We presenteren een robuust, overdraagbaar en voorspellend in vitro blootstellingssysteem voor de screening en monitoring van deeltjes in de lucht met betrekking tot hun acute longcytotoxiciteit door gecultiveerde menselijke longcellen bloot te stellen op de lucht-vloeibare interface (ALI).
Hier presenteren we een speciaal ontworpen modulair in vitro blootstellingssysteem dat de homogene blootstelling van gecultiveerde menselijke longcellen in de ALI aan gassen, deeltjes of complexe atmosferen (bijv. sigarettenrook) mogelijk maakt, waardoor realistische fysiologische blootstelling van het apicale oppervlak van het menselijk alveolargebied aan lucht. In tegenstelling tot sequentiële blootstellingsmodellen met lineaire aerosolgeleiding voldoet het modulaire ontwerp van het radiale stroomsysteem aan alle eisen voor de continue opwekking en het transport van de testatmosfeer naar de cellen, een homogene verdeling en afzetting van de deeltjes en de continue verwijdering van de atmosfeer. Deze blootstellingsmethode is voornamelijk ontworpen voor de blootstelling van cellen aan deeltjes in de lucht, maar kan worden aangepast aan de blootstelling van vloeibare aerosolen en zeer giftige en agressieve gassen, afhankelijk van de methode voor het genereren van aerosolen en het materiaal van de blootstellingsmodules .
In het kader van een recent afgerond validatieonderzoek werd dit blootstellingssysteem bewezen als een overdraagbare, reproduceerbare en voorspellende screeningsmethode voor de kwalitatieve beoordeling van de acute longcytotoxiciteit van deeltjes in de lucht, mogelijk dierproeven verminderen of vervangen die normaal gesproken deze toxicologische beoordeling zouden opleveren.
Het inademen van giftige deeltjes in de lucht is een zorg voor de volksgezondheid, wat leidt tot een veelheid aan gezondheidsrisico’s wereldwijd en vele miljoenen sterfgevallen per jaar1,2. De klimaatverandering, de aanhoudende industriële ontwikkeling en de stijgende vraag naar energie-, landbouw- en consumentenproducten hebben de afgelopen jaren bijgedragen tot de toename van longziekten3,4,5,6. Kennis en evaluatie van inhaleerbare stoffen met betrekking tot hun acute inhalatietoxiciteit vormen de basis voor risicobeoordeling en risicobeheer, maar deze informatie ontbreekt nog steeds voor een breed scala van deze stoffen7,8. Sinds 2006 vereist de EU-chemische wetgeving REACH (Registratie, Evaluatie, Autorisatie en Beperking van chemische stoffen) dat reeds bestaande en nieuw geïntroduceerde producten een toxicologische karakterisering ondergaan, inclusief de inademingsroute voordat ze in de handel worden gebracht. Daarom richt REACH zich op alternatieve en diervrije methoden, de toepassing van het “3R”-principe (vervanging, verfijning en vermindering van dierproeven) en het gebruik van geschikte in vitro modellen9. In de afgelopen jaren zijn veel verschillende en adequate niet-dierlijke inhalatietoxiciteitstestmodellen ontwikkeld (bijvoorbeeld in vitro celculturen, long-op-a-chipmodellen, precisiegesneden longschijfjes(PCLS)) om de acute inhalatietoxiciteit van deeltjes in de lucht 5,7,10,11te beoordelen. In termen van in vitro celkweekmodellen kunnen gekweekte cellen onder ondergedompelde omstandigheden of aan de ALI (figuur 1) worden blootgesteld. De validiteit van onderzoeken naar blootstelling onder water is echter beperkt met betrekking tot de beoordeling van de toxiciteit van verbindingen in de lucht, met name deeltjes. Blootstellingstechnieken onder water komen niet overeen met de situatie van mens in vivo; het celkweekmedium dat de cellen bedekt, kan de fysisch-chemische eigenschappen en dus de toxische eigenschappen van een teststof12,13beïnvloeden. ALI in vitro inademingsmodellen maken de directe blootstelling van cellen aan de teststoffen zonder interferentie van het celkweekmedium met testdeeltjes mogelijk, waardoor menselijke blootstelling met een hogere fysiologische en biologische gelijkenis wordt nagebootst dan ondergedompelde blootstellingen12,14.
Voor regelgevingsprocessen zoals REACH zijn echter alleen diermodellen beschikbaar op het gebied van acute inhalatietoxicologie, aangezien geen enkele alternatieve in vitro methoden voldoende zijn gevalideerd en tot nu toe officieel zijn aanvaard14. Daartoe moeten testmodellen worden gevalideerd volgens de eisen van het referentielaboratorium van de Europese Unie voor alternatieven voor dierproeven (EURL-ECVAM) beginselen inzake testvalide15.
Een voormalige pre-validatie studie en een onlangs afgeronde validatie studie met succes aangetoond dat de toepassing gebied van de CULTEX RFS blootstelling systeem en de overdraagbaarheid, stabiliteit, en reproduceerbaarheid13. Dit blootstellingssysteem is een in vitro celgebaseerd blootstellingssysteem dat homogene blootstelling van cellen aan gassen, deeltjes of complexe atmosferen (b.v., sigaretrook) bij ALI toe te schrijven aan zijn radiaal aërosoldistributieconcept en de geleiding van de testaerosol in een ononderbroken stroom over de cellen16mogelijk maakt. De basismodule van dit radiale stroomsysteem bestaat uit de inlaatadapter, de spuitbusgeleidingsmodule met een radiale aerosolverdeling, de bemonsterings- en socketmodule en een vergrendelingsmodule met een handwiel (figuur 2). De gegenereerde deeltjes bereiken de cellen via de inlaatadapter en de aerosolgeleidingsmodule en worden afgezet op de wisselplaten van de celkweek, die zich bevinden in de drie radiaal gerangschikte blootstellingskamers van de bemonsteringsmodule. De spuitbusgeleidingsmodule en de bemonsteringsmodule kunnen worden verwarmd door verbinding te maken met een extern waterbad17.
In het kader van beide studies werden A549-cellen gebruikt voor alle blootstellingsexperimenten. De cellijn A549 is een menselijke vereeuwigde epitheliale cellijn die zeer goed wordt gekenmerkt en is gebruikt als een in vitro model voor type II alveolar epitheelcellen in tal van toxicologische studies. De cellen worden gekenmerkt door lamellenlichamen, de productie van oppervlakteactieve stof en een aantal ontstekingsrelevante factoren18. Ze tonen ook eigenschappen van bronchiale epitheelcellen als gevolg van hun slijmproductie19. Bovendien kunnen ze worden gekweekt op de ALI. Hoewel deze cellijn tekort is aan het bouwen van celcelcontacten, is de teelt van deze cellen veel handiger, goedkoper en zijn de daaruit verkregen resultaten donoronafhankelijk in vergelijking met primaire cellen20.
A549 cellen werden gezaaid in 6-put cel kweek inserts (PET membraan, 4,67 cm2, porie grootte 0,4 mm) met een dichtheid van 3,0 x 105 cellen per insert en gekweekt voor 24 uur onder ondergedompelde omstandigheden. Cellen werden vervolgens blootgesteld in drie onafhankelijke laboratoria aan schone lucht en drie verschillende blootstellingsdoses (25, 50 en 100 μg/cm2)van 20 teststoffen in de ALI. De blootstellingsdosis is gecorreleerd aan de afzettingstijd die resulteert in een constante deeltjessnelheid van 25 μg/cm2, 50 μg/cm2 en 100 μg/cm2 op de cellen na respectievelijk 15, 30 of 60 min. De gedeponeerde deeltjes werden echter niet afgewassen na afzetting, maar bleven 24 uur op de cellen. De depositietijden van de deeltjes waren daarom 15, 30 en 60 min, maar de blootstelling van de cellen duurde in totaal 24 uur. De depositiesnelheid van de teststoffen werd bepaald in voorlopige experimenten volgens eerdere methoden17.
De levensvatbaarheid van cellen als indicator van toxiciteit werd 24 uur na deeltjesdepositie beoordeeld met behulp van een cellevensvatbaarheidstest. Bijzondere aandacht werd besteed aan de kwaliteit van schone luchtcontroles, de optimalisatie en verfijning van het blootstellingsprotocol, de reproduceerbaarheid binnen- en interlaboratorium en de invoering van een voorspellingsmodel (PM). Stoffen die hebben geleid tot een afname van de levensvatbaarheid van cellen onder de 50% (PM 50%) of 75% (PM 75%) bij een van de drie blootstellingsdoses werden beschouwd als een acuut inademingsgevaar. De resultaten werden vervolgens vergeleken met bestaande in vivo gegevens (op basis van ten minste één betrouwbare studie volgens de OESO-testrichtlijn (TG) 403 of TG 43621,22), wat leidde tot een algemene overeenstemming van 85%, met een specificiteit van 83% en een gevoeligheid van 88%23.
Naast de meting van de levensvatbaarheid van de cel kunnen andere eindpunten zoals cytokinerelease, onderzoek van het cellysaat of membraanintegriteit via LDH-test worden beoordeeld, maar waren niet vereist voor het validatieonderzoek. Zo werd het blootstellingssysteem (bijvoorbeeld CULTEX RFS) bewezen als een voorspellend screeningsysteem voor de kwalitatieve beoordeling van de acute inhalatietoxiciteit van de geteste deeltjes in de lucht, wat een veelbelovende alternatieve methode voor dierproeven vertegenwoordigt. Het volgende protocol wordt aanbevolen voor blootstellingsexperimenten aan deeltjes in de lucht die dit blootstellingssysteem gebruiken.
De afgelopen jaren zijn veel niet-dierinhalatietestmodellen ontwikkeld om informatie te verkrijgen over het acute inademingsgevaar van inhaleerbare deeltjes en om dierproeven te verminderen en te vervangen volgens het 3R-principe25.
In termen van celkweekmodellen kan blootstelling van cellen worden gedaan onder ondergedompelde omstandigheden of bij de ALI. Het blootstellen van cellen onder ondergedompelde omstandigheden kan de fysisch-chemische eigenschappen en dus de t…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door het Duitse federale ministerie van Onderwijs en Onderzoek (Bundesministerium für Bildung und Forschung, BMBF, Duitsland (Grant 031A581, subproject A-D)) en door de Duitse Research Foundation (Deutsche Forschungsgesellschaft, DFG, Research Training Group GRK 2338).
Cells | |||
A549 | ATCC | CCL-185 | |
Cell culture medium and supplies | |||
DMEM | Biochrom, Berlin, Germany | FG 0415 | used as growth medium |
DMEM | Gibco-Invitrogen, Darmstadt, Germany | 22320 | used as exposure medium |
FBS superior | Biochrom, Berlin, Germany | S 0615 | |
Gentamycin (10mg/mL) | Biochrom, Berlin, Germany | A 2710 | |
HEPES 1M | Th. Geyer, Renningen, Germany | L 0180 | |
PBS | Biochrom, Berlin, Germany | L 1825 | |
Trypsin/EDTA (0.05%/0.02%) | Biochrom, Berlin, Germany | L 2143 | |
Cell culture material | |||
CASY Cups | Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Germany | REF 05651794 | |
Cell culture plates | Corning, Wiesbaden, Germany | 3516 | 6-well plates |
Corning Transwell cell culture inserts | Corning, Wiesbaden, Germany | 3450 | 24mm inserts; 6-well plates; 0.4 µm |
Chemicals | |||
CASYton | Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Germany | REF 05651808001 | |
Compressed Air (DIN EN 12021) | Linde Gas Therapeutics GmbH, Oberschleißheim, Germany | 2290152 | |
WST-1 | Abcam, Cambridge, United Kingdom | ab155902 | |
Instruments + equipment | |||
CASY Cell Counter | Schärfe System GmbH, Reutlingen, Germany | ||
Circulation thermostat | LAUDA, Lauda-Königshofen, Germany | Ecoline RE 100 | |
CULTEX HyP – Hydraulic Press | Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany | ||
CULTEX insert sleeve | Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany | ||
CULTEX RFS – Radial Flow System Type 2 (module for particle exposure) | Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany | ||
CULTEX RFS – Radial Flow System Type 2 (module for clean air exposure) | Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany | ||
CULTEX supply | |||
Flow controller 0-30 ml/min (IQ-Flow) | Bronkhorst Deutschland Nord GmbH | ||
Flow controller 0-1,5 l/min (EL-Flow) | Bronkhorst Deutschland Nord GmbH | ||
Filters (large) | Munktell & Filtrak GmbH, Sachsen, Germany | LP-050 | Munktell Sterile Filter; Particle retention efficiency > 99,999% |
Filters (small) | Parker Hannifin Corporation, Mainz, Germany | 9933-05-DQ | Balston disposable filter |
Medium pump | Cole-Parmer GmbH, Wertheim, Germany | Ismatec IPC High Precision Multichannel Dispenser | digital peristaltic pump |
Microplate Reader Infinite M200 Pro | Tecan Deutschland GmbH, Crailsheim, Germany | ||
Vakuum pump | KNF, Freiburg, Germany | N86 KT.18 | |
Vögtlin mass flow controller 0,2-10 l/min | TrigasFI GmbH | Vögtlin red-y compact regulator, Typ-Nr.: GCR-C3SA-BA20 | |
Water Bath | LAUDA, Lauda-Königshofen, Germany | Ecoline Staredition RE 104 |