Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Hava-Sıvı Arabiriminde Ekili İnsan Akciğer Hücrelerinin Açığa Çıkarılması yla Havadaki Partiküllerin Akut İnhalasyon Toksisitesinin Değerlendirilmesi

Published: February 23, 2020 doi: 10.3791/60572
Automatic Translation
1, 2, 3, 2, 5, 3,4, 2, 2, 1, 3,4, 1,2
1Bundeswehr Institute of Pharmacology and Toxicology, 2Walther Straub Institute of Pharmacology and Toxicology, University of Munich, 3Cultex Laboratories GmbH, 4Cultex Technologies GmbH (formerly Cultex Laboratories GmbH), 5seh consulting + services

Summary

Hava-sıvı arabiriminde (ALI) ekili insan akciğer hücrelerini teşhir ederek, akut pulmoner sitotoksisite ile ilgili havapartiküllerinin taranması ve izlenmesi için sağlam, aktarılabilir ve tahmine dayalı bir in vitro maruziyet sistemi salıyoruz.

Abstract

Burada, ALI'de ekili insan akciğer hücrelerinin gazlara, partiküllere veya karmaşık atmosferlere (örn. sigara dumanı) homojen bir şekilde maruz kalmasını sağlayan özel olarak tasarlanmış modüler in vitro maruziyet sistemi sunarak gerçekçi fizyolojik insan alveolar bölgenin apikal yüzeyinin havaya maruz kalma. Lineer aerosol kılavuzlu sıralı pozlama modellerinin aksine, radyal akış sisteminin modüler tasarımı, test atmosferinin hücrelere sürekli üretimi ve taşınması için tüm gereksinimleri karşılar, homojen bir dağılım ve parçacıklar ve atmosferin sürekli kaldırılması. Bu maruz kalma yöntemi öncelikle havadaki parçacıklara hücrelerin maruz kalma için tasarlanmıştır, ancak aerosol üretim yöntemi ve maruziyet modüllerinin malzeme bağlı olarak sıvı aerosoller ve son derece toksik ve agresif gazların maruz kalma adapte edilebilir .

Yakın zamanda tamamlanan bir doğrulama çalışması çerçevesinde, bu maruziyet sistemi, havadaki parçacıkların akut pulmoner sitotoksisitesinin nitel değerlendirmesi için aktarılabilir, tekrarlanabilir ve öngörülebilir bir tarama yöntemi olarak kanıtlanmıştır, böylece normalde bu toksikolojik değerlendirmeyi sağlayacak hayvan deneylerini potansiyel olarak azaltmak veya değiştirmek.

Introduction

Toksik havadan bulaşan parçacıkların solunması bir halk sağlığı sorunudur, dünya çapında sağlık riskleri çok sayıda yol ve ölümler milyonlarca yıllık1,2. İklim değişikliği, devam eden endüstriyel gelişme ve artan enerji talebi, tarım ve tüketici ürünleri son yıllarda akciğer hastalıklarının artmasına katkıda bulunmuştur3,4,5,6. Bilgi ve akut inhalasyon toksisitesi ile ilgili solunabilir maddelerin değerlendirilmesi tehlike değerlendirmesi ve risk yönetimi için temel sağlamak, ancak bu bilgiler hala bu maddelerin geniş bir yelpazede için eksik7,8. 2006 yılından bu yana, AB kimyasal mevzuatı REACH (Kimyasalların Kaydı, Değerlendirilmesi, Yetkilendirilmesi ve Kısıtlanması) mevcut ve yeni tanıtılan ürünlerin piyasaya sürülmeden önce soluma rotası da dahil olmak üzere toksikolojik bir karakterizasyondan geçmesini gerektirmektedir. Bu nedenle REACH, alternatif ve hayvansız yöntemlere, "3R" prensibinin uygulanmasına (Hayvan deneylerinin değiştirilmesi, İncelmesi ve azaltılması) ve uygun in vitro modellerin in vitro modellerinin kullanımına odaklanmaktadır9. Son yıllarda, birçok farklı ve yeterli hayvan dışı inhalasyon toksisite testi modelleri (örneğin, in vitro hücre kültürleri, akciğer-on-a-chip modelleri, hassas kesilmiş akciğer dilimleri (PCLS)) amacıyla hava daki parçacıkların akut inhalasyon toksisitesi değerlendirmek için geliştirilmiştir5,7,10,11. In vitro hücre kültürü modelleri açısından, ekili hücreler batık koşullarda veya ALI'de maruz kalınabilir (Şekil 1). Ancak, batık maruziyet çalışmalarının geçerliliği, özellikle partiküllerin havadaki bileşiklerin toksisitesinin değerlendirilmesi açısından sınırlıdır. Batık maruzkalma teknikleri in vivo durumuna karşılık gelmez; hücreleri kapsayan hücre kültürü orta fiziko-kimyasal özellikleri etkileyebilir ve böylece, bir test maddesinin toksik özellikleri12,13. ALI in vitro inhalasyon modelleri test parçacıkları ile hücre kültürü ortamının müdahalesi olmadan test maddeleri hücrelerin doğrudan maruz kalma sağlar, böylece, batık pozlama daha yüksek fizyolojik ve biyolojik benzerlik ile insan maruziyeti taklit12,14.

REACH gibi düzenleyici işlemler için, ancak, sadece hayvan modelleri akut inhalasyon toksikoloji alanında mevcuttur, hiçbir alternatif in vitro yöntemleri yeterince doğrulanmış ve resmen şimdiye kadar kabul edilmiştir14. Bu amaçla test modellerinin, test geçerliliğine ilişkin Hayvan TestleriNe Alternatifler Için Avrupa Birliği Referans Laboratuvarı (EURL-ECVAM) ilkelerinin gereklerine göre doğrulanması gerekir15.

Eski bir ön doğrulama çalışması ve yakın zamanda tamamlanan bir doğrulama çalışması cultex RFS maruz kalma sisteminin uygulama alanını ve aktarılabilirliğini, stabilitesini ve tekrarlanabilirliğini başarıyla göstermiştir13. Bu maruz kalma sistemi, radyal aerosol dağılım konsepti ve test aerosolünün hücreler üzerinde sürekli bir akış halinde iletimi nedeniyle ALI'de hücrelerin gazlara, partiküllere veya karmaşık atmosferlere (örn. sigara dumanı) homojen bir şekilde maruz kalmasını sağlayan in vitro hücre tabanlı bir maruz kalma sistemidir16. Bu radyal akış sisteminin temel modülü giriş adaptörü, radyal aerosol dağılımına sahip aerosol kılavuz modülü, numune alma ve soket modülü ve el tekerleği ile kilitleme modülünden oluşur (Şekil 2). Oluşturulan parçacıklar giriş adaptörü ve aerosol kılavuz modülü aracılığıyla hücrelere ulaşır ve örnekleme modülünün radyal olarak düzenlenmiş üç pozlama odasında bulunan hücre kültürü kesici uçlarda birikir. Aerosol kılavuz modülü ve örnekleme modülü harici bir su banyosuna bağlanarak ısıtılabilir17.

Her iki çalışma çerçevesinde tüm maruzkalma deneyleri için A549 hücreleri kullanılmıştır. Hücre hattı A549 çok iyi karakterize ve çok sayıda toksikolojik çalışmalarda tip II alveoler epitel hücreleri için bir in vitro model olarak kullanılmıştır bir insan ölümsüzleştirilmiş epitel hücre hattıdır. Hücreler lamellar cisimler ile karakterizedir, sürfaktan üretimi ve inflamasyon ile ilgili faktörlerin bir dizi18. Ayrıca mukus üretimi nedeniyle bronşiyal epitel hücrelerinin özelliklerini göstermek19. Ayrıca, ONLAR ALI kültürlü olabilir. Bu hücre hattı hücre-hücre temasları bina eksik olmasına rağmen, bu hücrelerin ekimi çok daha uygun, daha az maliyet pahalı ve bunların elde edilen sonuçlar birincil hücrelere göre donör bağımsız20.

A549 hücreleri 6 kuyulu hücre kültürü kesici uçlarda (PET membran, 4.67 cm2, gözenek boyutu 0.4 mm) seri başı 3.0 x 105 hücre yoğunluğu ile tohumlanmış ve batık koşullarda 24 saat ekili olarak eklenmiştir. Hücreler daha sonra havayı temizlemek için üç bağımsız laboratuvarda maruz kaldı ve ALI'de 20 test maddesinden üç farklı maruz kalma dozu (25, 50 ve 100 μg/cm2)alındı. Pozlama dozu, sırasıyla 15, 30 veya 60 dakika sonra hücrelere 25 g/cm2,50 μg/cm2 ve 100 g/cm2 sabit partikül oranı ile sonuçlanan biriktirme süresi ile ilişkilidir. Ancak biriken parçacıklar birikmeden sonra yıkanmamış, ancak 24 saat boyunca hücrelerde kalmıştır. Bu nedenle parçacıkların biriktirme süreleri 15, 30 ve 60 dk idi, ancak hücrelerin maruz kalma toplam 24 saat sürdü. Test maddelerinin biriktirme oranı önceki yöntemlere göre ön deneylerdebelirlenmiştir 17.

Toksisitenin bir göstergesi olarak hücre canlılığı, hücre canlılığı tsayı kullanılarak parçacık birikiminden 24 saat sonra değerlendirildi. Temiz hava kontrollerinin kalitesi, maruz kalma protokolünün optimizasyonu ve iyileştirilmesi, laboratuvar içi ve laboratuvarlar arası tekrarlanabilirlik ve bir tahmin modelinin (PM) oluşturulması üzerine özel bir odak noktası kurulmuştur. Hücre canlılığının %50'nin altına düşmesine yol açan maddeler (PM %50) veya %75 (PM %75) herhangi üç maruz kalma dozlarında akut inhalasyon tehlikesi uygulamak için kabul edildi. Sonuçlar daha sonra mevcut in vivo verileri ile karşılaştırıldı (OECD test kılavuzuna göre en az bir güvenilir çalışma dayalı (TG) 403 veya TG 43621,22), genel bir uyum yol 85%, bir özgüllük ile 83% ve 88%23duyarlılık .

Hücre canlılığının ölçülmesinin yanı sıra, sitokin salınımı, ldh tetkik yoluyla hücre lisatının incelenmesi veya membran bütünlüğünün incelenmesi gibi diğer uç noktalar değerlendirilebilir ancak doğrulama çalışması için gerekli değildir. Böylece, maruz kalma sistemi (örneğin, CULTEX RFS) test edilen hava partiküllerinin akut inhalasyon toksisitesinin nitel değerlendirilmesi için bir tahmine dayalı tarama sistemi olarak kanıtlanmıştır, hayvan testleri için umut verici bir alternatif yöntem temsil. Bu pozlama sistemini kullanarak havadaki parçacıklara maruz kalma deneyleri için aşağıdaki protokol önerilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

NOT: Bir pozlama deneyinin protokolü üç günlük bir dönemi kapsar.

1. Gün

1. Genel hazırlıklar ve hücrelerin ekimi

NOT: Maruz kalma deneyleri için insan akciğer adenokarsinomu epitel hücre hattı A549 kullanılmıştır. Hücreler steril koşullarda ele alınmalıdır. ALI'de ekime uygun diğer hücre hatları kullanılabilir.

  1. Büyüme ortamını (Dulbecco'nun Minimum Esansiyel Orta (DMEM), %10 fetal sığır serumu (FBS) ve 5 μg/mL gentamisin ile birlikte (DMEM, 5 μg/mL gentamisin ve 100 mM nihai HEPES konsantrasyonu ile desteklenmiş) hazırlayın.
  2. Kültür A549 hücreleri büyüme ortamında 37 °C'de %5 CO2içeren nemli bir atmosferde .
  3. Hücre kültürü şişesinde hücreleri 75 cm2 (T-75) 14 mL büyüme ortamında, bölmeden önce %80-90'lık bir kesişme (her 2-3 günde bir) ve 35'lik bir geçişe kadar geliştirin.
  4. Süspansiyon hacmini ve gerekli hücre kültürü uçlarının sayısını (kuvöz kontrolleri ve temiz hava ve parçacık maruziyeti için hücre kültürü ekler gibi üç hücre kültürü ekler) ve hücre kültürü plakaları hesaplayın.
  5. Hücrelerin trypsinizasyonu ve tohumlama önce, 6-iyi plaka her kuyuya temperli büyüme orta 2.5 mL ekleyin. Hücre kültürünü, hücre içermeyen eklerin kuyuların içine dikkatlice yerleştirin ve her hücre kültürü eklemesine 1 mL büyüme ortamı ekleyin. 6 kuyulu plakaları en az 30 dakika kuluçka makinesinde (37 °C, %5 CO2)kuluçkaya yatırın.

2. Hücrelerin tripsinizasyonu

  1. Temper fosfat tamponlu salin (PBS) ve büyüme ortamı 37 °C ve tripsin/EDTA (%0.05/ 0.02%) oda sıcaklığında çözelti.
  2. Hücre kültürü ortamını hücre kültürü şişesinden aspire edin ve hücreleri önceden ısıtılmış 8 mL'lik PBS ile dikkatlice yıkayın.
  3. PBS'yi çıkarın, 2 mL tripsin/EDTA ekleyin (%0.05/ 0.02%) hücrelere çözelti ve 37 °C'de kuvözde maksimal 6 dk. için kuluçka. Müfreze işlemini mikroskop altında kontrol edin.
  4. 8 mL önceden ısıtılmış büyüme ortamı ekleyerek tripsin aktivitesini nötralize edin, şişenin yan tarafına hafifçe dokunarak hücreleri ayırın ve tekrar tekrar pipetleme yaparak hücreleri yeniden askıya alın.
  5. Hücre süspansiyonuna 50 mL boru aktarın. Daha fazla işlem için hücre numarasını belirleyin (örn. hücrelerin tohumlanması, hücrelerin geçişi).

3. Hücre sayısının belirlenmesi

NOT: Hücre konsantrasyonu hücre sayacı veya sayma odaları kullanılarak belirlendi.

  1. 10 mL izotonik çözelti ile dolu bir bardakta hücre kültürünün süspansiyonunun 100 μL'sini seyreltin. Sallamadan bardağı yavaşça yatırın.
  2. A549 hücrelerinin hücreye özgü ölçüm parametrelerine göre canlı hücre/mL ve hücre canlılığı sayısını belirleyin.

4. Hücre kültürü ekler mikro gözenekli membranlar üzerine hücrelerin tohumlanması

NOT: Pozlama sistemi, farklı tedarikçilerden ve farklı boyutlardaki ticari kesici uçların kullanımını mümkün kılacak özel adaptörlerle donatılmıştır. Bu pozlama deneyleri için 6 kuyulu plakalar ve buna karşılık gelen hücre kültürü kesici uçlar kullanılmıştır. Tüm çalışma adımları steril koşullarda yapılmalıdır.

  1. Steril hücre kültürü koşulları (laminar akış) altında önceden ısıtılmış büyüme ortamı sağlayın.
  2. Hücre süspansiyonunun yeterince yüksek hacmini 3.0 x 105 hücre/mL'lik bir hücre konsantrasyonu ile hazırlayın.
  3. Plakaları 30 dk yumuşattıktan sonra, hücre kültürü içinde orta aspirasyon ekler ve her hücre kültürü eklemek 3.0 x 105 hücre /mL yoğunluğu ile A549 hücrelerinin 1 mL tohum. Hücre süspansiyonuna hafifçe sallayarak dağıtın.
  4. Hücre kültürünü 24 saat (37 °C ve %5 CO2)için hücre süspansiyonu ile inkübed.

5. Test maddelerinin basıldığında

NOT: Test maddeleri tamamen kontrol edilebilir bir hidrolik pres kullanılarak toz kekiçine bastırıldı. Basın paketi, basın paketinin mevcut yağ basıncı (çubuk) olarak görüntülenen maksimum 18 kN kuvvet uygulayabilir. Bilinmeyen test maddelerinin pres koşulları (presleme basıncı, presleme süresi) ön testlerde belirlenmeli ve karakterize edilmelidir. Bir maddenin pres özelliklerine bağlı olarak farklı presleme parametreleri ve presleme pistonu çeşitleri kullanılabilir.

DİkKAT: Zehirli veya tehlikeli maddeleri bastırırken koruyucu ekipman takın.

  1. Basının ön tarafındaki zaman kontrolü ile basma süresini ayarlayın.
  2. Basınçlı hava vanası ile basınçlı hava beslemesini açın. Basınçlı hava basıncını, presin ön tarafındaki basınç regülatörü veya basınçlı hava beslemesinin basınçlı hava vanası kullanarak yaklaşık 2 bara (ön taraftaki basınç göstergesiyle gösterilir) ayarlayın. Çekmeceyi çekin, Basın düğmesine basın ve dijital basınç düğmesine basma basıncını okuyun.
    1. Basınç çok yüksek veya çok düşükse basınç regülatöründeki basıncı okuyun.
  3. Madde kabını toplayın ve cam silindirin doğru ortalanmasını sağlayın (Ek Şekil 1). Madde kabını az miktarda test maddesi ile doldurun. Dalgıç madde kabına yerleştirin ve tozu konteynerde eşit olarak dağıtmak için hafifçe ileri geri çevirin.
  4. Çekmeceye dalgıç ile madde konteyner yerleştirin ve Basın düğmesine basın. Presin hidrolik pistonu pistonunüzerine hareket eder ve set presleme süresi için test maddesine basınç uygular. Çekmeceyi açın ve pistonu çıkarın.
  5. Madde kabı en az yarısı dolana kadar 5.3 ve 5.4 adımlarını tekrarlayın.
  6. Presleme çalışması tamamlandıktan sonra, çekmeceden madde konteyner çıkarın ve gevşek ve birikmiş parçacıkları kaldırmak için baş aşağı çevirin.
  7. Madde kabına aynı gün gerekli değilse, test maddesinin kurumasını veya nemi emmesini önlemek için madde kabını parafilm ile kapatın.

2. Gün

6. Pozlama sisteminin montajı ve çevre ekipmanının bağlanması

NOT: Şekil 3,Ek Şekil 2 ve Ek Şekil 3'tedaha ayrıntılı bir görünüm verilmiştir. Üreticinin talimatlarına göre her iki modülü ve aerosol jeneratörü monte edin.

  1. Su kaynağı ileriye bakacak şekilde pozlama sistemini sağlam ve çift bir yüzeye yerleştirin. Kütle akış kontrol örmelerini aerosol jeneratörü ve temiz hava maruziyeti için modüle bağlı üç yakalı bir şişeile bağlayın.
  2. Akış kontrol cihazını ve vakum pompasını bağlayın. Akış denetleyicilerinden gelen tüpleri aerosol kılavuz modülünün ekleri üzerindeki tüp konektörle bağlayın. Akış kontrol örmelerinin diğer tarafındaki tüpleri vakum pompası ile bağlayın. Akış modülünden akış kontrolörlerinden vakum pompasına doğru iletdiğinden emin olun.
  3. Isıtma su kaynağı ile su banyosu bağlayın. Su kaynağı, su banyosundan aerosol kılavuz modülündeki su girişine gidiyor. Aerosol kılavuz modülünün su çıkışını örnekleme modülünün su girişine bağlayın. Örnekleme modülünün su çıkışından su banyosuna bir bağlantı ile daireyi kapatın.
  4. Elutriator da dahil olmak üzere aerosol jeneratörü pozlama modülüne yakın yerleştirin ve elutriator'un fazla hatlarını ve pozlama ve temiz hava modülünü büyük mikro filtrelerle ve pozlama odalarının küçük mikro filtrelerle emmesini (örn. tek kullanımlık filtreler). Elutriator, üretilen partikül atmosferi için bir rezervuar görevi görmekte ve yaklaşık 7 μm'den daha büyük parçacıkları korurken, daha küçük parçacıklar pozlama modülüne taşınır.
  5. Aerosol üretimini kontrol etmek için kullanılan bilgisayarı bir USB kablosu ve güç kaynağı ile aerosol jeneratörüst USB bağlantı noktasına bağlayın. Güç kaynağı ünitesinin AC güç fişini bir sokete (220-240 V) bağlayın.
  6. Orta besleme ve kaldırma boruları için boruları iki pompa ile bağlayın. Bunun yerine orta kaynağı için bir pompa kullanarak, orta da el ile doldurulabilir.

7. Temiz hava ve partikül maruziyetine hazırlık

  1. En az 30 dakika ısınma süresi için vakum pompasını, akış kontrolörlerini ve su banyosunu (37 °C) açın.
  2. Basınçlı hava kaynağını açın. Kütle akış kontrolörlerini aerosol jeneratöre besleme hattı için 8 L/dk ve üç yakalı şişeye besleme hattı için 3 L/dk olarak ayarlayın. Kütle akış denetleyicilerinin sekmelerini kapatın.
    NOT: Bu değerler test maddesinin özelliklerine bağlı olarak değişebilir.
  3. Modül akışını (1,5 L/dk) ve hazne emmesini (30 mL/dk) düzenlemek için akış denetleyicilerini bilgisayar aracılığıyla ayarlayın.

8. Radyal akış sisteminin sızıntı testi

NOT: Modülün düzgün bir şekilde yeniden monte edilmesini sağlamak için sızıntı kontrolü vakum altında ve her iki modül için (pozlama ve temiz hava modülü) yapılmalıdır.

  1. Giriş adaptörlerini ve kondensrefleyi aerosol kılavuz modülünden çıkarın. Aerosol kılavuz modülündeki üç aerosol besleme deliklerini fişlerle ve örnekleme modülündeki orta besleme bağlantılarını sahte kapaklarla kapatın.
  2. Filtre olmadan vakum hatlarını aerosol kılavuz modülünün tüp konektörüyle bağlayın. El tekerleği kullanarak modülü kapatın ve akış kontrolörlerinin değerini ölçün. Değerler 5 mL/dk'nın altına kapattıktan birkaç dakika sonra azalmalıdır.
  3. Sızdırmazlık kontrolünden sonra, tüm fişleri ve kukla kapakları çıkarın, giriş adaptörünü ve kondensatör reflektörünü aerosol kılavuz modülüne takın ve orta besleme ve kaldırma için boruları bağlayın.

9. Aerosol üretimi

  1. Bilgisayarı ve yazılımı başlatın (Ek Şekil 4). Bilgisayarın masaüstündeki aerosol jeneratör başlat düğmesine çift tıklayarak aerosol jeneratör yazılımı başlatın. İleti penceresi görüntülenir ve ayarların sıfırlanıp sıfırlanmaması gerektiğini sorar. Yazılım o gün ilk kez başlatılırsa Evet'i tıklatın. Slayt Konumu ve Kazıyıcı Konumu değerlerini varsayılan değerlere ayarlayın. Slayt Konumu ve Kazıyıcı Konumu değerlerini tutmak için Hayır'ı tıklatın veya slayt başlangıç konumunda değil.
  2. Aerosol jeneratör üst merkezi açılış bulunan boru, içine bir madde kazıyıcı vida.
    NOT: Pres özelliklerine bağlı olarak farklı madde kazıyıcı tipleri kullanılabilir.
  3. Madde kazıyıcı en düşük konumda değilse, Homing Mode düğmesini kullanın.
  4. Madde kabını preslenmiş test malzemesi ile madde kazıyıcının üzerine ters çevirin. Madde kabının camının öne dönük olduğundan emin olun. Madde kabındaki iki deliğin aerosol jeneratör üst iki pim üzerine uygun olduğundan emin olun. Kilitleme plakasını madde kabının üzerine yuvaya yerleştirin ve siyah vidayı sıkın.
  5. Besleme (0,24 ila 20 mm/sa) ve Döndürme (1 ila 800 devir/saat) değerlerini istenilen ayarlarla değiştirin. Parçacık konsantrasyonu, Yem değerini veya taşıyıcı gaz akış hızını artırarak veya azaltarak değiştirilebilir.
  6. Madde kazıyıcı preslenmiş madde yakın olana kadar madde konteyner ile slayt aşağı itmek için aşağı oklar kullanın.
  7. Basınçlı hava kaynağını aerosol jeneratörüne kütle akış kontrolörüne dokunarak açın ve Başlat düğmesine tıklayarak aerosol üretimini başlatın. Uzun bekleme sürelerinden kaçınmak için Besleme hızını 15-20 mm/s olarak ayarlayın.
  8. İnce toz bulutunu küçük bir el feneriyle gözlemleyerek doğru parçacık oluşumunu kontrol edin (Elutriator'un cam tüpünün arkasından aşağıdan konumlandırılmış). İlk aerosol buharı sürekli olarak Elutriator'a ulaştığında Besleme değerini istenilen ayarlara geri çevirin ve Durdur düğmesine tıklayın.

10. Pozlama deneyleri

  1. Orta beslemeyi önceden ısıtmalı pozlama ortamıyla çalıştırın ve modül açıkken alt borular kapsana kadar örnekleme modüllerini doldurun. Orta pompayı kullanın veya orta pompayı manuel olarak doldurun (bireysel maruz kalma haznesi 25 mL).
  2. Pozlama modülüne kör hücre kültürü ekler (hücresiz ekler) ekleyin. Alt borular orta ile kaplanmış ve kesici uçların alt tarafı orta ile temas edene kadar pozlama ortamıaşağı pompalayın.
  3. Aerosol jeneratörünü çalıştırın, pozlama modülünü kapatın ve pozlama modülünü aerosol jeneratörün pozlama modülü çıkışına bağlayın. Aerosol jeneratöre, kararlı bir parçacık oluşumunu sağlamak için pozlamabaşlamadan önce en az 20-30 dakika bir teslim süresi verin.
  4. Kuluçka sonrası plakaları kuluçka kontrolleri için hazırlayın ve kurşun süresi boyunca maruz kalan hücre kültürü ekler. Kuyu başına 1,5 mL büyüme ortamı ekleyin ve kuvözdeki plakaları kuluçkaya yatırın (37 °C, %5 CO2).
  5. Kurşun süresinden sonra, Elutriator'un pozlama modülü çıkışını kauçuk bir fiş ile kapatın ve kör kesici uçları çıkarın. Alt borular orta ile kapsana kadar pozlama ortamını (pompayı kullanarak veya manuel olarak) yeniden doldurun. Şimdi, kütle akış denetleyicisi (3 L/dk) musluğu ile temiz hava modülüne basınçlı hava beslemesini de açın
  6. Bir cızırdayan yardımıyla 6-kuyu plakaları hücre kültürü ekler çıkarın. Hücre kültüründen büyüme ortamını dikkatlice dökün, kesici uçları devirerek ve bir pipet kullanarak artık sıvıyı atın. Uçları her iki modülün pozlama odalarına, pozlama ve temiz hava modülüne yerleştirin.
  7. Modülleri kapatın ve pozlama modülünü aerosol jeneratörün pozlama modülü çıkışına ve temiz hava modülünü aynı anda taşıyıcı gaz kaynağına bağlayarak pozlama deneylerine başlayın.
    NOT: Parçacık konsantrasyonu, Yem değerini, taşıyıcı gaz akış hızını veya maruz kalma süresini artırarak/azaltarak değiştirilebilir.
  8. Deney tamamlandıktan sonra pozlama ve temiz hava modüllerini kesin ve pozlama modülü çıkışını kapatın.
  9. Dur düğmesine tıklayarak basınçlı hava beslemesini ve aerosol jeneratörü durdurun.
  10. Pozlama ve temiz hava modüllerini açın ve hücre kültürünü nisbeten bir cızırdama kullanarak hazırlanan kuluçka sonrası plakalara aktarın. 6 kuyulu plakaları ALI'de 24 saat (37 °C, %5 CO2)için kuluçkaya yatırın.
    NOT: Daha fazla maruz kalma denemeleri planlanıyorsa 10.5 -10.10 adımlarını tekrarlayın.
  11. Maruz kalan hücre kültürü ekler aynı koşullar altında ALI inkübatör kontrolleri olarak kullanılan hücre kültürü kesici uçlar asansör ve 24 saat (37 °C,% 5 CO2) için inkübat.
  12. Madde kabını kaldırmak için Homing Mode düğmesini kullanın. Sağ üst köşedeki X'e tıklayarak aerosol jeneratör yazılımını kapatın ve bilgisayarı kapatın.
  13. Tüm pozlama deneylerini tamamladıktan sonra aerosol jeneratörü ve her iki pozlama modüllerini temizleyin. Test maddesi önümüzdeki günlerde daha fazla kullanılacaksa madde kabını parafilm ile kapatın.

3. Gün

11. Hücre canlılığı

NOT: WST-1 tpatı kullanılarak mitokondriyal aktivite ölçülerek parçacık birikiminden 24 saat sonra hücre canlılığı belirlendi. Test üreticinin protokolüne göre yapıldı. Hücre canlılığı diğer hücre canlılık testleri (örneğin, XTT) kullanılarak da belirlenebilir.

  1. Temper büyüme ortamı nı 37 °C'de ısıtın ve ışıktan korunan WST-1 çözeltisini eritin. Kuyu başına 2,5 mL büyüme ortamına sahip uygun sayıda yeni 6 kuyulu plaka hazırlayın ve kuvözdeki plakaları kuluçkaya yatırın.
  2. Büyüme ortamında yeterli miktarda WST-1 1:7 seyrelterek WST-1 seyreltme hazırlayın
  3. Yeni hazırlanmış 6-iyi plakalar maruz kaldıktan sonra hücre kültürü ekler 24 saat ekler. Her hücre kültürü eklemek için taze hazırlanmış WST-1 çözeltisi 1 mL ekleyin. Çözeltiyi hücrelerüzerinde homojen bir şekilde dağıtmak için plakaları dikkatlice sallayın. Hücre kültürü 1 saat (37 °C, %5 CO2)ile 6 kuyulu plakaları kuluçkaya yatırın.
  4. Her 6 kuyudan 96 kuyulu bir tabağa triplicates içinde supernatant 100 μL aktarın. Mikroplaka okuyucu kullanarak 650 nm referans dalga boyu ile 450 nm'de emiciliği ölçün.

12. İstatistik

  1. Bireysel inkübatör kontrollerinin hücre canlılığını %100'e normalleştirin.
  2. Maruz kalan hücrelerin canlılığını bireysel kuvöz kontrollerine göre ifade edin. Test maddelerinin sitotoksisitesi ilgili kuvöz kontrolleri ile karşılaştırıldı ve toksisitenin bir göstergesi olarak kullanıldı.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

CULTEX RFS, ALI'deki hücrelerin doğrudan ve homojen bir şekilde maruz kalmasını sağlayan özel olarak tasarlanmış modüler in vitro pozlama sistemidir. Eski bir ön doğrulama çalışması nda, bu maruz kalma sisteminin genel uygulanabilirliği ve aktarılabilirliği, stabilitesi ve tekrarlanabilirliği başarıyla gösterilmiştir. Almanya Federal Eğitim ve Araştırma Bakanlığı tarafından finanse edilen yakın tarihli bir araştırma projesinde, maruz kalma sistemi başarıyla doğrulandı ve test edilen bileşiklerin akut teneffüs tehlikeleri için bir tahmin modeli (PM) olarak kuruldu. Ön doğrulama çalışması sırasında temiz hava kontrollerinin kalitesi kritik bir parametreye dönüştüğünden, doğrulama çalışmasının başlangıcında çeşitli protokol ve yöntem optimizasyonları (örn. hücre kültürü kesici uçlarının değiştirilmesi, HEPES konsantrasyonunu 100 mM'ye çıkararak maruz kalma ortamının pH'sının stabilizasyonu) uygulanarak son derece istikrarlı ve tekrarlanabilir sonuçlara ve üç laboratuvarda da temiz hava canlılığı verilerinin önemli ölçüde iyileştirilmesine yol açmaktadır(Şekil 4). A549 hücreleri daha sonra ALI'de üç farklı maruzkalma dozuna (25, 50 ve 100 μg/cm2)maruz kaldı ve üç bağımsız laboratuvarda önceden seçilmiş ve kodlanmış test maddelerinin sitotoksisitesi (toksisite göstergesi olarak kullanılır) ilgili kuvöz kontrollerine göre karşılaştırıldı. 13 kodlu madde bu şekilde triplicatelerde, yedi kodlu madde tek bir deney olarak test edildi. Hücre canlılığı %50'nin altına düştüğünde test maddelerinin akut inhalasyon tehlikesi uyguladığı düşünüldü (PM %50) veya %75 'i (PM %75) olabilir.

Şekil 5'teörnek olarak gösterildiği gibi, A549 hücrelerinin farklı test maddelerine maruz kalması hiçbir, orta veya güçlü bir toksisite sergilememiştir. Tüm deneyler üç laboratuvarda bağımsız olarak yapıldığından, laboratuvarlar içinde ve arasında tekrarlanabilirlik ve maruz kalma sisteminin öngörüsü ile ilgili veriler analiz edilmiştir. Uygulanan PM'ye (PM %50 veya PM %75) bağlı olarak, laboratuvar içi ve laboratuvar içi tekrarlanabilirlik %90-100 arasında değişmekte olup, bu yöntemin sağlamlığını ve aktarılabilirliğini gösterir. Test edilen tüm maddelerin vivo referans verilerinde mevcut olduğu için (geleneksel LC50 protokolü ve konsantrasyon x saati (C x t) protokolü kullanılarak OECD TG 403 veya TG 436'ya göre en az bir güvenilir çalışmaya dayalı olarak), in vivo ve in vitro veriler % 85 (17/20) özgüllüğü ile %85 (10/12) ve %85 (7/8) duyarlılık ile genel bir uyumsaptanmıştır (Tablo 1). Sadece iki madde yanlış pozitif, diğeri ise yanlış negatif olarak sınıflandırıldı.

Özetle, doğrulama çalışmasısonuçları seçilen hava partiküllerinin akut pulmoner sitotoksisitesinin nitel değerlendirilmesi için transfer edilebilir, tekrarlanabilir ve tahmine dayalı bir tarama yöntemi sunar.

Figure 1
Şekil 1: HÜCRELERIN ALI'de veya batık koşullarda maruz kalma. A549 hücreleri ya ALI'de (solda) bir test maddesi (mavi oklar ve nokta) ile maruz bırakılabilir( solda) maruz kalma sistemi girişi yoluyla ya da maruz kalma ortamı (mavi nokta) ile seyreltilmiş test maddesi ile (mavi nokta) dalgıç koşulları oluşturarak (sağda). Kırmızı noktalı çizgiler, ilgili deneysel kurulumda pozlama ortamının (parlak kırmızı) dolgu düzeylerini temsil eder. Bu rakam Tsoutsoulopoulos ve ark.24'tendeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Pozlama modülü. Giriş adaptörü, aerosol kılavuz modülü, numune alma ve soket modülü ve el tekerleği içeren kilitleme modülünden oluşan radyal akış sisteminin temel modülüne şematik genel bakış. Bu rakam Aufderheide ve ark.17'dendeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Pozlama sistemine genel bakış. Bileşenler temiz hava ve parçacık maruziyeti için iki pozlama modülü, elutriator ve ilgili kontrol ünitesi de dahil olmak üzere aerosol jeneratör ve orta pompalar vardır. Bu rakam Aufderheide ve ark.17'dendeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Test yönteminin optimizasyonundan sonra temiz hava canlılığı verileri. Hücrelerin temiz havaya maruz kalma süresi içinde hücre canlılığında azalmaya yol açmış ve ön doğrulama çalışmasına göre temiz hava canlılığı verilerinde önemli bir iyileşmeye yol açmıştır. Tüm temiz hava kontrolleri her laboratuvar (Laboratuvar 1-3) ve maruz kalma süresi (n = 46 laboratuvar ve zaman noktası) için havuzlu edildi. Veriler, ortanca çizgiye ve bıyıklarla gösterilen aralıkta boxplot olarak görüntülenir. Bu rakam Tsoutsoulopoulos ve ark.23'tendeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: A549 hücrelerinin farklı test maddelerine maruz kalması. (A) A549 hücrelerinin tungsten(IV) karbüre maruz kalma üç farklı maruziyet dozları için hücre canlılığı hiçbir azalma gösterdi ve toksik olmayan olduğu ortaya çıktı (n = 3 laboratuvar ve maruz kalma dozu). (B) Hücrelerin tetrabromoftallik anhidrite maruz kalma iyi bir doz yanıt eğrisi (n = 1 laboratuvar ve maruz kalma dozu) sunan orta toksisite tüm laboratuvarlar için sonuçlandı. (C) Çinko dimethyldithiocarbamate güçlü bir toksisite sergiledi, zaten 25 μg/cm yatırılan doz sonra azaltılmış hücre canlılığı yolaçan 25 g/cm 2 (n = 3 laboratuvar ve maruz kalma dozu başına). Hata çubukları standart sapmaları temsil eder. Bu rakam Tsoutsoulopoulos ve ark.23'tendeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Vivo'da referans sonuçları Sonuçlar in vitro
Madde OECD TG CLP düzenlemesi Toksisite PM50% PM75% Vivo / in vitro uygun
Tungsten(IV) karbür 403 n. c 0 0 0 Evet
Tungsten(IV) karbür nano - n. c. 0 0 0 Evet
N,N'-ethylenebis(N-acetylacetamide) EPA OPPTS 870.1300 n. c. 0 0 0 Evet
Silikon dioksit 403 n. c. 0 0 0 Evet
Diamonyum hidrojenorto-fosfat 403 n. c. 0 0 0 Evet
Disodyum forofosfat 403 n. c. 0 0 0 Evet
Neodimyum oksit 436 n. c. 0 0 0 Evet
Potasyum hidrojen monopersülfat 403 n. c. 0 0 0 Evet
Siklohepta-pentylose 403 n. c. 0 0 0(2x) / 1(1x) (Evet)
Vanadyum(III) oksit 403 n. c. 0 0 0(2x) / 1(1x) (Evet)
Tetrapotasyum pirofosfat 403 n. c. 0 1 1 №
Tetra-bromoftalans anhidrit 403 (benzer) n. c. 0 1 1 №
Sefylpyridinium klorür 403 Akut Toksin. 2 1 1 1 Evet
N-Lauroylsarcosine sodyum tuzu 403 Akut Toksin. 2 1 1 1 Evet
Çinko dimethyldithio-karbamate 403 Akut Toksin. 2 1 1 1 Evet
Bakır(II) hidroksit 403 Akut Toksin. 2 1 1 1 Evet
Çinko selenit 436 Akut Toksin. 3 1 1 1 Evet
Sodyum metavanadate 403 Akut Toksin. 4 1 1 1 Evet
Divanadium pentaoksit 403 Akut Toksin. 4 1 1 1 Evet
Kadmiyum tellür 403 Akut Toksin. 4 (n. c.) 1 0 0 №
n. c. = sınıflandırılmamış; 0 = toksik olmayan; 1 = toksik; CLP = sınıflandırma, etiketleme ve paketleme

Tablo 1: In vivo ve in vitro sonuçlar arasında uygun. 20 maddeden 10'u doğru negatif, yedi madde doğru pozitif olarak sınıflandırıldı ve bu da %85'lik bir konkordatoya yol açtı (17/20). Bu tablo Tsoutsoulopoulos ve ark.23'tendeğiştirilmiştir. (Test No. 403: Akut Inhalasyon Toksisitesi, Test No. 436: Akut İnhalasyon Toksisitesi - Akut Toksik Sınıf Yöntemi; Akut Toksin. 2 = ölümcül, Akut Toksin. 3 = toksik, Akut Toksin. 4 = zararlı).

Supplementary Figure 1
Ek Şekil 1: Madde kabının montajı. Picture CULTEX DG (Toz Jeneratör) Kullanım Kılavuzu alınmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Supplementary Figure 2
Ek Şekil 2: Pozlama sisteminin Aerosol kılavuz modülü. A) Üst görünüm ve B) aerosol kılavuz modülünün alt görünümü. CULTEX RFS (Radyal Akış Sistemi) Kullanım Kılavuzu'ndan alınan resim. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Supplementary Figure 3
Ek Şekil 3: Aerosol jeneratör. A) Aerosol jeneratör üst ve Elutriator oluşan aerosol jeneratör, şematik genel bakış. B) aerosol jeneratör üst ve C) Elutriator ayrıntılı görünümü. Picture CULTEX DG (Toz Jeneratör) Kullanım Kılavuzu alınmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Supplementary Figure 4
Ek Şekil 4: Aerosol jeneratör kontrol yazılımı. Picture CULTEX DG (Toz Jeneratör) Kullanım Kılavuzu alınmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Birçok hayvan dışı inhalasyon toksisite testi modelleri son yıllarda inhale edilebilir parçacıkların akut inhalasyon tehlikesi hakkında bilgi edinmek ve 3R prensibine göre hayvan deneylerini azaltmak ve değiştirmek amacıyla geliştirilmiştir25.

Hücre kültürü modelleri açısından, hücrelerin maruz kalma batık koşullar altında veya ALI yapılabilir. Batık koşullar altında hücrelerin maruz fiziko-kimyasal özellikleri ve böylece, bir test maddesinin toksik özelliklerini etkileyebilir12. In vitro ALI inhalasyon modelleri, ancak, batık maruz kalma daha yüksek biyolojik ve fizyolojik benzerlik ile insan maruz kalma durumu taklit ve bu nedenle daha iyi hava parçacıklarının akut inhalasyon toksisitesi analiz etmek için uygundur. CULTEX RFS'nin diğer mevcut maruziyet modüllerine göre önemi sadece ALI koşullarında hücrelerin maruz kalmaları değil, aynı zamanda parçacıkların homojen dağılımı ve birikimidir. Lineer aerosol kılavuzlu sıralı pozlama modellerinin aksine, bu pozlama yönteminin modüler tasarımı, hücrelerdeki parçacıkların çok homojen bir birikimine yol açan radyal besleme hattına olanak sağlar17.

Başarılı maruz kalma deneyleri için en önemli nokta temiz hava kontrollerinin kararlı ve uyumlu kalitesidir. Temiz hava kontrollerinin uygulanabilirliğinin zaman içinde etkilenmemesi ve ilgili kuvöz kontrollerine kıyasla %100 oranında mümkün olduğunca yakın olması dikkat edilmelidir. Temiz hava canlılığı konusunda önemli bir rol oynayan faktörler uygun hücre kültürü kesici uçların seçimi, maruz kalma ortamının pH değeri ve temiz havanın bileşimidir. Hücre kültürü açısından, iyi bir kalite ve gözenekleri yüksek yoğunluklu garanti edilmelidir. Bu daha iyi bir orta kaynağı ve hücre kültürü ekler içinde daha yüksek bir bağıl nem sağlar, kurutma hücreleri korumak26. Yan duvar açıklıklı hücre kültürü kesici uçlar kullanılarak, yan duvar açıklıklarından test partiküllerinin sızmasını önlemek için özel kesici uç kılıfları kullanılmalıdır. 8'den yüksek pH değerinin bir kayma zaten hücreler üzerinde toksik bir etkiye sahip olabilir ve bu nedenle hücre canlılığı bir bozulmaya yol açan27. Bu durum özellikle uzun partikül biriktirme zamanlarında (örn. 60 dk) temiz hava %5'ten az CO2 içeriyorsa veya maruz kalma ortamının HEPES konsantrasyonu çok düşükse ve kaçınılması gereken çok düşükse ortaya çıkar.

Protokolün kritik bir konusu test maddelerinin preslenmesidir. Test maddeleri, kararlı bir parçacık maruziyetini sağlamak için madde kabı içindeki bir toz keke yeterince sıkıştırılmalıdır. Bu nedenle, maddelerin pres özellikleri ile ilgili ön deneylerde karakterize edilmesi ve hangi pres piston, kazıma bıçağı veya yem oranlarının kullanılması gerektiği hakkında bilgi edinebilmesi için, maddelerin karakterize edilmesi gerekmektedir.

Ancak hidrolik presin maksimum presleme basıncı, cam silindirin yük limitini ve dolayısıyla presleme işleminin sınırlandırılmasını temsil eden 10 kN'dir. Madde kabı 10 kN'den daha yüksek presleme kuvvetlerine dayanamaz. Daha yüksek bir presleme kuvveti kristal maddelerin presleme sunabilir ve böylece, bu basının uygulanabilirliğini genişletmek ama daha sağlam madde kapları gerektirir.

Ayrıca, öncelikle havadaki parçacık maruziyetlerinin araştırılması için tasarlanan bu maruziyet sistemi, aerosol üretim yöntemine ve maruziyet modüllerinin malzemesine bağlı olarak sıvı aerosollerin ve son derece zehirli ve agresif gazların maruz kalmasına adapte edilebilir. Bir membran nebülizör ile aerosol jeneratör değişimi ve paslanmaz çelik pozlama modülü kullanarak son derece toksik sıvı aerosoller hücrelerin maruz kalma sağladı24.

Bir diğer kritik konu da aşırı yük etkisidir. Hücre canlılığı sadece bir test maddesinin toksikolojik özelliklerinden değil, aynı zamanda hücrelere yatırılan bir maddenin miktarından da etkilenebilir. Bu maruz kalma sistemi insan alveolar bölgesinde fizyolojik koşullara gerçekten önemli benzerlik gösterir ama parçacıkları kaldırmak için herhangi bir boşluk mekanizmaları içermez. Bu nedenle çok sayıda parçacık nedeniyle hücre canlılığının bozulmaması çok önemlidir.

Buradaki protokol, ALI'deki ekili insan akciğer hücrelerinin havadaki parçacıklara homojen olarak maruz kalmasını tanımlar. Tekrarlanabilirlik, sağlamlığı ve aktarılabilirliği, mevcut maruziyet sistemini, inhalat edilebilir parçacıkların akut inhalasyon toksisitesi açısından nitel olarak değerlendirilmesi için in vitro tarama yöntemi olarak uygulanabilir kılabilir. Şimdiye kadar alternatif in vitro yöntemleri yeterince doğrulanmadığından, akut pulmoner toksisite hala hayvanların teşhir edilmesiyle değerlendirilmektedir (örn. tüm vücut odaları, burun veya sadece ağızdan kaynaklanan yöntemler). Akut inhalasyon toksisitesi için yaygın olarak kabul edilen tüm OECD test kılavuzları (örneğin, TG 403, TG 433 ve TG 436) şu anda hayvan modelleri ne dayanmaktadır21,22,28,29. Bu nedenle, akut inhalasyon toksisitesi için in vitro test rehberi olarak kabul edilmesi için Ekonomik İşbirliği ve Kalkınma Örgütü'ne (OECD) ileride uygulanacak bir yön olacaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

YAZARLAR AT, KG, AB, SH, HM, TG, HT ve DS ifşa etmek için hiçbir şey var. Cultex Technology GmbH (eski adıyla Cultex Laboratories GmbH) bu makalede kullanılan enstrümanlar (örneğin CULTEX RFS, CULTEX DG) üretmektedir. NM bu çalışma sırasında Cultex Laboratories GmbH'nin bir çalışanıydı. Ok Cultex Technology GmbH (eski Cultex Laboratories GmbH) bir çalışanıdır. Cihaz için pct/EP2009/007054 patenti Cultex Technology GmbH'nin kurucusu Prof. Dr. Ulrich Mohr (eski adıyla Cultex Laboratories GmbH) tarafından saklanmıştır.

Acknowledgments

Bu çalışma Almanya Federal Eğitim ve Araştırma Bakanlığı (Bundesministerium für Bildung und Forschung, BMBF, Almanya (Grant 031A581, alt proje A-D)) ve Alman Araştırma Vakfı (Deutsche Forschungsgesellschaft, DFG, Araştırma Eğitim Grubu GRK 2338).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cells
A549 ATCC CCL-185
Cell culture medium and supplies
DMEM Biochrom, Berlin, Germany FG 0415 used as growth medium
DMEM Gibco-Invitrogen, Darmstadt, Germany 22320 used as exposure medium
FBS superior Biochrom, Berlin, Germany S 0615
Gentamycin (10mg/mL) Biochrom, Berlin, Germany A 2710
HEPES 1M Th. Geyer, Renningen, Germany L 0180
PBS Biochrom, Berlin, Germany L 1825
Trypsin/EDTA (0.05%/0.02%) Biochrom, Berlin, Germany L 2143
Cell culture material
CASY Cups Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Germany REF 05651794
Cell culture plates Corning, Wiesbaden, Germany 3516 6­-well plates
Corning Transwell cell culture inserts Corning, Wiesbaden, Germany 3450 24mm inserts; 6-­well plates; 0.4 µm
Chemicals
CASYton Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Germany REF 05651808001
Compressed Air (DIN EN 12021) Linde Gas Therapeutics GmbH, Oberschleißheim, Germany 2290152
WST-1 Abcam, Cambridge, United Kingdom ab155902
Instruments + equipment
CASY Cell Counter Schärfe System GmbH, Reutlingen, Germany
Circulation thermostat LAUDA, Lauda-Königshofen, Germany Ecoline RE 100
CULTEX HyP - Hydraulic Press Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany
CULTEX insert sleeve Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany
CULTEX RFS - Radial Flow System Type 2 (module for particle exposure) Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany
CULTEX RFS - Radial Flow System Type 2 (module for clean air exposure) Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany
CULTEX supply
Flow controller 0-30 ml/min (IQ-Flow) Bronkhorst Deutschland Nord GmbH
Flow controller 0-1,5 l/min (EL-Flow) Bronkhorst Deutschland Nord GmbH
Filters (large) Munktell & Filtrak GmbH, Sachsen, Germany LP-050 Munktell Sterile Filter; Particle retention efficiency > 99,999%
Filters (small) Parker Hannifin Corporation, Mainz, Germany 9933-05-DQ Balston disposable filter
Medium pump Cole-Parmer GmbH, Wertheim, Germany Ismatec IPC High Precision Multichannel Dispenser digital peristaltic pump
Microplate Reader Infinite M200 Pro Tecan Deutschland GmbH, Crailsheim, Germany
Vakuum pump KNF, Freiburg, Germany N86 KT.18
Vögtlin mass flow controller 0,2-10 l/min TrigasFI GmbH Vögtlin red-y compact regulator, Typ-Nr.: GCR-C3SA-BA20
Water Bath LAUDA, Lauda-Königshofen, Germany Ecoline Staredition RE 104

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Faber, S. C., McCullough, S. D. Through the Looking Glass: In vitro Models for Inhalation Toxicology and Interindividual Variability in the Airway. Applied In vitro Toxicology. 4 (2), 115-128 (2018).
  2. Ambient air pollution: a global assessment of exposure and burden of disease. , World Health Organization. http://apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/250141/9789241511353-eng.pdf?sequence=1 (2018).
  3. De Matteis, S., et al. Current and new challenges in occupational lung diseases. European Respiratory Review. 26 (146), 1-15 (2017).
  4. LANUV Nordrhein-Westfalen. Gesundheitliche Risiken von Nanomaterialien nach inhalativer Aufnahme. , (2009).
  5. Bérubé, K., et al. In vitro Models of Inhalation Toxicity and Disease. The report of a FRAME workshop. Alternatives To Laboratory Animals. 37 (1), 89-141 (2009).
  6. Lopez, A. D., Murray, C. C. The global burden of disease, 1990-2020. Nature Medicine. 4 (11), 1241-1243 (1998).
  7. Clippinger, A. J., et al. Alternative approaches for acute inhalation toxicity testing to address global regulatory and non-regulatory data requirements: An international workshop report. Toxicology In vitro. 48, 53-70 (2018).
  8. Agrawal, M. R., Winder, C. Frequency and Occurrence of LD50 Values for Materials in the Workplace. Journal Of Applied Toxicology. 16 (5), 407-422 (1996).
  9. Amtsblatt der Europäischen Union. Verordnung (EG) Nr. 1907/2006 des Europäischen Parlaments und des Rates. Europäische Union. 860, (2006).
  10. Huh, D., et al. Reconstituting Organ-Level Lung Functions on a Chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
  11. Fisher, R. L., et al. The Use of Human Lung Slices in Toxicology. Human and Experimental Toxicology. 13 (7), 466-471 (1994).
  12. Lenz, A. G., et al. Inflammatory and Oxidative Stress Responses of an Alveolar Epithelial Cell Line to Airborne Zinc Oxide Nanoparticles at the Air-Liquid Interface. Biomed Research International. 12, (2013).
  13. Steinritz, D., et al. Use of the CULTEX Radial Flow System as an in vitro exposure method to assess acute pulmonary toxicity of fine dusts and nanoparticles with special focus on the intra- and inter-laboratory reproducibility. Chemico-Biological Interactions. 206 (3), 479-490 (2013).
  14. Lacroix, G., et al. Air-Liquid Interface In vitro Models for Respiratory Toxicology Research. Applied In vitro Toxicology. 4 (2), 91-106 (2018).
  15. Eskes, C., Whelan, M. Validation of Alternative Methods for Toxicity Testing. 418, Springer International Publishing. (2016).
  16. Rach, J., Budde, J., Möhle, N., Aufderheide, M. Direct exposure at the air-liquid interface: Evaluation of an in vitro approach for simulating inhalation of airborne substances. Journal Of Applied Toxicology. 34 (5), 506-515 (2014).
  17. Aufderheide, M., Halter, B., Möhle, N., Hochrainer, D. The CULTEX RFS: A comprehensive Technical Approach for the In vitro Exposure of Airway Epithelial Cells to the Particulate Matter at the Air-Liquid Interface. Biomed Research International. 15, (2013).
  18. Lieber, M., Todaro, G., Smith, B., Szakal, A., Nelson-Rees, W. A continuous tumor-cell line from a human lung carcinoma with properties of type II alveolar epithelial cells. International Journal Of Cancer. 17 (1), 62-70 (1976).
  19. Carterson, A. J., et al. A549 lung epithelial cells grown as three-dimensional aggregates: Alternative tissue culture model for Pseudomonas aeruginosa pathogenesis. Infection And Immunity. 73 (2), 1129-1140 (2005).
  20. Kim, K. J., Borok, Z., Crandall, E. D. A useful in vitro model for transport studies of alveolar epithelial barrier. Pharmaceutical Research. 18 (3), 253-255 (2001).
  21. OECD. Test No. 403: Acute Inhalation Toxicity. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4. , OECD Publishing. Paris. (2009).
  22. OECD. Test No. 436: Acute Inhalation Toxicity – Acute Toxic Class Method. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4. , OECD Publishing. Paris. (2009).
  23. Tsoutsoulopoulos, A., et al. Validation of the CULTEX Radial Flow System for the assessment of the acute inhalation toxicity of airborne particles. Toxicology In vitro. 58, 245-255 (2019).
  24. Tsoutsoulopoulos, A., et al. A novel exposure system generating nebulized aerosol of sulfur mustard in comparison to the standard submerse exposure. Chemico-Biological Interactions. 298, 121-128 (2019).
  25. Russell, W. M. S., Burch, R. L. The principles of humane experimental technique. , Johns Hopkins School of Public Health. http://altweb.jhsph.edu/pubs/books/humane_exp/het-toc (1959).
  26. Tsoutsoulopoulos, A., et al. Optimization of the CULTEX radial flow system for in vitro investigation of lung damaging agents. Toxicology Letters. 244, 28-34 (2016).
  27. Osman, J. J., Birch, J., Varley, J. The response of GS-NS0 myeloma cells to pH shifts and pH perturbations. Biotechnology and Bioengineering. 75 (1), 63-73 (2001).
  28. OECD. Test Guideline 433: Acute Inhalation Toxicity – Acute Toxic Class Method. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4. , OECD Publishing. Paris. (2018).
  29. OECD. Guidance Document on Inhalation Toxicity Studies. , OECD Publishing. Paris. (2018).

Tags

Tıp Sayı 156 Akut pulmoner toksisite in vitro maruz ibarat sistemi hava-sıvı arabirimi doğrulama sitotoksisite havadaki parçacıklar
Hava-Sıvı Arabiriminde Ekili İnsan Akciğer Hücrelerinin Açığa Çıkarılması yla Havadaki Partiküllerin Akut İnhalasyon Toksisitesinin Değerlendirilmesi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tsoutsoulopoulos, A., Gohlsch, K.,… More

Tsoutsoulopoulos, A., Gohlsch, K., Möhle, N., Breit, A., Hoffmann, S., Krischenowski, O., Mückter, H., Gudermann, T., Thiermann, H., Aufderheide, M., Steinritz, D. Assessment of the Acute Inhalation Toxicity of Airborne Particles by Exposing Cultivated Human Lung Cells at the Air-Liquid Interface. J. Vis. Exp. (156), e60572, doi:10.3791/60572 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter