효소-연결된 면역흡소벤트 분석(ELISA)을 사용하여 항원의 기능을 결정하고 5% 비지방 우유를 차단 완충제로 사용한다.

6. 화물의 방출

참고: 작은 분자 또는 항원은 화물 유형으로 사용될 수 있습니다.

  1. 소분자
    1. 37°C에서 인산염 완충식염(PBS)의 400μL, PLGADA 폴리버블의 경우 50°C, PCL/PCLTA 폴리버블용 70°C의 중심 아크리플라빈을 중심으로 한 폴리버블을 배양한다.
      참고: 우리가 체온 위에 시험하는 것이 좋습니다 이유는 a) PCL 및 PLGA 내의 금 나노로드 (AuNRs)를 레이저하는 동안 폴리 버블이 도달하는 온도 (50 °C)를 시뮬레이션하는 것입니다; 및 b) PCL (50 °C, 70 °C)의 분해 과정을 가속화한다.
    2. 매 번 초월제를 수집하고 400 μL의 신선한 PBS로 대체하십시오.
    3. 플레이트 판독기를 사용하여 수집된 수퍼나츠의 형광 강도를 정량화합니다.
      참고: 416 nm/514 nm의 전/em을 사용하여 acriflavine에 대 한.
  2. Antigen
    1. 37°C에서 PBS의 400 μL에서 400 μL, PLGADA 폴리버블의 경우 50°C, PCL/PCLTA 폴리버블의 경우 50°C의 중심소 알부민 세럼(BSA)-488을 가진 폴리버블을 배양한다.
    2. 매 번 초월제를 수집하고 400 μL 신선한 PBS로 교체하십시오.
    3. 플레이트 판독기를 사용하여 수집된 수퍼나츠의 형광 강도를 정량화합니다. BSA-488에 497 nm /520 nm의 ex/em을 사용합니다.
      참고: PCL/PCLTA 폴리버블에 대한 70°C의 방출 연구는 항원이 극한의 온도에 노출되는 것을 피하기 위해 수행되어서는 안 됩니다.

7. 독성

  1. 중성자 활성화 분석(NAA)을 사용하여 폴리버블의 염소 함량 정량화
    1. 이 연구를 위해 2, 4, 6, 20 및 24 h용 및 -85°C에서 lyophilized 된 폴리버블을 사용합니다.
    2. 5-9 mg의 폴리버블을 측정하고 LDPE 조사 바이알에 배치하십시오.
    3. 국가 표준 기술 연구소(NIST)-추적 가능한 교정 솔루션에서 염소 교정 솔루션 1000g/mL를 준비합니다.
    4. 1메가와트 트리가 반응기를 사용하여 중성자 연도율 9.1 × 1012/cm 2·s의중성자 플루엔트(600s)에서 각 시료에 중성자 조사를 수행한다.
    5. 다발포를 조사되지 않은 바이알로 옮습니다.
    6. HPGe 검출기를 사용하여 360s 붕괴 간격 후 500s에 대한 감마선 스펙트럼을 얻을 수 있습니다.
    7. 캔버라 인더스트리에서 NAA 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석합니다.
  2. NAA를 사용하여 폴리버블에서 방출되는 염소 함량 정량화
    1. 37°C에서 PBS의 400 μL에서 하룻밤 사이에 lyophilized 된 폴리 버블 (0.010 mBar 진공 및 -85 °C)을 배양하였다.
    2. 인큐베이션 후 1, 2, 3주에 초월자를 수집합니다.
    3. 상기 7.1단계에서 설명한 것과 동일한 방법을 사용하여 NAA를 사용하여 염소 함량에 대한 초월제를 분석한다.

8. 키틀러, S., 외.8에 의해 AuNR 합성

  1. 10m 클로로우리산(HAuCl4),7.5mL의 100m mM 체트리모늄 브로마이드(CTAB), 10mm 얼음 냉간 나트륨 보로하이드라이드(NaBH4)의600μL을 혼합하여 AuNR 파종 솔루션을 준비한다.
  2. 100mM CTAB의 40mL, 10mM HAuCl4의1.7mL, 은 질산250μL(AgNO3),17.6 mg/mL 아스코르브산270 μL을 튜브에 혼합하여 성장 용액을 준비한다.
  3. 종자 용액 420 μL을 1분 동안 1200rpm의 성장 용액과 적극적으로 혼합합니다. 그런 다음 혼합물을 방해받지 않고 16 시간 동안 반응하게하십시오.
  4. 혼합물에서 10분 동안 8000 × g에서 원심분리하여 혼합물에서 과도한 시약을 제거하고 상퍼를 폐기하십시오.

9. 솔리만, M.G., 외9에 의해 AuNRs의 소수성

  1. 합성 된 CTAB 안정화 AuNRs의 1.5 mL의 pH를 1 mMM 나트륨 수산화 (NaOH)를 사용하여 10으로 조정하십시오.
  2. 0.1mM00m 메틸화 PEG(mPEG) 티올을 밤새 400rpm에 저어주세요.
  3. PEGylated AuNRs와 0.4 M 도데딜라민 (DDA)을 클로로폼에 4 일 동안 500 rpm에 섞는다.
  4. 소수성 AuNR을 포함하는 상단 유기 층을 피펫하고 나중에 사용할 때까지 4 °C에 저장합니다.

10. 폴리버블의 NIR 활성화

  1. 폴리머(PLGADA 또는 PCL/PCLTA) 용액을 1:9(vol/vol)에 소수성 AuNR과 혼합합니다.
  2. 0.005:1 (vol/vol)에 폴리머-AuNR 혼합물에 광신도를 추가합니다.
  3. 폴리머-AuNR 혼합물을 0.92mL 유리 유리 바이알에 10% CMC(wt/vol)로 주입하여 폴리버블을 형성한다(2단계 참조).
  4. 2W/cm2에서60s의 254 nm 파장에서 폴리버블을 치료한다.
  5. 30s용 액체 질소에 플래시동결하고 0.010 mBar 진공 및 -85°C에서 하룻밤 동안 lyophilize합니다.
  6. 세척을 사용하여 말린 폴리 버블을 분리하고 DI 물로 세척하여 잔류 CMC를 제거하십시오.
  7. 37°C에서 PBS의 400 μL에서 폴리버블을 배양한다.
  8. 매주 월요일, 수요일, 금요일 에 8A에서 801 nm NIR 레이저를 사용하여 폴리 버블을 활성화합니다.
  9. 레이저 활성화 전후의 폴리버블의 미래 지향적 적외선(FLIR) 이미지를 가져와 온도 값을 얻습니다.
  10. FLIR 이미지의 온도 값에 따라 레이저 활성화 전후의 온도 차이를 계산합니다.

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Representative Results

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폴리버블은 SEM과 NAA를 사용하여 광범위하게 특징지어졌습니다. 화물은 성공적으로 지연 된 버스트 릴리스의 결과로 중심이되었다. 폴리버블은 또한 폴리버블 내에 AuNRs가 존재하기 때문에 성공적으로 레이저 활성화되었다.

폴리버블 특성화
CMC 없이 수성 용액에 주입된 다발포기는 유리 바이알의 바닥과의 접촉으로 인해 평평한 폴리버블(도1A, B)을초래하였다. 부분 평탄화는 DI 수분 대신 5% CMC 기반 수성 용액을 사용했을 때 관찰되었다(도1C). 이어서, 유리 바이알내의 10% CMC 기반 수성 용액은 용액에서 폴리버블이 일시 중단되어 폴리버블의 구형유지(도1D)의성공적인 유지를 초래하였다.Figure 1

화물 센터링
CMC가 없는 경우 폴리버블에 화물을 주입하여 폴리버블 내에서 화물을 보유하지 않는누출(도 3). 이러한 과제에 대응하기 위해, PCLTA의 점도가 성공적으로 증가하여 PCL 트리올을 삼각형(그림 2)으로 엔드캡핑한 후 격리된K2CO3를 사용하여 성공적으로 증가하였다(도2),및 2) 화물의 점도는 5% CMC(그림3, 도 4)로화물을 혼합한 후 성공적으로 증가하였다. PLGADA 폴리버블의 점도는 화물의 중심을 용이하게하기에 충분하여K2CO3을사용하여 변조되지 않았다.

항원 기능성
HIV gp120/41 항원은 폴리버블에 주입하기 전에 트레할로오스와 혼합하였다(도5). 트레할로오스유무드항원(기능성이라고 함)에 대한 항체의 결합 효율은 통계적으로 유의한 차이가 없는 것으로 관찰되었다.

레이저 활성화 없이 릴리스 연구
지연된 버스트 방출은 37°C(도6A)및 50°C(도Figure 6Figure 66B)에서배양된 폴리버블에 대해 19일과 5일에 중간에 아크리플라빈을 가진 PLGADA 폴리버블에서 각각 관찰되었다. 지연된 버스트 방출은 또한 50°C(도7A)및 70°C(도Figure 77B)에서배양된 폴리버블에 대해Figure 7160일 및 60일 동안 중간에 아크리플라빈을 가진 PCL/PCLTA 폴리버블에서 각각 관찰되었다. 이러한 방출 연구는 레이저 활성 가능한 AuNRs의 부재에서 수행되었다.

폴리 버블의 체외 레이저 활성화
쉘에 AuNRs를 장착한 폴리버블은 PLGADA 폴리버블(도Figure 88A)및 PCL/PCLTA 폴리버블(도8B)에서여러 번 레이저를 성공적으로 활성화하였다.Figure 8 레이저 활성화 전후의 온도 변화는 각각 쉘에서 AuNR 농도가 높고 낮은 PCL/PCLTA 폴리버블에서 10± 1°C 및 5 ± 1°C였다. 레이저 활성화 전후에 관찰된 온도 변화는 각각 쉘내의 AuNR 농도가 높고 낮은 PLGADA 폴리버블에서 11± 2°C 및 6± 1°C였다.

Figure 1
그림 1: 다각형의 구형 유지. SEM 이미지(A)14 kDa PCL/300 Da PCLTA는 유리 유리 병의 바닥과 폴리 버블의 접촉으로 인해 폴리 버블을 평평하게; (B)14 kDa PCL/300 Da PCLTA 폴리버블은 유리 바닥과 접촉하지 않은 상부로부터; (C)DI 수액에 비해 5% CMC 용액으로 주입될 때 평탄화의 낮은 정도를 가진 PCL/PCLTA 폴리버블은 유리병과의 접촉 지점에서 반구와 같은 형상의 형성을 일으킨다. (D)10% CMC 용액에 주입할 때 유리 바이알의 바닥에 도달하지 않은 폴리버블은 구형 모양을 유지할 수 있도록 한다. 표시된 모든 스케일 바는 500 μm입니다. 이 그림은 Lee 외7에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: PCLTA 점도의 변조. K22CO3의 농도는 PCLTA에서 0에서 80 mg/mL로 증가하였고, 동적인 점도는K2CO3의농도에 비례하여 증가하는 것으로 관찰되었다. 이 그림은 아룬 쿠마르 외10에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: CMC 유무에 관계없이 폴리버블에 화물 을 주입합니다. 상단 패널은 CMC가없는 주입 중에화물 누출 비디오에서 추출 된 프레임을 보여줍니다. 하단 패널은 5% CMC가 있는 폴리버블 내의 화물 보존 비디오에서 추출된 프레임을 보여줍니다. 이 그림은 Lee 외7에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4: 중앙화물. (A)중심화물을 가진 PCL/PCLTA 폴리버블의 형광 현미경 이미지,(B)PCL/PCLTA 폴리버블쉘에 화물을 장착하고 비형광염염을 중심으로 한다. 이 그림은 아룬 쿠마르 외10에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 5
그림 5: 트레할로오스를 가진 항원 기능. 폴리버블 내의 트레할로오스 유무에 관계없이 HIV gp120/41의 기능을 ELISA를 사용하여 분석되었다. 단백질에 대한 항체의 결합 효율은 일반적으로 단백질의 기능에 대한 지표로 간주됩니다. 본 연구에서 항원의 기능에 대해 논의할 때, 우리는 관심 있는 단백질을 결합하는 항체를 돕습니다 (단백질 기능에 대한 지표입니다). 두 그룹 간에 통계적 유의가 관찰되지 않았다. 신뢰 구간은 솔리드 및 점선으로 표시됩니다. 이 그림은 Lee 외7에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 6
그림 6: PLGADA 폴리버블에서 지연된 버스트 릴리스.. 중간(A)37 °C,(B)50 °C에서 acriflavine을 가진 PLGADA 폴리 버블에서 지연 된 버스트 방출을 보여주는 릴리스 연구. 단선은 데이터 점을 기반으로 얻은 장착 곡선을 나타냅니다. 이 그림은 아룬 쿠마르 외10에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 7
그림 7: PCL/PCLTA 폴리버블에서 지연된 버스트 릴리스.. 중간(A)50 °C,(B)70 °C에서 acriflavine을 가진 PCL/PCLTA 폴리 버블에서 지연 된 버스트 방출을 보여주는 릴리스 연구.  이 그림은 아룬 쿠마르 외10에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 8
그림 8: 폴리버블의 NIR 레이저 활성화. (A)PLGADA 폴리버블,(B)PCL/PCLTA 폴리버블에서 NIR 레이저 활성화 전후에 관찰된 온도 변화는 폴리머 쉘에서 AuNRs의 농도가 높고 낮은 것이다. 이러한 온도 상승은 화물의 조기 방출로 이어지는 중합체 분해를 잠재적으로 신속하게 촉진하기 위해 활용될 수 있습니다. 이 그림은 아룬 쿠마르 외10에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

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현재 기술 및 과제
에멀젼 계 마이크로 및 나노 입자는 일반적으로 약물 전달 캐리어로 사용되어 왔다. 이러한 장치에서 화물의 방출 역학은 광범위하게 연구되었지만, 버스트 방출 역학을 제어하는 것은 주요 도전이었다11. 화물의 다기능성과 기능은 또한 과도한 수성 및 유기 용매에 대한 화물의 노출로 인해 에멀젼 기반 시스템에서 제한됩니다. 단백질 기반화물은 종종 화물 성하 및 응집가능성(12)으로인해 마이크로 및 나노 입자와 호환되지 않습니다. 화물 안정성 외에도 화물 역학은 혈청 변환으로 이어지는 부스터 샷의 필요성 때문에 백신의 맥락에서 특히 중요합니다. 단일 주입 백신 시스템의 개념이 수십 년 동안 주변에 있었고 아직 임상적으로 번역되지 않았기 때문에 백신 전달에서 이러한 과제를 해결하기위한 이전의 노력은 충분히 성공하지 못했습니다.

당사의 폴리버블 백신 전달 플랫폼은 노출된 화물 량을 최소화하여 유기 용매에 대한 화물의 노출증가로 문제를 극복할 수 있습니다. 이 기술은 잠재적으로 적어도 두 개의화물 칸을 수용 할 수 있습니다 : 쉘의 화물과 중앙의화물. 중앙화물을 가진 폴리 버블은 작은 분자 및 항원을 포함하여 다른 화물 모형에 호환되는 동안 화물의 버스트 방출을 통제하기 위하여 이용될 수 있습니다. 이 연구에서는 폴리머 캐리어및 아크리플라빈(소분자)이 지연된 버스트 방출을 입증하기 위해 다양한 분해 시간, PLGADA(더 짧은 분해 시간) 및 PCL/PCLTA(더 긴 분해 시간)를 가진 폴리에스테르를 사용했습니다. 다음 섹션에서는 지연된 버스트 릴리스와 NIR 활성화, 특히 향후 주문형 배달 응용 프로그램의 경우 모두 사용할 수 있는 폴리버블을 형성하는 중요한 단계를 설명합니다.

폴리버블 내화물 센터링
화물 센터는 폴리버블의 제형 동안 발생한 중요한 과제 중 하나였다. 주입 직후 화물이 표면으로 이동하고 화물 주머니는 수성 10 % CMC 솔루션으로 파열하지 않고 안정화될 것입니다. 이러한 오프 중심화물을 가진 폴리 버블은 화물을 둘러싼 중합체의 부균일하지 않은 두께로 인해 조기 방출될 수 있습니다. 따라서 폴리머와 화물의 점도를 조절하는 것은 화물 센터링과 관련된 문제를 해결하는 데 매우 중요했습니다. 화물 용액을 5% CMC로 혼합하여 화물의 점도가 증가했습니다. 중합체의 점도를 높이기 위해 중합체의 분자량이 변형되었을 수 있습니다. 그러나 분자량이 증가하면 종종 고분자 분해속도가 느려지므로 화물 방출이 더 지연됩니다. 따라서 중합체의 점도는 폴리머의 농도를 증가시킴으로써 변형되었다. 높은 농도 (1000 mg/mL) PLGADA의 점도를 증가 시키기에 충분 했다. 그러나, PCL/PCLTA의 점도는 중간에 화물을 유지하기에 적합하지 않았다. 따라서, PCLTA의 엔드캡핑 반응 후 격리된K2CO3는 PCLTA의 점도를 증가시키는 데 사용되었다.

신규 지연 릴리스
지연된 버스트 방출은 중앙화물을 이용한 폴리버블을 사용하여 실시된 방출 연구에서 관찰되었다. 소분자(acriflavine)는 방출 프로파일을 연구하기 위해 폴리버블내의 중심화물로 사용되었다. 고유 방출 프로파일은 폴리머의 분해 시간의 차이로 인해 사용되는 폴리에스테르에 기초하여 관찰되었다. 버스트 방출은 PCL/PCLTA 폴리버블에 비해 PLGADA 폴리버블에서 초기에 관찰되었다. PLGA가 PCL13에비해 빠르게 저하되기 때문에 PLGADA 폴리버블에서 초기 화물 방출이 관찰되었습니다. 두 가지 유형의 폴리에스테르로 방출 역학을 성공적으로 개조한 후, 우리는 폴리버블을 설계하여 화물의 주문형 방출을 가능하게 하고 싶었습니다.

폴리 버블의 NIR 활성화
환자의 요구에 따라 화물의 온디맨드 방출은 현재 의 납품 전략을 사용하여 달성하기 가어려웠습니다(14). 우리는 NIR-민감한(즉, 테라노스-enableing) 제제의 사용을 통해 폴리머 분해를 가속화함으로써 주문형화물 방출을 신속히 할 수 있다고 가설했습니다. AuNRs는 피부를 통해 몇 센티미터를 여행 할 수있는 NIR 레이저를 사용하여 활성화 할 수있는 능력에 대해 광범위하게 연구되었습니다15. CTAB 안정화 된 AuNRs는 따라서 키틀러, S, 외.에 의해 프로토콜에 기초하여 제조되었고 솔리몬, M.G., 외에 의해 발표 된 방법에 따라 소수성화되었다. 쉘에 소수성 AuN을 가진 폴리 버블은 온도 변화를 관찰하기 위해 5 분 동안 원하는 시점에서 NIR 레이저로 조사되었다. 레이저 전후의 온도는 FLIR 이미지를 기반으로 측정되었다. 경화 폴리머 쉘은 레이저 활성화 중에 AuNRs의 모양을 보존하여 다발성 기포의 여러 NIR 활성화를 가능하게 했습니다. 이전 문헌에서, AuNRs는 종종 레이저 활성화16으로인해 로드 와 같은 모양 (NIR 활성화에 대한 결정적)을 잃는 것으로 알려져 있기 때문에 흥미로운 관찰이다. AuNR을 사용하여 폴리버블을 성공적으로 레이저로 활성화하면 차세대 폴리버블에서 화물의 주문형 방출을 제어할 수 있는 길을 열 수 있습니다.

중요하고 미래의 응용 프로그램
이 연구 결과에서 얻은 결과는 이렇게 폴리 버블이 새로운 백신 전달 플랫폼으로 사용될 가능성이 있음을 보여줍니다. 이 논문에 설명된 폴리버블의 준비는 다른 연구자들이 다른 치료 응용 을 위한 전달 플랫폼으로 폴리버블을 사용할 수 있게 합니다. 예를 들어, 백신 전달 이외에, 폴리버블은 잠재적으로 다양한 방출 운동과 시너지 치료제를 전달하는 데 사용될 수 있다. 또한 폴리 버블은 생분해성이 있는 폴리에스테르로 만들어졌으며 많은 FDA 승인 의료 기기에서 사용되어 왔습니다. 우리는 또한 폴리 버블에서 방출 된 염소가 EPA17에의해 권장되는 안전 수준 내에 있음을 보여줌으로써 폴리 버블의 안전여부를 검증했다. 따라서, 우리의 새로운, 주 사용, UV 치료 폴리 버블 플랫폼은 다양한화물 유형에 대한 안전하고 효과적인 약물 전달 플랫폼으로 사용될 수있는 잠재력을 가지고.

이 기술의 한계
폴리버블 플랫폼 기술은 잠재적으로 제어 방출을 가능하게 하는 백신 전달 플랫폼으로 사용될 수 있습니다. 우리의 연구는 항원 및 소분자를 포함하여 다른 화물 모형을 전달할 수 있는 이 플랫폼의 다양성을 강조합니다. 그러나 이 기술의 현재 한계 중 하나는 화물이 현재 수동으로 주입되고 있다는 것입니다. 스케일링을 위해 현재 폴리버블 내화물의 주입(예: 어레이)을 가능하게 하는 자동화된 플랫폼을 엔지니어링하고 있으며, 이 기술의 번역가능성에 대한 우려를 완화하는 데 도움이 될 것입니다.

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Disclosures

저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgments

우리는 중성자 활성화 분석 (NAA)를 도운 TAMU의 화학 부 내의 원소 분석 실험실과 제휴 한 브라이언 E. 톰린 박사에게 감사드립니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-Step Ultra Tetramethylbezidine (TMB)-Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) Substrate Solution Thermo scientific 34028
2-Hydroxy-2-methylpropiophenone TCI AMERICA H0991
450 nm Stop Solution for TMB Substrate Abcam ab17152
Acryloyl chloride Sigma Aldrich A24109-100G
Acriflavine Chem-Impex International 22916
Anhydrous ethyl ether Fisher Chemical E138-500
Anti-HIV1 gp120 antibody conjugated to horseradish peroxidase (HRP)
Bovine serum albumin (BSA) Fisher BioReagents BP9700100
BSA-CF488 dye conjugates Invitrogen A13100
Bromosalicylic acid Acros Organics AC162142500
Carboxymethylcellulose (CMC) Millipore Sigma 80502-040
Centrimonium bromide (CTAB) MP Biomedicals ICN19400480
Chloroform Fisher Chemical C2984
Coating buffer Abcam ab210899
Dichloromethane (DCM) Sigma Aldrich 270997-1L
Diethyl ether Fisher Chemical E1384
Dodeacyl Amine Acros Organics AC117665000
Doxorubicin hydrochloride Fisher BioReagents BP251610
L-ascorbic acid Acros Organics A61 100
Legato 100 Syringe Pump KD Scientific 14 831 212
mPEG thiol Laysan Bio NC0702454
Nonfat dry milk Andwin Scientific NC9022655
Potassium carbonate Acros Organics AC424081000
Phosphate saline buffer Fisher BioReagents BP3991
(Poly(caprolactone) Sigma Aldrich 440744-250G
(Poly(caprolactone) triol Acros Organics AC190730250
Poly (lactic-co-glycolic acid) diacrylate CMTec 280050
Potassium carbonate Acros Organics AC424081000
Recombinant HIV1 gp120 + gp41 protein Abcam ab49054
Silver nitrate Acros Organics S181 25
Sodium borohydride Fisher Chemical S678 10
Tetrachloroauric acid Fisher Chemical G54 1
Trehalose Acros Organics NC9022655
Triethyl amine Acros Organics AC157910010

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References

  1. World Health Organization. Global Immunization: Worldwide Disease Incidence. Children's Hospital of Philadelphia. https://www.chop.edu/centers-programs/vaccine-education-center/global-immunization/diseases-and-vaccines-world-view (2018).
  2. Paul, A., Bera, M., Gupta, P., Singh, N. D. P. o-Hydroxycinnamate for sequential photouncaging of two different functional groups and its application in releasing cosmeceuticals. Organic and Biomolecular Chemistry. 17, (33), 7689-7693 (2019).
  3. Kumari, A., Yadav, S. K., Yadav, S. C. Biodegradable polymeric nanoparticles based drug delivery systems. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 75, (1), 1-18 (2010).
  4. Dai, C., Wang, B., Zhao, H. Microencapsulation peptide and protein drugs delivery system. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 41, (2-3), 117-120 (2005).
  5. Souery, W. N., et al. Controlling and quantifying the stability of amino acid-based cargo within polymeric delivery systems. Journal of Control Release. 300, 102-113 (2019).
  6. Wang, W. Advanced protein formulations. Protein Science. 24, (7), 1031-1039 (2015).
  7. Lee, J., et al. An ultraviolet-curable, core-shell vaccine formed via phase separation. Journal of Biomedical Materials Research Part A. (2019).
  8. Kittler, S., Hickey, S. G., Wolff, T., Eychmüller, A. Easy and Fast Phase Transfer of CTAB Stabilised Gold Nanoparticles from Water to Organic Phase. Zeitschrift für Physikalische Chemie. 229, 235 (2015).
  9. Soliman, M. G., Pelaz, B., Parak, W. J., del Pino, P. Phase Transfer and Polymer Coating Methods toward Improving the Stability of Metallic Nanoparticles for Biological Applications. Chemistry of Materials. 27, (3), 990-997 (2015).
  10. Arun Kumar, S., Good, J., Hendrix, D., Yoo, E., Kim, D., Deo, K. A., Jhan, Y. Y., Gaharwar, A. K., Bishop, C. J. Nanoengineered Light-Activatable Polybubbles for On?Demand Therapeutic Delivery. Adv. Funct. Mater. 2003579 (2020).
  11. Wuthrich, P., Ng, S. Y., Fritzinger, B. K., Roskos, K. V., Heller, J. Pulsatile and delayed release of lysozyme from ointment-like poly(ortho esters). Journal of Controlled Release. 21, (1), 191-200 (1992).
  12. Wang, W. Instability, stabilization, and formulation of liquid protein pharmaceuticals. International Journal of Pharmaceutics. 185, (2), 129-188 (1999).
  13. Wong, D. Y., Hollister, S. J., Krebsbach, P. H., Nosrat, C. Poly(epsilon-caprolactone) and poly (L-lactic-co-glycolic acid) degradable polymer sponges attenuate astrocyte response and lesion growth in acute traumatic brain injury. Tissue Engineering. 13, (10), 2515-2523 (2007).
  14. Davoodi, P., et al. Drug delivery systems for programmed and on-demand release. Advanced Drug Delivery Reviews. 132, 104-138 (2018).
  15. Huang, Y. C., Lei, K. F., Liaw, J. W., Tsai, S. W. The influence of laser intensity activated plasmonic gold nanoparticle-generated photothermal effects on cellular morphology and viability: a real-time, long-term tracking and monitoring system. Photochemical and Photobiological Sciences. 18, (6), 1419-1429 (2019).
  16. Link, S., Burda, C., Nikoobakht, B., El-Sayed, M. A. Laser-Induced Shape Changes of Colloidal Gold Nanorods Using Femtosecond and Nanosecond Laser Pulses. The Journal of Physical Chemistry B. 104, (26), 6152-6163 (2000).
  17. U.S. Environmental Protection Agency. Chlorine. https://www.epa.gov/sites/production/files/2016-09/documents/chlorine.pdf (2000).
근적외선 민감성 코어 쉘 백신 전달 플랫폼 생산
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Arun Kumar, S., Lee, J., Bishop, C. J. Production of Near-Infrared Sensitive, Core-Shell Vaccine Delivery Platform. J. Vis. Exp. (164), e60569, doi:10.3791/60569 (2020).More

Arun Kumar, S., Lee, J., Bishop, C. J. Production of Near-Infrared Sensitive, Core-Shell Vaccine Delivery Platform. J. Vis. Exp. (164), e60569, doi:10.3791/60569 (2020).

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