Summary
यहां, हम एक स्वचालित माइक्रो-बायोरिएक्टर में प्रयोग के डिजाइन को चलाने के लिए एक विस्तृत प्रक्रिया पेश करते हैं जिसके बाद प्रोटीन ए कॉलम का उपयोग करके सेल हार्वेस्ट और प्रोटीन क्वांटिफिकेशन होता है।
Abstract
बायोफार्मा उद्योग में वांछित उत्पादों की उपज बढ़ाने के लिए बायोप्रोसेस का अनुकूलन महत्वपूर्ण है। यह तनाव चयन और जैव प्रक्रिया मापदंडों को विकसित करके प्राप्त किया जा सकता है। इसके लिए शेक फ्लास्क का इस्तेमाल किया गया है। हालांकि, उनके पास पीएच और घुलित ऑक्सीजन (डीओ) जैसे प्रक्रिया मापदंडों को नियंत्रित करने की क्षमता की कमी है। इस सीमा को एक स्वचालित माइक्रो-बायोरिएक्टर की मदद से दूर किया जा सकता है। ये बायोरिएक्टर बड़े पैमाने पर खेती की नकल करते हैं। इस प्रणाली के प्रमुख फायदों में से एक सॉफ्टवेयर में डिजाइन ऑफ एक्सपेरिमेंट (डीओई) का एकीकरण है। यह एकीकरण एक डिजाइन स्थापित करने में सक्षम बनाता है जहां कई प्रक्रिया मापदंडों को एक साथ भिन्न किया जा सकता है। सॉफ्टवेयर के भीतर महत्वपूर्ण प्रक्रिया मापदंडों और इष्टतम जैव प्रक्रिया स्थितियों का विश्लेषण किया जा सकता है। यहां प्रस्तुत काम का ध्यान उपयोगकर्ता को सॉफ्टवेयर में प्रक्रिया डिजाइन में शामिल कदमों और खेती चलाने के भीतर डीओई के समावेश से परिचित कराना है।
Introduction
वैश्विक बायोफार्मा बाजार 2018 में 250 बिलियन अमेरिकी डॉलर से अधिक का था और लगातार1का विस्तार कर रहा है। दवा कंपनियां लघु आणविक दवाओं के उत्पादन से दूर जा रही हैं, जो जैव प्रौद्योगिकीय रूप से उत्पादित चिकित्सा विज्ञान जैसे पुनः संयोजन प्रोटीन के लिए हैं । ये अकेले 150अरबडॉलर से अधिक के राजस्व के लिए जिम्मेदार हैं 1. स्तनधारी कोशिकाओं को अब बड़े पैमाने पर इन दवा पुनः संयोजन प्रोटीन के उत्पादन के लिए उपयोग किया जाता है। वर्तमान अवधि में, स्तनधारी कोशिकाओं द्वारा उत्पादित ६८ अनुमोदित उत्पादों में से, ५७ चीनी हम्सटर अंडाशय कोशिकाओं (चो)2द्वारा उत्पादित कर रहे हैं । चो कोशिकाओं का उपयोग विशेष रूप से पुनः संयोजन प्रोटीन के उत्पादन के लिए किया जाता है जिसके लिए ट्रांसलेशनल संशोधनों की आवश्यकता होती है। इन कोशिकाओं को प्राथमिकता दी जाती है क्योंकि ये निलंबन में वृद्धि करते हैं और इस प्रकार रासायनिक रूप से परिभाषित मध्यम3,4में प्रजनन योग्य परिणाम सक्षम होते हैं । चो कोशिकाओं का उपयोग करने का अन्य लाभ यह है कि उत्पाद की ग्लाइकन संरचना मानव मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (एमएबी) से मिलती-जुलती है और इसके परिणामस्वरूप जीन प्रवर्धन5के कारण उच्च पुनर्संयोजन प्रोटीन उपज और विशिष्ट उत्पादकता होती है।
पिछले दो दशकों में रिकॉम्बिनेंट चो (rCHO) सेल कल्चर की यील्ड में सौ गुना की बढ़ोतरी हुई है । इस सुधार को प्रक्रिया मापदंडों के अनुकूलन, खिला रणनीति और सीरम मुक्त रासायनिक परिभाषित मध्यम6के विकास के लिए जिम्मेदार ठहराया गया है । दवा उत्पादों की आवश्यकताओं में वृद्धि के साथ, उत्पादन प्रक्रिया7के विकास के लिए लागत और समय दक्षता पर दबाव बढ़ जाता है। उत्पाद की गुणवत्ता को आश्वस्त करते हुए दबाव को कम करने के लिए डिजाइन (QbD) द्वारा गुणवत्ता पर दवा उद्योग के ध्यान को पुनः निर्देशित किया है। QBD का उपयोग उत्पाद उत्पादन के साथ-साथ प्रक्रिया को समझने के लिए किया जाता है। ओडीडी में उपयोग किया जाने वाला एक महत्वपूर्ण उपकरण प्रयोग का डिजाइन (डीओई) है। यह विभिन्न इनपुट चर और परिणामस्वरूप आउटपुट डेटा के बीच संबंध ों को प्रकट करके प्रक्रिया की समझ बढ़ाने में मदद करता है। प्रक्रिया की स्थिति को आत्मसात करने और टिटर मात्रा और गुणवत्ता में वृद्धि करने में परियोजना के शुरुआती चरणों के दौरान जैव प्रक्रिया को अनुकूलित करने के लिए डीओई दृष्टिकोण लागू करना फायदेमंद है। पुराने जमाने की रणनीति की तुलना में यह दृष्टिकोण फायदेमंद है: एक कारक-एट-ए-टाइम (OFAT)। शास्त्रीय, शाइनिन या तागुची का उपयोग करके डीओई के सांख्यिकीय दृष्टिकोणओएटी 8से कहीं बेहतर हैं।
प्रक्रिया और मीडिया अनुकूलन शेक फ्लास्क में किया जा सकता है। फ्लास्क अपेक्षाकृत सस्ती हैं। हालांकि, तापमान, पीएच और घुलित ऑक्सीजन (डीओ) जैसे मापदंडों को नियंत्रित करना संभव नहीं है। इन कमियों को दूर करने के लिए, 0.5 एल से 5 एल की कार्य मात्रा से लेकर बहुउपयोग बेंच-टॉप बायोरिएक्टरों का उपयोग किया जा सकता है। रिएक्टर एक व्यापक ऑन लाइन निगरानी और प्रक्रिया नियंत्रण प्रदान करते हैं । हालांकि, मल्टीयूज बायोरिएक्टर का उपयोग समय और श्रम गहन है। इन नुकसानों को दूर करने के लिए, एक उपन्यास एकल उपयोग बायोरिएक्टर जो बेंच-टॉप बायोरिएक्टर की निगरानी की व्यापक प्रक्रिया को जोड़ती है और शेक फ्लास्क की आसान हैंडलिंग का उपयोग किया जाता है। उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग प्रणाली और एकल उपयोग प्रौद्योगिकी ने प्रक्रिया प्रदर्शन और विकास9की दक्षता को बढ़ाने में योगदान दिया है।
इस आर्टिकल में ऑटोमेटेड माइक्रो बायोरिएक्टर (एएमबीआर) सॉफ्टवेयर में रेसिपी लोड करने के दिशा-निर्देश लिस्टेड हैं। इस प्रयोग के दौरान व्यवहार्य सेल एकाग्रता (वीसीसी) और टिटर पर विभिन्न सरगर्मी गति और पीएच के प्रभाव का अध्ययन किया जाता है। प्रयोग सॉफ्टवेयर MODDE 12 के डिजाइन के साथ प्रयोगात्मक परिणाम और विश्लेषण किया जाता है। उत्पाद एनालिटिक्स प्रोटीन ए कॉलम के साथ हाई प्रेशर लिक्विड क्रोमेटोग्राफी (एचपीएलसी) सिस्टम में किया जाता है। यह इस सिद्धांत पर आधारित है कि एमएबी का एफसी क्षेत्र प्रोटीन ए को उच्च आत्मीयता10,11के साथ बांधता है । इस विधि से, एमएबी की पहचान करना और उसकी मात्रा निर्धारित करना संभव है। क्वांटिफिकेशन 280 एनएम पर मापा एलुशन पीक क्षेत्रों पर किया जाता है।
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Protocol
1. पूर्वसंस्कृति प्रक्रिया
नोट: 1 x 107 कोशिकाओं/mL की एक व्यवहार्य सेल एकाग्रता के साथ Recombinant चो DG44 कोशिकाओं को इस प्रोटोकॉल के लिए उपयोग किया जाता है ।
- कमरे के तापमान के लिए कोशिकाओं के 1.2 मिलील युक्त शीशी गल और तुरंत एक 15 मिलील शंकुअप अपकेंद्रित्र ट्यूब ठंड बीज मध्यम के 10 मिलील युक्त करने के लिए सेल निलंबन हस्तांतरण।
- 190 x ग्राम और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए शंकुअप ट्यूब अपकेंद्रित्र और supernatant त्यागें।
- 500 मिलीआर शेक फ्लास्क में बीज मीडियम का 150 मिलीआर 36.8 डिग्री सेल्सियस तक प्री-हीट करें।
- धीरे से पूर्व गर्म बीज माध्यम के 10 mL में सेल गोली को फिर से निलंबित करें और कोशिकाओं को शेक फ्लास्क में स्थानांतरित करें।
- एक सेल काउंटर का उपयोग कर प्रारंभिक वीसीसी और व्यवहार्यता को मापने के लिए फ्लास्क से नमूने के 1 mL का उपयोग करें।
नोट: सफल खेती के लिए विगलन के बाद व्यवहार्यता 70% से ऊपर होनी चाहिए। - 36.8 डिग्री सेल्सियस पर एक कक्षीय शेखर (19 मिमी का शेखर व्यास) में शेक फ्लास्क और 120 आरपीएम की मिलाते हुए दर के साथ 7.5% सीओ2 को इनक्यूबेट करें।
नोट: ये स्थितियां सेल स्ट्रेन और मीडियम के आधार पर बदलती हैं। - कोशिकाओं को पास करने के तीन दिन बाद, शेक फ्लास्क को शेखर से हटा दें और इसे लैमिनार प्रवाह कैबिनेट के तहत रखें। अंतिम सेल एकाग्रता को मापने के लिए नमूना के 1 mL लें। मात्रा की गणना ताजा पूर्व गर्म बीज माध्यम को हस्तांतरित किया जाना है ताकि नए मार्ग में प्रारंभिक सेल एकाग्रता 2 x 105 कोशिकाओं/mL है ।
- मुख्य खेती के लिए बायोरिएक्टर में स्थानांतरित करने से पहले कुल 5 बार कोशिकाओं को पारित करें।
2. मुख्य खेती
- पूर्वसंस्कृति की अंतिम कोशिका एकाग्रता को मापें। बायोरिएक्टर में स्थानांतरित किए जाने वाले वॉल्यूम की गणना करें ताकि रिएक्टर में प्रारंभिक सेल एकाग्रता 3 x 105 कोशिकाएं/mL हो ।
- रिएक्टर को समतुल्य करने के लिए टीका से एक दिन पहले उत्पादन माध्यम से रिएक्टर भरें और तापमान, पीएच और डीओ जैसे प्रक्रिया मापदंडनिर्धारित करें।
नोट: खेती की स्थिति 36.8 डिग्री सेल्सियस और 60% घुलित ऑक्सीजन एकाग्रता (डीओ) है। हमने 6.9, 7.1 और 7.3 के पीएचएस के साथ 1050 आरपीएम और 1300 आरपीएम की सरगर्मी की गति का परीक्षण किया। जब तक कोशिकाओं की कटाई नहीं हो जाती तब तक खेती की कुल अवधि 12 दिन होती है। बैच प्रक्रिया 72 घंटे तक चलती है जिसके बाद फीड मीडियम को हर 24 घंटे जोड़ा जाता है। खेती के लिए इस्तेमाल किए जाने वाले प्रोटोकॉल को अगले सेगमेंट में विस्तार से सूचीबद्ध किया गया है ।
3. स्वचालित माइक्रो-बायोरिएक्टर सॉफ्टवेयर में नुस्खा लिखना
नोट: AMBR सेल संस्कृति सॉफ्टवेयर में एक नुस्खा लिखने के दो तरीके हैं: यह या तो एक जादूगर का उपयोग करके या प्रत्येक कदम मैन्युअल रूप से जोड़कर बनाया जाता है। इस प्रोटोकॉल के उद्देश्य के लिए, जादूगर का उपयोग कर कदम दिखाए जाते हैं।
- एक नया प्रयोग बनाना
- AMBR सेल संस्कृति सॉफ्टवेयर खोलें और परिचय टैब में नए प्रयोग बनाएंपर क्लिक करें ।
- नुस्खा लोड हो रहा है
- नए प्रयोग टैब में, प्रयोग का नाम दर्ज करें जिस तारीख को इसे आयोजित किया जाना है।
- खेती के दौरान इस्तेमाल किए जाने वाले कल्चर स्टेशन और जहाजों के लिए चेक प्वाइंट को सक्रिय करें। डीओई प्रयोग की प्रोग्रामिंग के दौरान एक आसान संक्रमण के लिए ऑटो ऐड डीओई टैग भी सक्रिय होंगे। अगले टैब पर स्विच करने के लिए अगले पर क्लिक करें ।
- एंटीफोम, इनोकुलम, फ़ीड और ग्लूकोज के साथ पोत में मीडिया के अलावा के बारे में जानकारी सेट करें।
- ऐड मीडिया प्लेट चेक प्वाइंट को एक्टिवेट करें। प्लेट प्रकार, नाम और माध्यम युक्त प्लेट के स्थान को परिभाषित करें।
सावधानी: प्लेट के प्रकार के आधार पर और यदि प्लेट में ढक्कन होता है, तो तरल हैंडलर के सुचारू संचालन को सुनिश्चित करने के लिए जांच को सक्रिय करें लिडेड है - जहाजों में मीडिया जोड़ें पर क्लिक करें। जहाजों में जोड़े जाने के लिए मीडिया की मात्रा दर्ज करें। प्लेट से जहाजों तक मीडिया के हस्तांतरण की मैपिंग को परिभाषित करें। अगले टैब पर स्विच करने के लिए अगले पर क्लिक करें ।
- ऐड मीडिया प्लेट चेक प्वाइंट को एक्टिवेट करें। प्लेट प्रकार, नाम और माध्यम युक्त प्लेट के स्थान को परिभाषित करें।
- रिएक्टर में खेती की स्थिति निर्धारित करें।
- मीडिया की जानकारी सॉफ्टवेयर में फीड होने के बाद खेती की शर्तों को असाइन करें। हालत मीडिया पर क्लिक करें और तापमान में भरें, लक्ष्य क्या, ऊपरी पीएच सीमा और सरगर्मी RPM (ऊपर सरगर्मी या नीचे सरगर्मी) ।
- जहाजों में inoculums के अलावा सेट करें।
- सेल प्लेट जोड़ेंसक्रिय करें। प्लेट प्रकार, नाम और माध्यम युक्त प्लेट के स्थान को परिभाषित करें।
- जहाजों में कोशिकाओं को जोड़नेपर क्लिक करें । टीका के समय दर्ज करें और जहाजों में जोड़े जाने वाले मीडिया की मात्रा।
- तरल हैंडलर द्वारा प्लेट से जहाजों तक सेल के हस्तांतरण के लिए यात्रा किए गए मार्ग को परिभाषित करें। अगले टैब पर स्विच करने के लिए अगले पर क्लिक करें ।
नोट: सुनिश्चित करें कि क्रॉस-संदूषण और गलत प्रारंभिक व्यवहार्य कोशिका एकाग्रता से बचने के लिए पिपेट टिप्स को पुन: उपयोग करें।
- फ़ीड, ग्लूकोज और एंटीफोम के अलावा सेट करें।
नोट: फ़ीड, ग्लूकोज और एंटीफोम के अलावा प्रक्रिया एक दूसरे के समान है। इस प्रोटोकॉल के लिए प्रक्रिया "फ़ीड" के लिए सूचीबद्ध है। यह ग्लूकोज और एंटीफोम के लिए दोहराया जा सकता है।- ऐड फीड प्लेट को सक्रिय करें और प्लेट टाइप, नाम और स्थान को परिभाषित करें। जहाजों में फ़ीड जोड़ें पर क्लिक करें और जहाजों में जोड़े जाने वाले फ़ीड की मात्रा दर्ज करें। प्लेट से जहाजों को फ़ीड के हस्तांतरण की मैपिंग को परिभाषित करें।
- खेती के आधार पर, फ़ीड अतिरिक्त की संख्या जोड़ें। इस खेती के लिए रिएक्टर को हर 24 घंटे तक 72 घंटे बाद खिलाया जाता है।
- मैन्युअल रूप से डेटा को कोशिकाओं से देरीमें दर्ज करके फीडिंग के बीच समय की देरी को जोड़ा गया । भोजन का पहला दिन 72 घंटे के टीका के बाद होता है और अगला 96 घंटे के बाद होता है।
नोट: खेती के दौरान झाग से बचने के लिए एंटीफोम इसके अलावा हर दिन जोड़ा जाना प्रोग्राम किया जाता है।
- खेती के दौरान सैंपलिंग सेट करें।
- ऐड सैंपल प्लेट को एक्टिवेट करें और प्लेट टाइप, नाम और स्थान को परिभाषित करें।
- जहाजों से नमूना लेने पर जांच करें और जहाजों से हटाए जाने वाले नमूने की मात्रा दर्ज करें। जहाजों से प्लेट में नमूने के हस्तांतरण की मैपिंग को परिभाषित करें। सुनिश्चित करें कि खेती के पूरे दौरान मात्रा 10 मीटर से नीचे कम न हो।
- खेती के दौरान लिए जाने वाले नमूनों की संख्या जोड़ें। खिलाने के समान, प्रत्येक इनपुट नमूना बिंदु के लिए पोत से निकाले जा रहे नमूने का समय जोड़ें।
- प्रक्रिया को सहेजें। अब इसे फांसी देने की तैयारी है।
नोट: प्रोटोकॉल के सुचारू संचालन को सुनिश्चित करने के लिए, AMBR सेल संस्कृति सॉफ्टवेयर में प्रक्रिया कदम टैब पर स्विच करें और नुस्खा के प्रवाह की कल्पना करने के लिए प्रक्रिया चरण दृश्य का चयन करें।
- नए प्रयोग टैब में, प्रयोग का नाम दर्ज करें जिस तारीख को इसे आयोजित किया जाना है।
- स्वचालित माइक्रो बायोरिएक्टर में प्रयोग का डिजाइन
- बायोरिएक्टर के डीओई सॉफ्टवेयर को चलाने के लिए, सुनिश्चित करें कि मुख्य सॉफ्टवेयर में नुस्खा सहेजा जाए और उपयोग करने के लिए तैयार हो।
- AMBR 15 डो सॉफ्टवेयर खोलें और जांच पर क्लिक करें और नएका चयन करें ।
- नई डीओई जांच का नाम बनाएं इन्वेस्टिगेशन डायलॉग बॉक्स में दर्ज करें।
- डीओई जांच के लिए एक प्रयोग आवंटित करने के लिए, विभिन्न मापदंडों का अध्ययन करने के लिए बनाया गया नुस्खा खोलें। ब्राउज़ पर क्लिक करें और संबंधित प्रयोग का चयन करें।
- डीओई फैक्टर को परिभाषित करें।
- पोत टैग पहले से ही कॉलम में सूचीबद्ध हैं। वांछित डीओई कारक को परिभाषित करने के लिए, पैरामीटर का चयन करें और डीओई फैक्टरलेबल वाले कॉलम पर क्लिक करें। नए का चयन करें और इकाइयों, संक्षिप्त, कारकों की निचली और ऊपरी सीमा (जैसे, तापमान, डीओ, पीएच) जोड़ें।
- प्रतिक्रिया कारक को परिभाषित करें।
- एक बार डो कारकों को परिभाषित किया गया है, प्रतिक्रिया है जिसके आधार पर प्रयोगात्मक विश्लेषण संरचित किया जाएगा परिभाषित ।
- प्रतिक्रियाएं टैब में, डेटा के विश्लेषण के लिए विचार किए जाने वाले मूल्यों को परिभाषित करें।
- संपादित डो प्रतिक्रियाओं पर क्लिक करें और प्रतिक्रिया, संक्षिप्त, इकाइयों, न्यूनतम और अधिकतम सीमा (जैसे, टिटर, व्यवहार्य सेल एकाग्रता) के नाम को परिभाषित करें।
- एक बार प्रतिक्रियाओं को परिभाषित करने के बाद, प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए AMBR चर का चयन करें और चर को परिभाषित करें। एक प्रतिक्रिया स्वचालित रूप से एक माइक्रो-बायोरिएक्टर चर के साथ जुड़ा हुआ हो सकता है, ड्रॉप-डाउन सूची से आवश्यक चर चुनें।
- आवश्यकता के आधार पर प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए समीकरण बदलें। चुनाव न्यूनतम, अधिकतम, पहले, अंतिम और औसत डेटा के बीच है।
- एक डिजाइन बनाएं।
- प्रतिकृति और केंद्र बिंदुओं की संख्या जोड़ने या हटाने के लिए, प्रयोगात्मक डिजाइन के प्रकार का चयन करने के लिए स्टार्ट डिज़ाइन जादूगर का उपयोग करें।
- उद्देश्य का चयन करें, जो डिजाइन और मॉडल की पसंद निर्धारित करता है:
स्क्रीनिंग: महत्वपूर्ण कारकों को खोजने के लिए रैखिक और इंटरैक्शन मॉडल का उपयोग करता है
अनुकूलन (आरएसएम), विस्तृत मॉडलिंग और अनुकूलन के लिए चतुर्भुज और घन मॉडल का उपयोग करता है
विभाजित उद्देश्य: निर्माण और प्रक्रिया कारकों के लिए मॉडल अलग से चुना जा सकता है - एक बार उद्देश्य पर निर्णय लिया जाता है, केंद्र अंक और प्रतिकृति की संख्या के साथ मॉडल और डिजाइन का चयन करें ।
- खत्म पर क्लिक करें और अगले टैब पर स्विच करें।
- प्रयोग को परिभाषित करें।
नोट: डीओई कारक सॉफ्टवेयर के सही कॉलम में सूचीबद्ध हैं। वांछित कारकों का चयन करने पर, वांछित पैरामीटर के साथ उस प्रयोग को चलाने वाले जहाजों पर प्रकाश डाला जाएगा। संस्कृति स्टेशन के भीतर जहाजों को सही जहाज पर क्लिक करके और वांछित स्थान पर ले जाकर ले जाया जा सकता है ।- काम के पैकेट बनाएं जिन्हें एएमबीआर सेल कल्चर सॉफ्टवेयर में आयात किया जा सकता है। प्रयोगों की संख्या के आधार पर विभिन्न कार्य पैकेट बनाए जाते हैं और आगे के कार्यान्वयन के लिए संग्रहीत किए जाते हैं
- एएमबीआर नियंत्रण लैपटॉप पर बनाए गए काम के पैकेट में प्रयोग का निष्पादन
- प्रयोग टैब में, डीओई सॉफ्टवेयर का उपयोग करके बनाए गए कार्य पैकेट के लिए डीओई प्रयोग बनाएं और ब्राउज़ करें।
- स्टार्टपर क्लिक करके प्रक्रिया शुरू करें।
- प्रायोगिक परिणामों का विश्लेषण
- एक बार प्रयोग निष्पादित हो जाने के बाद, निर्यात डीओई परिणामोंका उपयोग करके डेटा का निर्यात करें। निर्यात डो परिणाम खिड़की खुलती है और संस्कृति पोत और स्टेशन का संकेत पंक्तियों मेज में सूचीबद्ध हैं ।
- वांछित पंक्तियों का चयन करें और सभी परिणामों को संग्रहीत करने और आगे के विश्लेषण के लिए फ़ाइल को बचाने के लिए निर्यात चयनित पंक्तियों या निर्यात प्रयोगात्मक डेटा पर क्लिक करें।
- परिणाम टैब पर स्विच करके और आयात परिणामोंका चयन करके डेटा को एएमबीआर डीओई मॉड्यूल में आयात करें ।
- वांछित डेटा फ़ाइल के लिए ब्राउज़ करें और विश्लेषण परिणामोंपर क्लिक करें।
- मोडे में परिणामों का विश्लेषण करें।
4. स्वचालित माइक्रो-बायोरिएक्टर में खेती का निष्पादन
नोट: उपरोक्त सॉफ्टवेयर में लिखे गए प्रोटोकॉल की मदद से उपयोगकर्ता द्वारा निम्नलिखित चरणों को निष्पादित किया जाता है। कदम उपयोगकर्ता द्वारा किए जाते हैं जब तक कि अन्यथा उल्लेख न किया जाए।
- जहाजों को लोड करना
- एक लैमिनार प्रवाह कैबिनेट के तहत गामा निष्फल संस्कृति जहाजों को खोलें और संस्कृति स्टेशन में ओरिएंट करें जैसा कि चित्रा 2में दर्शाया गया है ।
- क्लैंप प्लेट को 70% इथेनॉल और डबल आसुत पानी से साफ करें। इसके बाद प्लेट को ऑटोक्लेव करें और बर्तन के ऊपर रखें।
- एक रजर प्लेट के साथ क्लैंप प्लेट माउंट, प्रत्येक पिन सुनिश्चित मजबूती से तय किया गया है।
- सरगर्मी विधानसभा पर दोनों stirrer प्लेट और क्लैंप प्लेट कस ।
- माइक्रो-बायोरिएक्टर सॉफ्टवेयर चलाना
- खेती चलाने के लिए धारा 3 में लिखे कार्यक्रम का प्रयोग करें।
- प्रक्रिया टैब में निर्धारित या पूर्ण प्रक्रिया चरणों की कल्पना करें। प्रक्रिया के दौरान खेती के चरणों को बदलें, जैसा कि पहले तरल हैंडलर को रोककर और फिर प्रक्रिया नुस्खा को संपादित करने के लिए आवश्यक है।
- यह सुनिश्चित करने के लिए कि खेती के दौरान कोई अत्यधिक फोमिंग नहीं है, तब तक जहाजों में एंटीफोम जोड़ें। एंटीफोम नियमित रूप से जोड़ा जाएगा, और फोम नेत्रहीन का पता चला ।
- पोत में मीडिया के अलावा
- सिस्टम के निर्धारित डेक में बाँझ मीडिया और जगह के साथ मैन्युअल रूप से माइक्रो-बायोरिएक्टरों के साथ प्रदान की गई 24 अच्छी प्लेट भरें। सुनिश्चित करें कि प्लेट लिखित कार्यक्रम (धारा 3) द्वारा नामित डेक में रखी गई है। पोत का भराव धारा 3.2.2 में डिजाइन किया गया होगा।
नोट: मीडिया और एंटीफोम के अलावा के तुरंत बाद तापमान और उभारा शुरू होता है। सेंसर रीडर पोत भरने के 1 घंटे बाद सक्रिय होता है (स्टार्ट मॉनिटर स्टेप)। पाठक के सक्रिय होने के बाद प्रत्येक पोत को गैसिंग शुरू होती है। मीडिया पीएच पुनर्मूल्यांकन और टीका से पहले कम से कम 6 घंटे के लिए समतुल्य करने के लिए छोड़ दिया है। प्रक्रिया मापदंडों को सॉफ्टवेयर में बदला जा सकता है जैसा कि धारा 3.2.3 में उल्लेख किया गया है।
- सिस्टम के निर्धारित डेक में बाँझ मीडिया और जगह के साथ मैन्युअल रूप से माइक्रो-बायोरिएक्टरों के साथ प्रदान की गई 24 अच्छी प्लेट भरें। सुनिश्चित करें कि प्लेट लिखित कार्यक्रम (धारा 3) द्वारा नामित डेक में रखी गई है। पोत का भराव धारा 3.2.2 में डिजाइन किया गया होगा।
- टीका
- 5बीतने के बाद व्यवहार्य कोशिका एकाग्रता को मापें। यह सुनिश्चित करने के लिए कि सभी जहाजों में प्रारंभिक कोशिका एकाग्रता 3 x 105 कोशिकाएं/mL है, जहाजों को स्थानांतरित करने के लिए कोशिकाओं की संख्या की गणना करें ।
- कोशिकाओं को 24 गहरी अच्छी तरह से प्लेट में स्थानांतरित करें ताकि निलंबन की मात्रा कम से कम 1.6 गुना आवश्यक मात्रा हो। इनोकुलम के 2 mL की आवश्यक मात्रा के लिए, प्लेट में प्रत्येक कुएं में सेल निलंबन के 3.2 mL स्थानांतरित करें।
- 24 अच्छी प्लेट को निर्धारित डेक में रखें। जहाजों को धारा 3.2.4 में टीका लगाया जाएगा।
- दैनिक नमूना और एनालिटिक्स
- तरल हैंडलर का उपयोग करके हर दिन जहाजों से 460 माइक्रोन का नमूना निकालें। फ़िल्टर किए गए 1x पीबीएस बफर (5x कमजोर पड़ने) के 800 माइक्रोन के साथ नमूने का 200 माइक्रोन पतला करें, और फिर सेल काउंटर में रखें।
- 190 x ग्राम और कमरे के तापमान पर 5 न्यूनतम के लिए शेष नमूना अपकेंद्रित्र और आगे के विश्लेषण के लिए सुपरनेटेंट स्टोर (ग्लूकोज, लैक्टेट, ग्लूटामाइन और ग्लूटामेट)।
- प्रोटीन क्वांटिफिकेशन के लिए खेती के अंत तक - 20 डिग्री सेल्सियस पर सुपरनेटेंट के 100 माइक्रोन फ्रीज।
- खेती का अंत
- जब प्रक्रिया पैरामीटर नियंत्रण (यानी, तापमान, आंदोलन, पीएच और डीओ) समाप्त हो गया है, तो प्रक्रिया की निगरानी बंद करें।
- रस्टर प्लेट और क्लैंप प्लेट को अनस्क्रू कर लें।
- संस्कृति के जहाजों को हटाएं और संस्कृति स्टेशनों को साफ करें। सुखाने की प्लेटों को संस्कृति स्टेशनों पर रखें और उन्हें पेंच में रखें।
- इस बीच, 70% इथेनॉल और डबल आसुत पानी के साथ क्लैंप प्लेटों को अच्छी तरह से साफ करें।
- सुखाने चक्र पूरा हो जाने के बाद बायोरिएक्टर सॉफ्टवेयर में स्टॉप पर क्लिक करें।
- सेल संस्कृति फसल
- 50 मीटर अपकेंद्रित्र ट्यूबों में जहाजों की सामग्री को मैन्युअल रूप से हटाकर खेती के 12 दिन पर फसल कोशिकाएं। 30 मिन के लिए 190 x ग्राम पर सेल शोरबा को सेंट्रलाइज किया।
- सेल पैलेट को त्यागें और सुपरनेटेंट को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
5. मैब एकाग्रता को मापना
- खेती चलाने के दौरान प्रोटीन की मात्रा के लिए 1.7 mL प्रोटीन का उपयोग करें।
-
नमूनों को विगलन करने से पहले संतुलन और एलुशन बफर तैयार करें।
- 0.5 एम एनए2एचपीओ4 के समाधान का उपयोग करें जिसमें 7.9 के पीएच के साथ 0.5 एम एनसीएल होता है जिसमें संतुलन बफर और 100 मीटर मीटर ग्लाइसिन का समाधान जिसमें 0.5 एम एनआल का समाधान होता है जिसमें 0.5 एम एनसीएल होता है जिसमें एल्यूशन बफर के रूप में 2 के पीएच के साथ होता है।
- विश्लेषण के लिए रखे जाने से पहले 0.2 माइक्रोन झिल्ली और डेगास के माध्यम से दोनों बफ़र्स को फ़िल्टर करें।
- हौसले से तैयार समतुल्यता बफर के साथ उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमेटोग्राफी सिस्टम (एचपीएलसी) को शुद्ध करें।
- प्रोटीन को एचपीएलसी सिस्टम पर एक कॉलम लोड करें।
- 1 mL/min के प्रवाह दर के साथ क्रोमेटोग्राफी करें। कॉलम ओवन का तापमान 30 डिग्री सेल्सियस और ऑटोसैंपलर तापमान 10 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें
- कमरे के तापमान पर जमे हुए नमूनों को पिघलाएं और 0.22 माइक्रोन पीवीडीएफ झिल्ली के माध्यम से प्रत्येक नमूने के 225 माइक्रोन को फ़िल्टर करें। वांछित प्रोटीन की उच्च एकाग्रता वाले नमूनों को पतला करें, ऑटोसैंपलर में रखने से पहले झिल्ली के माध्यम से संतुलन बफर और फिल्टर के साथ 1:20 अनुपात में हैं।
- नमूनों को ऑटोसैंपलर में रखें। सॉफ्टवेयर में विधि और अनुक्रम लोड करें और अनुक्रम शुरू करें।
नोट: विधि में तीन चरण शामिल हैं (चित्रा 1देखें): पहले दो मिनट के लिए कॉलम में नमूने का इंजेक्शन; इसके बाद 8 मिन के लिए एल्यूशन बफर और 10 मिन के लिए समतुल्यता बफर के साथ कॉलम पुनर्जनन किया गया।
चित्रा 1: प्रोटीन एक क्रोमेटोग्राम, एक ही रन के दौरान विभिन्न चरणों का प्रतिनिधित्व करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
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Representative Results
इस अध्ययन में की गई खेती का अवलोकन चित्र ा 2में प्रस्तुत किया गया है ।
चित्रा 2: संस्कृति स्टेशनों में पीएच और रटर गति प्रोफाइल का परीक्षण करने के लिए प्रायोगिक स्थितियों का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। यह आंकड़ा जहाजों को रखने के लिए सही लेआउट का भी प्रतिनिधित्व करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
स्वचालित माइक्रो-बायोरिएक्टरों में सेल वृद्धि बहु-उपयोग बायोरिएक्टरों के बराबर है। इसे चित्रा 3में दर्शाया गया है । तीन अलग-अलग तराजू से सेल एकाग्रता की तुलना की जाती है और यह देखा गया है कि 15 मिलीलीटर स्वचालित माइक्रो-बायोरिएक्टर 2 एल ग्लास बायोरिएक्टर की नकल करता है। शेक फ्लास्क से परिणाम भी AMBR के लाभ प्रदर्शन के लिए तुलना कर रहे हैं ।
चित्रा 3: विभिन्न पैमानों पर व्यवहार्य कोशिका एकाग्रता की तुलना। 15 एमएल माइक्रो-बायोरिएक्टर, 150 मीटर शेक फ्लास्क, और 2 एल मल्टी-यूज ग्लास बायोरिएक्टर। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
स्वचालित माइक्रो-बायोरिएक्टरों में विभिन्न क्रियाकार गति और पीएच के प्रभाव का अध्ययन किया जाता है। व्यवहार्य सेल एकाग्रता (वीसीसी) खेती की तुलना करने के लिए महत्वपूर्ण मापदंडों में से एक है। चित्रा 4 विभिन्न माइक्रो-बायोरिएक्टरों में वीसीसी और मोनोक्लोनल एंटीबॉडी एकाग्रता की तुलना का प्रतिनिधित्व करता है। चित्रा 5 तुलना के लिए विचार की गई दो प्रतिक्रियाओं के प्रतिक्रिया समोच्च भूखंड का प्रतिनिधित्व करता है, अर्थात्, वीसीसी और एमएबी एकाग्रता। मूल्य एक ही पीएच और विभिन्न क्रियाकार गति के साथ जहाजों में तुलनीय हैं, यह दर्शाता है कि इस प्रक्रिया के लिए चयनित रकोटर गति का प्रक्रिया आउटपुट पर कोई महत्वपूर्ण प्रभाव नहीं पड़ता है। भविष्य की खेती के लिए, फोमिंग से बचने के लिए 1050 आरपीएम की रटर गति का उपयोग किया जाएगा।
पीएच, हालांकि, प्रक्रिया उत्पादन डेटा पर एक विशिष्ट प्रभाव पड़ता है । वीसीसी पर पीएच 6.9 का नकारात्मक प्रभाव चित्र4एमें देखा जा सकता है। पीएच 7.1 की तुलना में पीएच 7.3 में संस्कृति के तहत कोशिकाओं के विकास में काफी सुधार हुआ। चित्रा 5Bमें, विभिन्न खेती की मोनोक्लोनल एंटीबॉडी एकाग्रता की तुलना की जाती है। पीएच 7.3 पर बनाए गए जहाजों में एमएबी का उत्पादन धीमा है; हालांकि, अंतिम उत्पाद एकाग्रता पीएच 7.1 पर बनाए गए पोत के बराबर है।
चित्रा 4: डीओई प्रयोग का परिणाम। (A)खेती की व्यवहार्य सेल एकाग्रता प्रोफ़ाइल संबंधित खेती की स्थिति में फेड-बैच प्रक्रिया पर पीएच और रबड़ की गति(बी)मोनोक्लोनल एंटीबॉडी एकाग्रता प्रोफ़ाइल के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए चलती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 5: प्रतिक्रिया समोच्च साजिश क्रमशः अधिकतम व्यवहार्य सेल एकाग्रता और मोनोक्लोनल एंटीबॉडी पर पीएच और रबड़ की गति के प्रभाव का संकेत देती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
एबीआर का उपयोग करने का एक लाभ खेती की निरंतर निगरानी और नियंत्रण है। पीएच की निगरानी का आंकड़ा 6में देखा जा सकता है । पीएच को सीओ2का उपयोग करके सेट पॉइंट पर नियंत्रित किया जाता है । 3 दिन से बोलस खिला मूल्यों में स्पाइक के लिए जिम्मेदार है।
चित्रा 6: खेती के लिए स्वचालित माइक्रो बायोरिएक्टरों में पीएच निगरानी, पीएच 6.9, 7.1 और 7.3 के सेट अंक और 1050 आरपीएम की एक सरगर्मी गति के साथ। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
भविष्य के परीक्षणों के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रक्रिया मापदंडों को 1050 आरपीएम और 7.1 के पीएच की एक सरगर्मी गति तक संकुचित किया गया था।
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Discussion
जैव दवा उद्योग में उपज बढ़ाने की प्रक्रिया का अनुकूलन महत्वपूर्ण है। शेक फ्लास्क संभवतः तनाव की स्क्रीनिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है; हालांकि, पीएच और डीओ जैसे प्रक्रिया मापदंडों की निगरानी फ्लास्क में अनुपलब्ध है। माइक्रो-बायोरिएक्टरों को एक फायदा होता है क्योंकि वे प्रक्रिया की सतत निगरानी और नियंत्रण की अनुमति देते हैं। माइक्रो-बायोरिएक्टर में ये नियंत्रण लूप भी बड़े पैमाने पर उन लोगों के समान स्थिति प्रदान करते हैं और इस प्रकार, ऐसे परिणाम प्रदान करते हैं जो बड़े पैमाने पर बायोरिएक्टरों के तुलनीय होते हैं। माइक्रो-बायोरिएक्टर का एक और लाभ शर्तों की विस्तृत श्रृंखला है जिसका परीक्षण एक ही समय सीमा के भीतर और कम लागत पर किया जा सकता है जब बेंच शीर्ष बायोरिएक्टरों की तुलना में समय और श्रम12,13 के संदर्भ में। छोटे आकार भी कम चल लागत के मामले में सब्सट्रेट की कम मात्रा और समानांतर आपरेशनों के लिए कम अंतरिक्ष की आवश्यकता के कारण लाभप्रद है; हालांकि, जहाजों की लागत पर विचार किया जाना चाहिए क्योंकि बेंच टॉप मल्टीयूज बायोरिएक्टर की तुलना में एकल उपयोग माइक्रो-बायोरिएक्टरों में खेती चलाना अधिक महंगा हो सकता है।
हालांकि सिस्टम के कई फायदे हैं, लेकिन माइक्रो-बायोरिएक्टरों का उपयोग करने के लिए कुछ काफी नुकसान हैं। एक संस्कृति स्टेशन के भीतर प्रत्येक पोत के लिए पीएच और डीओ बदलना संभव है; हालांकि, एक व्यक्तिगत पोत के लिए रटर गति और तापमान को बदला नहीं जा सकता है। इससे इष्टतम क्रियाकार गति और तापमान स्थापित करने के लिए किए गए प्रयोगों की संख्या बढ़ जाती है। ऑनलाइन माप पीएच और डीओ तक ही सीमित हैं। महत्वपूर्ण प्रक्रिया मापदंडों (सीपीपी), जैसे तापमान, पीएच, डीओ की वास्तविक समय प्रक्रिया निगरानी, नमूना और विश्लेषण के बीच देरी से बचने के लिए फायदेमंद होगी। इसमें उत्पादकता को अनुकूलित करने के लिए एक उपयोगी उपकरण होनेकीक्षमता है । माइक्रो-बायोरिएक्टरों में स्पेक्ट्रोस्कोपिक मापन के क्षेत्र में विकास भविष्य के मॉडलों में फायदेमंद साबित हो सकता है।
इसके फायदे स्वचालित माइक्रो-बायोरिएक्टर का उपयोग करने के नुकसान से पल्ला झाड़ लेते हैं। हालांकि, इन प्रणालियों के संचालन पर विचार करने के लिए कुछ मानदंड हैं। सबसे पहले और सबसे महत्वपूर्ण खेती को सफलतापूर्वक चलाने के लिए स्क्रिप्ट की डिजाइनिंग है। यह महत्वपूर्ण महत्व पूर्ण है कि लिखी गई पटकथा में प्लेट और जहाजों की सही मैपिंग के साथ-साथ प्लेटों की परिभाषा जैसे सभी महत्वपूर्ण कदमशामिल हैं । प्रयोग शुरू करने से पहले सभी मापदंडों की जांच की जानी चाहिए। सुनिश्चित करें कि कोई प्रक्रिया चरण एक ही समय में होने के लिए निर्धारित कर रहे हैं । इसके परिणामस्वरूप वर्कस्टेशन दूसरे पर एक कदम का चयन करेगा।
एक और महत्वपूर्ण कसौटी पर ध्यान केंद्रित किया जाना है क्लैंप प्लेटों का उपयोग है । प्लेटों को हर खेती से पहले स्वचालित किया जाता है; इससे ओ-रिंग्स को नुकसान हो सकता है । नेत्रहीन ऑटोक्लेविंग से पहले ओ-रिंग्स की जांच करें। दोषपूर्ण ओ-रिंग्स के परिणामस्वरूप डीओ और पीएच नियंत्रण में अप्रत्याशित भिन्नता हो सकती है। दोषपूर्ण रीडिंग के लिए अन्य कारक क्लैंप प्लेट और जहाजों के बीच एक ढीला संबंध हो सकता है। सुनिश्चित करें कि क्लैंप प्लेट और रटर प्लेटें सरगर्मी विधानसभा के लिए कसकर सुरक्षित हैं। सिस्टम के साथ प्रदान किए गए कस उपकरण का उपयोग करें।
खेती के दौरान, फोम की नेत्रहीन निगरानी करना महत्वपूर्ण है। खेती की शुरुआत में कम से कम 20 माइक्रोन एंटीफोम की जरूरत होती है। फोमिंग के परिणामस्वरूप क्लैंप प्लेट के गर्त में तरल मौजूद होगा। क्लैंप प्लेट में फोम की अधिकता से ओवरफ्लो हो जाएगा, जिससे फोम संस्कृति स्टेशन के तल पर एकत्र किया जा रहा है, पीएच और डीओ स्पॉट को सेंसर द्वारा पढ़ने के लिए अस्पष्ट कर देगा।
पर ध्यान केंद्रित करने के लिए एक और महत्वपूर्ण कारक डो सॉफ्टवेयर का उपयोग है। एकीकृत डीओई सॉफ्टवेयर संबंधित शर्तों को शामिल करते हुए प्रक्रिया को त्वरित डिजाइन करने में सक्षम बनाता है। उपयोग किए जा रहे जहाजों के दृश्य यह सुनिश्चित करते हैं कि किसी भी कारक की अनदेखी नहीं की गई है । डीओई विश्लेषण के फायदों में से एक यह है कि प्रयोगों को काम के पैकेट के माध्यम से कॉन्फ़िगर किया जा सकता है, प्रत्येक बायोरिएक्टर को परिभाषित बायोप्रोसेसिंग मापदंडों के साथ कॉन्फ़िगर किया जा सकता है। सृजित सभी डेटा का विश्लेषण MODDE का उपयोग करके किया जाता है। सॉफ्टवेयर प्रयोग के दौरान उत्पन्न डेटा की बड़ी मात्रा का प्रबंधन करता है। एक सामान्यीकृत सबसेट डिज़ाइन सेटअप कम डिजाइन सेट का एक अनुक्रम उत्पन्न करता है, जिससे, मल्टीवेरिएट कैलिब्रेशन के साथ समस्या का समाधान होता है।
एक स्वचालित माइक्रो-बायोरिएक्टर में प्रयोग के डिजाइन को चलाने के लिए एक विस्तृत प्रक्रिया इस लेख में प्रदर्शित की गई है। प्रोटोकॉल फ़ीड बैच प्रक्रिया पर ध्यान केंद्रित करने के लिए डिज़ाइन किया गया था। डो सॉफ्टवेयर बायोमास और टिटर एकाग्रता को बढ़ाने के लिए इष्टतम प्रक्रिया मापदंडों की स्थापना में सहायता प्राप्त है। खेती के आंकड़ों की तुलना शेक फ्लास्क और 2 एल बेंच-टॉप बायोरिएक्टर में किए गए प्रयोग से भी की गई । परिणाम प्रक्रिया की प्रजनन क्षमता और स्केलेबिलिटी को प्रदर्शित करते हैं। प्रोटोकॉल का लक्ष्य फीड बैच प्रक्रिया में स्वचालित माइक्रो-बायोरिएक्टरों के उपयोग को प्रदर्शित करना और डीओई सॉफ्टवेयर का उपयोग करके बायोप्रोसेसिंग मापदंडों का विश्लेषण करना था। यह निष्कर्ष निकाला जा सकता है कि स्वचालित माइक्रो-बायोरिएक्टर प्रक्रिया विकास के लिए उपयोगी हैं और इन्हें अर्धजल प्रणाली15तक बढ़ाया जा सकता है।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
लेखक बुंदेसियम फ्यूर बिलडुंग एंड फोर्सचुंग (बीबीएएफ), संघीय शिक्षा और अनुसंधान मंत्रालय, जर्मनी और जर्मनी के सरटोरियस स्टेडिम बायोटेक जीएमबीएच, जर्मनी की बायोप्रोसेसिंग टीम को उनके समर्थन के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL disposable pipette tips, sterilized | Sartorius Stedim Biotech GmbH | A-0040 | |
| 200 mM L-glutamine | Corning, Merck | 25-005-CV | |
| 24 Well deep well plates | Sartorius Stedim Biotech GmbH | A-0038 | |
| 5 mL disposable pipette tips, sterilized | Sartorius Stedim Biotech GmbH | A-0039 | |
| ambr 15 automated microbioreactor system | Sartorius Stedim Biotech GmbH | 001-2804 | |
| ambr 15 Cell Culture 24 Disposable Bioreactors - Sparged | Sartorius Stedim Biotech GmbH | 001-1B86 | |
| Antifoam C Emulsion | Sigma-Aldrich, Merck | A8011 | |
| Bottle Top Sterile filter | Corning, Merck | CLS431474 | 0.1 μm pore size |
| CEDEX Detergent (3% Mucosol) | Roche Innovatis AG | 05-650-658-001 | |
| Cell counter | Roche Innovatis AG | 05-650-216-001 | CEDEX HiRes |
| CHO DG44 cell line | Cellca, Sartorius Stedim Biotech GmbH | ||
| CHOKO Feed Media A (FMA) | Sigma-Aldrich, Merck | CR80025 | |
| CHOKO Feed Media B (FMB) | Sigma-Aldrich, Merck | CR80026 | |
| CHOKO Production Medium | Sigma-Aldrich, Merck | CR80027 | |
| CHOKO Stock Culture Meium | Sigma-Aldrich, Merck | CR80028 | |
| Chromaster high pressure liquid chromatography system | VWR International | ||
| Conical Centrifuge tube | Corning, Merck | SIAL0790 | |
| Ethanol | Merck | 1070179026 | |
| Glycine | Carl Roth | 56-40-6 | |
| HPLC Vials | VWR International | SUPLSU860181 | |
| PBS | Sigma-Aldrich,Merck | P4417 | |
| Protein A Column | Thermo Fisher Scientific | 1502226 | POROS™ A 1.7 mL |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich,Merck | 7647-14-5 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous | Sigma-Aldrich,Merck | 7558-79-4 | |
| Trypan Blue | VWR International | VWRVK940 | |
| YSI | YSI Inc | 2900D | YSI 2900 Select |
References
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