Summary
시험관내 모델 시스템은 폐암 관련 섬유아세포(CAFs)와 3차원(3D) 공동 배양에서 폐 편평상피암(LUSC) 진행 동안 조직 건축 변화를 포착하기 위해 개발되었다. 이 오르가노이드 시스템은 종양 표현형을 조절하는 다양한 종양 세포 본질 및 외인성 변화의 역할을 조사하는 독특한 플랫폼을 제공한다.
Abstract
종양 기질 상호 작용은 폐 편평상피암 (LUSC)의 발달에 있는 중요한 역할을 합니다. 그러나, 이러한 동적 상호 작용이 종양 발생 중에 관찰 된 조직 건축 변화에 기여하는 방법을 이해하는 것은 적절한 모델의 부족으로 인해 도전 남아있다. 이 프로토콜에서는 TUM622로 알려진 LUSC 1차 세포 배양을 사용하여 3D 공동배양 모델의 생성을 설명합니다. TUM622 세포는 LUSC 환자 유래 이종이식(PDX)으로부터 확립되었으며 지하 막 매트릭스에서 파종될 때 acinar와 같은 구조를 형성하는 독특한 특성을 갖는다. 우리는 3D 공동 배양에 있는 TUM622 acini가 LUSC 진행 도중 조직 건축의 중요한 특징뿐만 아니라 LUSC 세포와 종양 미세 환경의 분대 (TME) 사이 동적 상호 작용을, 세포 외를 포함하여 재입증합니다 매트릭스 (ECM) 및 암 관련 섬유 아세포 (CAFs). 또한 주요 3D 배양 프로토콜을 적용하여 이 시스템이 다양한 다운스트림 분석에 어떻게 활용될 수 있는지 보여줍니다. 전반적으로,이 organoid 모델은 암진행 동안 상피 아키텍처의 중단을 촉진하고 도움이 될 세포 내재 및 외인성 메커니즘에 대한 통찰력을 얻을 수있는 생물학적으로 풍부하고 적응 가능한 플랫폼을 만듭니다. 새로운 치료 표적 및 진단 마커에 대한 검색.
Introduction
폐암은 전 세계적으로 암 관련 사망의 주요 원인입니다. 폐 편평 상피 세포 암 (LUSC), 비 소세포 폐암의 두 번째로 일반적인 유형입니다 (NSCLC) 모든 폐암의 약 30 %를 차지, 종종 고급 단계에서 진단하고 가난한 예후를 가지고1. LUSC 환자를 위한 처리 선택권은 LUSC 종양 발생을 구동하는 근본적인 세포 및 분자 기계장치의 더 나은 이해에 의해 향상될 수 있는 중요한 충족되지 않은 필요입니다.
대부분의 인간 암과 마찬가지로, LUSC의 병인은 손상되지 않은, 잘 정렬 된 상피 조직 아키텍처의 붕괴를특징으로한다 2. 이 과정에서 적절한 정점 기저 세포 극성, 세포 세포 및 세포 매트릭스 접촉이 손실되어 종양 세포의 통제되지 않은 성장과 침습적 행동을 허용합니다. 암세포와 이들의 국소 종양 미세환경(TME)3사이의 중요한 상호 작용 없이는 암세포의 악성 특징이 나타날 수 없다는 것이 널리 평가되고 있다. 세포외 매트릭스(ECM), 암 관련 섬유아세포(CAFs) 뿐만 아니라 내피 세포및 침투면역세포를 포함하는 TME의 주요 성분은 TME를 능동적으로 형성하고 종양발생을 유도한다4. 그럼에도 불구하고, 종양 세포와 TME에 있는 이 중요한 분대가 LUSC 진행 도중 조직 건축 변경을 몰기 위하여 상호 작용하는 방법의 우리의 현재 이해는 아주 제한됩니다.
3차원(3D) 배양은 정상 및 병이 있는 조직 모두에서 조직 건축적 변화 조절에 있어 세포 내재 및 외인성 변화의 생물학적 활동을 연구하는 중요한 도구5. 3D 문화권은 전통적인 2차원(2D) 문화권에서 일반적으로 부족한 적절한 구조적 및 기능적 컨텍스트를 제공합니다. 이러한 시스템의 추가된 치수는 증식, 분화, 이동, 단백질 발현 및 약물 치료에 대한 반응을 포함하는 세포 생리학 및 세포 행동의 많은 양상에서 생체 내 조직을 보다 밀접하게 모방한다. 최근 몇 년 동안, 다양한 실험실의 노력은 정상 폐뿐만 아니라 NSCLC6,,7,,8모두에 대한 시험관 내 3D 모델의 개발로 이어졌다. 그러나, 종양 발생 동안 동적 조직 건축 적 변화를 모두 재현할 수 있을 뿐만 아니라 주요 기질 성분을 통합할 수 있는 폐 편평암종에 대한 모델은 사용할 수 없었다.
여기서, 우리는 1차 PDX 유래 LUSC 세포(TUM622)와 CAFs9,,10을사용하여 새로운 3차원(3D) 동문화 시스템을 확립하는 방법을 설명한다. TUM622 및 CAF는 모두 제대로 분화된종양(10)을가진 NSCLC 환자로부터 유래된다. ECM에 단 하나 세포로 매립될 때, TUM622 세포의 희소한 소집단은 적당한 정점 기초 세포 극성을 표시하는 acinar 같이 구조물을 가진 오르가노이드를 형성하는 능력을 가지고 있습니다. 이러한 acinar 같은 구조는 비침습적 남아있는 동안 본래 종양과 유사한 줄기 유사 및 분화 마커의 이질적인 발현을 표시하고, 따라서 LUSC 발달의 초기 단계를 모방한다. 중요한 것은, 우리는 acinar 같이 구조물의 조직 건축이 작은 분자 억제제와 세포 본질적인 신호 통로의 억제에 의해 변경될 수 있었다는 것을 보여주었습니다 또는 CAFs와 같은 ECM에 있는 중요한 분대의 추가, 후자는 acini 대형을 강화하고 더 가까운 근접에 있을 때 침략적이 되기 위하여 acini를 자극합니다. 함께, 이러한 데이터는 LUSC 오르가노이드의 이러한 3D 공동 배양 시스템이 LUSC 세포와 TME 사이의 동적 상호주의의 조사를 위한 귀중한 플랫폼을 제공하고 약물 치료에 대한 LUSC 세포의 반응을 모니터링하기 위해 적응될 수 있음을 시사한다11.
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Protocol
1. 2D 배양에서 TUM622 셀 및 CA를 통과및 배합
- TUM622 셀의 통과 및 배양
- 37°C에서 TUM622 세포에 대한 따뜻한 3D 배양 배지 및 세포 해리 시약(재료 표참조).
- 2D 플라스크에서 80% 동률에서 통로 TUM622 세포. 보통, 이것은 통과 후 1 주 일어난다.
- T75 플라스크에서 오래된 매체를 버리고 HEPES 버퍼 6 mL로 한 번 씻으십시오. 피펫팅을 세포에 직접 대지 마십시오.
- HEPES 버퍼를 흡인합니다. 트립신/EDTA 4 mL(0.25 mg/mL, 재료 표참조)를 추가하여 빠르게 헹구고 트립신/EDTA를 폐기하십시오.
- 트립신/EDTA 2 mL를 추가하고 37°C에서 5분 동안 배양합니다.
참고: 트립신에 장기간 노출되면 세포를 돌이킬 수 없게 손상시키고 표현형을 변경하므로 트립신에 노출되는 시간을 제한하는 것이 좋습니다. - 세포가 가벼운 현미경(4x 또는 10x)으로 분리되고 해리된 지 확인합니다. 4mL의 중화 버퍼(TNS 버퍼)를 추가하고(재료 표의하위 배양 시약 정보 참조) 3D 배양 배지의 10mL(재료 표참조)를 추가합니다.
- 10 mL 파이펫을 사용하여 세포를 더욱 해리시키기 위해 부드럽게 피펫을 위아래로. 40 μm 세포 스트레이너를 통해 현탁액을 50 mL 원점 튜브로 옮니다.
- 혈세포계 또는 자동화 된 셀 카운터를 사용하여 셀 번호를 계산합니다.
- 종자 0.8 x 106 세포/T75 플라스크를 3D 배양 배지의 20 mL에서(재료 표참조).
- 소비된 배지의 절반을 신선한 배지로 대체하여 격일로 세포를 먹이라.
- CA를 통과하고 배양합니다.
- 세포가 합의에 도달할 때 통로 CAFs. 일반적으로, 이것은 1:2 분할에서 배양 5 일 후에 생깁니다.
- RPMI 기저 배지를 사용하여 20% 열 불활성화 태아 소 혈청, 1% L-글루타민 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 사용하여 CAF 배지를 준비합니다. 매체를 37°C로 데운다.
- T75 플라스크에서 인산완식염수(PBS)로 CAF를 헹구고 트립신/EDTA 2mL를 넣고 37°C에서 5분 동안 배양합니다.
- 요정 현미경으로 관찰하여 세포가 플라스크(4x 또는 10x)에서 해리되었는지 확인합니다. 그렇지 않은 경우, 또 다른 2-3 분 동안 배양을 연장하십시오.
- 일단 세포가 분리되고 해리되면, 트립신/EDTA를 중화시키고 파이펫을 위아래로 여러 번 하여 CA를 더욱 해리시키기 위해 3D 배양 배지 10 mL를 추가하십시오.
- 셀 서스펜션을 50 mL 원유 관으로 옮기고 실온에서 5 분 동안 300 x g에서 아래로 돌십시오.
- 상급체를 버리고 펠릿을 적절한 부피의 3D 배양 배지(재료 표참조)로 재중단하고 두 개의 새로운 T75 플라스크로 통과시다.
2. 3D 배양을 위한 세포외 매트릭스의 TUM622 세포 도금
- 실험 전날, 지하 멤브레인 매트릭스의 바이알을 밤새 4°C 냉장고에서 해동한다. 재사용 대기시간 플라스틱 파이펫(2mL)과 팁을 -20°C에서 하룻밤 동안.
참고 : 모든 지하 멤브레인 매트릭스가 TUM622 세포의 3D 성장을 지원하는 동일한 용량을 가지고 있는 것은 아닙니다. 따라서 견고한 아시니 형성을 지원하는 매트릭스를 식별하기 위해 여러 개의 지하 멤브레인 매트릭스를 획득하고 테스트할 필요가 있습니다. 일반적으로, 이것은 매트릭스에 있는 더 높은 단백질 농도 (16-18 mg/mL)를 요구합니다. - 실험 당일, 따뜻한 3D 배양 배지, HEPES 완충제, 트립신/EDTA 및 트립신 중화 완충제(TNS)를 37°C 수조에서. 문화를 설정하기 직전에, 냉장고에서 해동 된 지하실 멤브레인 매트릭스를 꺼내 얼음에 유리병을 넣습니다.
- 얼음 위에 놓인 금속 플랫폼 쿨러의 조직 배양 판을 쿨다운합니다. 얼음 에 금속 냉각 랙에 원심 분리튜브를 놓습니다.
- 1.1.7단계에서 얻은 TUM622 셀을 사용하여 도금에 필요한 원하는 셀 수를 계산합니다. 전형적으로, 15,000-30,000개의 세포는 24웰 플레이트의 우물 당 필요합니다. 낮은 밀도는 화상 진찰과 정량화에 더 적합하지만 RNA 추출 또는 서쪽 블로팅을 위한 세포를 수집할 때 더 높은 밀도가 선호됩니다.
- 냉각 된 원심 분리튜브 (삼중 도금용 세포를 포함하는 각 튜브)로 세포 현탁액을 옮기고 4 °C에서 4 °C에서 300 x g에서 5 분 동안 회전시다.
- 여과되지 않은 팁 (20 μL)에 부착 된 흡인 피펫으로 상급을 조심스럽게 흡인하여 튜브에 약 100 μL의 매개체를 남깁니다 (튜브에 표시를 가이드로 사용).
- 튜브 측면을 가볍게 두드려 펠렛을 빼내고 분리한 후 냉각 랙으로 되돌릴 수 있습니다.
- 2 mL 미리 냉각 된 파이펫을 사용하여 유리병이 얼음과 접촉하는 동안 몇 번 위아래로 파이펫팅하여 매트릭스를 부드럽게 혼합합니다. 이 절차 중에 기포가 매트릭스에 유입되지 않도록 균일하고 중간 속도로 파이펫을 보펫합니다.
- 매트릭스의 적절한 부피를 각 원심분리기 튜브로 옮김. 24웰 플레이트의 도금 삼중체의 경우 각 튜브에 1.1mL의 지하 멤브레인 매트릭스를 추가합니다.
- 미리 냉각된 팁을 사용하여 각 튜브의 매트릭스를 약 10회 위아래로 파이펫하여 균일한 셀 서스펜션을 만듭니다.
- 310 μL의 셀/매트릭스 현탁액을 미리 냉각된 24웰 플레이트의 각 웰에 전달합니다. 파이펫은 플레이트 표면에 90° 각도로 배치되고 현탁액은 웰의 중심에 추가됩니다. 서스펜션은 플레이트를 기울일 필요 없이 전체를 넓이고 덮어야 합니다.
- 다운스트림 면역형광 분석을 용이하게 하기 위해 세포/매트릭스 현탁액을 2웰 챔버 슬라이드로 병렬로 플레이트합니다. 100 μL의 셀/매트릭스 현탁액을 2웰 챔버 슬라이드의 중앙으로 옮니다(재료 표참조). 이렇게 하면 행렬이 훨씬 작은 볼륨을 가진 돔과 같은 구조를 형성할 수 있습니다.
- 플레이트와 챔버 슬라이드를 다시 조직 배양 인큐베이터로 되돌리고 매트릭스가 응고될 수 있도록 30분 동안 배양한다. 경현미경 으로 플레이트/슬라이드를 검사하여 단일 세포가 매트릭스(4x 또는 10x) 내에 고르게 분포되어 있는지 확인합니다.
- 미리 온난한 3D 배양 완전 배지 1 mL을 각각의 웰에 넣고 3D 배양 배지의 1.5 mL를 챔버 슬라이드의 각 웰에 추가한 다음 인큐베이터로 되돌려 보도록 하였다.
3. 세포외 기매트릭스에서 TUM622 세포 및 CA의 3D Coculturing
- 섹션 2에 따라 TUM622 및 CAF의 셀 현탁액을 준비합니다.
- 10 μL의 세포 현탁액을 취하고 10 μL의 트리판 블루와 혼합하여 CAF 세포 밀도를 계산합니다.
- 셀 밀도를 계산하고 계산하기 위해 혈강계에 있는 두 챔버 각각에 혼합물 10 μL을 추가합니다.
참고: CAF는 불규칙한 모양을 가지며 자동 셀 카운터에서 정확하게 계산되지 않을 수 있습니다. - 지하 멤브레인 매트릭스에 TUM622 셀 및 CAF 공동 포함
- 셀 밀도 정보를 기반으로 도금에 사용되는 원하는 셀 수를 계산합니다. CA는 TUM622 셀의 2:1 비율로 시드됩니다. 예를 들어, 30,000 개의 TUM622 셀 시드의 경우 60,000 개의 CAF가 공동 포함됩니다.
- TUM622와 CAFs 셀 현탁액의 적절한 부피를 동일한 원심분리기 튜브로 옮기고 24웰 플레이트에 도금을 하기 위한 2.5-2.11 단계를 따릅니다. 면역형광의 경우, 2.12단계에서 설명한 바와 같이 TUM622/CAF의 60 μL을 챔버 슬라이드로 이송한다.
- 지하 멤브레인 매트릭스에 오버레이 된 CA를 가진 TUM622 연공 (재료 표참조)
- 단계 2.5-2.13에 따라 TUM622 모노 배양설정을 설정합니다.
- CAFs 서스펜션의 수를 두 배로 전송 (TUM622 세포 시드의 수에 비해) 원심 분리 튜브에 실온에서 5 분 동안 300 x g에서 아래로 회전.
- 상판을 흡인하고 3D 배양 배지의 1 mL에서 CAF를 재중단한다.
- 삽입된 TUM622 셀을 포함하는 웰에 1 mL의 CAFs 현탁액을 전송한다.
4. RNA/단백질 추출 및 형광 활성화 세포 선별을 위한 TUM622 아시니 수확 (FACS)
- 전날 3D 셀 수확 키트 프로토콜에 따라 세척 버퍼 및 세포 수확 버퍼를 준비하고 4°C에서 밤새 식힙니다.
- 추출 과정을 시작하기 전에 플레이트 쿨러 및 기타 시약에 얼음을 보관하십시오.
- 매트릭스를 건드리지 않고 3D 배양 우물에서 배지를 흡인하고 1 mL의 세척 버퍼로 3 회 부드럽게 세척하십시오.
- 최종 세척을 흡인하고 각 우물에 1 mL의 세포 수확 버퍼를 추가합니다.
- p1000 파이펫 팁을 사용하여 각 우물의 매트릭스를 긁어냅니다.
- 매트릭스를 더 해리하기 위해 위아래로 파이펫을.
- 혼합물의 1 mL을 미리 냉각된 15 mL 원추형 튜브로 옮니다. 동일한 우물에 수확 버퍼의 또 다른 1 mL을 추가합니다.
- 4.5-4.7 단계를 반복하고 동일한 웰의 모든 혼합물을 하나의 15 mL 원뿔 형 튜브로 옮김을 옮김을 옮김을 반복합니다.
- 튜브와 바위를 4°C에서 30분 동안 캡합니다.
- 각 튜브에 최대 10 mL의 얼음 차가운 PBS를 채운 다음 4 °C에서 5 분 동안 300 x g에서 원심 분리기를 채웁니다.
- 펠릿을 건드리지 않고 상월체를 흡인합니다. 상판은 매트릭스 조각을 포함해야하지만, 스페로이드는 모두 튜브의 하단에 수집되어야한다.
- 두 번째 세척을 위해 얼음으로 차가운 PBS를 추가하십시오. 펠릿을 해리하기 위해 튜브를 몇 번 반전시다. 300 x g에서 5분 동안 스핀다운합니다.
- 회전하는 동안 단백질 및 RNA 수집을 위해 용해 완충액을 준비하십시오.
- 조심스럽게 상류를 흡인하고 단백질 또는 RNA를 수집하기 위해 다운스트림 처리를위한 용해 버퍼를 추가합니다. 또는 흐름 분석/FACS 정렬 또는 직렬 전달을 위해 셀을 다시 중단할 수 있습니다.
5. TUM622 아시니의 면역 형광
- 면역형광 완충제 준비 (IF 버퍼 : 0.1 % 소 혈청 알부민 (BSA), 0.2 % 트리톤 X-100 및 0.05 % 트웬-20), 기본 차단 버퍼 (10 % 염소 혈청IF 버퍼), 보조 차단 버퍼 (20 μg / mL 염소 안티 마우스 를 가진 기본 차단버퍼)
- 2 웰 챔버 슬라이드에서 배지를 흡인, PBS로 한 번 헹구고 얼음에 금속 판 쿨러에 슬라이드를 설정합니다. 챔버 슬라이드는 프로토콜의 나머지 부분에 대한 금속 판 쿨러에 남아 있어야합니다.
- 미리 차가운 4% PFA를 추가하여 아시니를 고치고 얼음에 20분 동안 배양합니다.
- 4% PFA를 제거하고 로커에 부드럽게 흔들어 5 분 동안 미리 차가운 PBS 2 mL로 세 번 씻어.
- PBS를 흡인하고 20 분 동안 PBS (사전 냉각)에서 0.5 % 트리톤 X-100의 1.5 mL로 투과합니다. 이 절차가 끝나면 돔과 같은 구조가 느슨해집니다.
- 샘플 손실을 방지하기 위해 챔버 슬라이드에서 투과 버퍼를 부드럽게 흡인합니다. 이것은 흡인 파이펫에 미세 한 팁 (20 μL)을 추가하고 챔버의 모서리를 향해 팁을 눌러 달성된다.
- 로커에 부드러운 흔들림으로 5 분 동안 미리 차가운 PBS 2 mL로 세 번 씻어.
- 1 시간 동안 얼음에 기본 차단 버퍼로 샘플을 차단합니다.
- 기본 차단 버퍼를 제거하고 보조 차단 버퍼를 추가하고 30분 동안 차단합니다.
- 1차 차단 버퍼에 1차 항체를 추가하고 4°C에서 밤새 배양한다.
참고: 여기에서 사용되는 항체의 농도는 2D 배양에서 세포를 염색하기 위해 일반적으로 사용되는 것보다 더 높아야 합니다. 본 연구에서 사용된 1차 항체의 대부분은 1:100 희석(물질 표참조)에서 희석된다. - 1 차 항체를 제거하고 차가운 IF 버퍼 2 mL로 샘플을 3 회 세척하십시오.
참고 : 샘플이 느슨할 수 있으며, 호흡 할 때 각별한주의를 기울이십시오. - RT에서 1 시간 동안 1 차 차단 버퍼에서 희석 된 이차 항체에서 샘플을 배양합니다. 바람직한 이차 항체는 배경 염색을 감소시키기 위하여 높게 교차 흡착되어야 합니다. 이 연구에서 사용된 대부분의 이차 항체는 1:200 희석에서 희석됩니다.
- 이차 항체를 제거하고 차가운 IF 버퍼 2 mL로 샘플을 3 회 세척하십시오.
참고 : 샘플이 느슨할 수 있으며, 호흡 할 때 각별한주의를 기울이십시오. - 마지막 세척 중에 DAPI(1:1,000 희석)로 PBS를 추가하여 핵을 염색합니다. PBS에서 또 다른 2 세안 수행.
- 3 일 이내에 공초점 현미경에 샘플을 이미지.
참고: 오르가노이드의 크기와 목표의 작동 거리의 한계로 인해 샘플은 일반적으로 10배 또는 20배 배율로 이미지화됩니다.
6. 면역항암화학용 3D 배양 시료 준비
- 2 웰 챔버 슬라이드에서 배지를 흡인하고 PBS로 한 번 헹구십시오.
- 3D 배양액을 밤새 37°C에서 4% PFA로 수정합니다.
- 4% PFA를 제거하고, 2.5 mL의 물톨로지 샘플 젤로 서라운드 배양(재료 표참조)을 제거하고 슬라이드를 4°C에서 배치하여 적어도 1시간 동안 고화시도록 합니다.
- 조직학적 샘플 겔로 둘러싸인 샘플을 조직 카세트로 옮기고 밤새 자동화된 조직 샘플 프로세서에서 처리하였다.
- 파라핀 왁스에 샘플을 포함하고섹션 12를준비합니다.
7. 화합물 스크리닝을 위한 3D 세포 독성 분석 (96웰 플레이트 1개에 대한 예)
- 실험을 시작하기 전에 플레이트 쿨러에 96웰 플레이트, 저수지 냉각기의 25mL 저장소, 얼음에 15mL 원추형 튜브를 놓습니다.
- 세포에 지하 막 매트릭스의 적절한 부피를 추가하여 미리 냉각된 15 mL 폴리프로필렌 원소 튜브에서 TUM622 세포의 세포 매트릭스 현탁액을 준비합니다. TUM622 세포에 대한 원하는 밀도는 지하 막 매트릭스의 70-75 μL 당 10,000 세포입니다. 매트릭스 내에서 셀을 혼합할 수 있도록 몇 번 위아래로 피펫을 피펫.
- 이송 중에 지하 멤브레인 매트릭스와 얼음이 접촉하지 않도록 얼음에서 멀리 떨어진 저수지 쿨러로 플레이트 쿨러와 저수지로 플레이트를 이동합니다.
- 기포를 생성하지 않고 매트릭스 셀 혼합물을 냉각 저장소로 옮니다.
- 기계적 다중 채널 파이펫 (10-300 μL)을 사용하여 혼합 셀의 70-75 μL을 96 웰 플레이트의 각각적절한 웰로 이송합니다.
- 37°C및 5%CO2에서 30분 동안 배양플레이트를 고화시키기 위해 지하 막 매트릭스를 위해.
- 모든 행에 100 μL의 용지를 추가하고 플레이트를 인큐베이터에 반환합니다.
- 실험의 목표에 따라 다음 날 또는 나중에 화합물 을 분지 시작.
- 스페로이드는 최대 10일 동안 2-3일마다 재공급및 다시 투약할 수 있으며, 8-12웰 진공 매니폴드로 소비된 매체를 제거하고 원하는 화합물의 유무에 관계없이 신선한 매체로 대체할 수 있습니다.
- TUM622 스페로이드의 수는 제조업체의 프로토콜에 따라 3D 이미저를 사용하여 정량화 될 수 있습니다.
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Representative Results
2D 문화안의 TUM622 및 CAF
도 1은 2D 배양에서 TUM622 세포 및 CAF의 전형적인 형태를 제시한다. TUM622 세포는 큰 핵으로 반올림되고 CA는 평평하고 길쭉합니다. TUM622 세포는 배양에서 80%-90% 합류에 도달할 수 있습니다. 추가 증식은 더 많은 리드, 하지만 작은 세포 직접 접촉으로 오지 않는 식민지에서 집계. 대조적으로, CA는 더 높은 세포 밀도에서 증가하는 것을 선호하고 충분한 양분이 제공되는 경우에 가득 차있는 confluency에서 증식하는 것을 계속할 것입니다.
3D EC M에서 TUM622 아시니의 성장 및 형태M
도 2는 3D 배양물에서 시드된 TUM622 세포의 시간 코스 실험을 제시한다. 데이터는 단 하나 TUM622 세포가 포함될 때 acinar 같이 형태학을 가진 오르가노이드를 형성할 수 있다는 것을 보여줍니다. 5일과 7일 사이에, 루멘은 아시나르와 같은 구조에서 명백해지고 그 후에는 공허하게 남아있다(그림 2A). 중공 루멘을 둘러싼 세포의 단층으로 구성된 각 acinus는 생체 내 폐 상피의 것과 유사한 적절한 정점 기저 극성을 표시합니다(그림 2B). 이 acinar 같이 구조물은 hyperplastic이고 충분한 양분이 제공되는 한 계속 증가하는 것을 입니다. 배양은 ECM이 완전히 분해되기 전에 최대 24일 동안 유지될 수있다(도 2C). 희석 분석 분석(LDA)(데이터가 표시되지 않음)을 제한함으로써 TUM622 세포의 드문 하위 집단만(&0.02%)으로 추정됩니다. acinar 같은 구조를 형성 할 수있는 능력을 가지고9.
TUM622-CAF의 성장과 형태학
그림 3은 TUM622-CAF 공동문화의 설정 및 대표적인 결과를 도시한다. CA는 매트릭스 위에 오버레이하거나 TUM622 셀과 공동 으로 삽입하여 공동 배양에 통합 될 수 있습니다. 설정에 관계없이, CAF의 존재는 형성된 스페로이드의 수와 크기를 크게 향상시켰습니다(그림3B). 흥미롭게도, TUM622 아시니가 CAF와 근접할 때, 그들은 아시니가 침략적이 되어 CAF로 이동하도록 유도하여 구조와 같은 "눈물 방울"을 형성합니다(그림 3C). 단일 문화권의 TUM622 acini는 침략적인 행동을 표시하지 않으며 CA에 가까우면 구조와 같은 "눈물 방울"만 형성합니다.
대표적인 면역형광 및 면역성화학 염색 결과
도 4는 배양 후 10일 후 TUM622 아시니의 면역형광 및 면역히스토화학 염색으로부터의 대표적인 결과를 나타낸다. 공초점 이미지는 TUM622 아시니(도4A)의면역형광체의 적도 평면에서 촬영하였다. 대조적으로, 면역성화학 샘플로부터의 각 단면도는 상이한 평면에서 아시니를 포획할 수있다(도 4B). 두 결과 모두 각 acinus 내의 줄기 같이 및 분화한 세포의 이질적인 표현을 보여주었습니다.
WNt 통로 억제제에 의한 TUM622 3D 세포독성 분석
도 5는 XAV939로 처리된 TUM622 아시니의 투여량-반응을 나타내며, 탱키라제 억제제(도5A,B)를나타낸다. XAV939는 도금 후 1일 당 배양에 첨가되고 2일마다 총 10일 동안 새로 고침되었다. 실험이 끝나면, 아시니의 수는 이미저에 의해 정량화되었다. 더 높은 배율에서의 브라이트필드 이미지는 또한 XAV939 처리된 웰에 비해 제어에서 스페로이드의 형태를 포착하기 위해 획득되었다(그림5C). 전반적으로, XAV939는 아시니 형성에 대한 용량 의존적 억제를 표시하고 형성된 스페로이드의 조직 구조를 변화시킵니다. 이러한 결과는 TUM622 acinar 형태 형성 동안 정식 Wnt 경로의 활성화가 필요하다는 것을 시사한다.
그림 1: 2D 문화어의 TUM622 및 CAF. 2D로 배양된 TUM622 세포 및 CAF의 대표적인 밝은 필드 이미지. 배율 막대 = 100 μm. 이 그림은 Chen et al.9에서 수정되었으며 허가하에 사용되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 3D ECM에서 TUM622 아시니의 성장 및 형태. (A)10일 동안 지하 막 매트릭스에서 배양된 TUM622 세포의 시간 과정 이미지. 스케일 바 = 100 μm.(B)TUM622 아시니의 면역 형광은 정점 기저 세포 극성 마커, 골지 효소 (GM-130, 녹색, 정점) 및 인테그린 알파 6 (CD49f, 기저, 빨간색)으로 염색되었습니다. (C)24일 동안 배양된 24웰 플레이트에서 삼중도금된 아시니수(오른쪽 y축, 적색)와 아시니(좌측 y축, 청색)의 평균 크기를 정량화한다. 오류 막대는 SD를 나타냅니다. 이 그림은 Chen et al.9에서 수정되었으며 허가하에 사용되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: TUM622-CAFs 의 성장 및 형태학. (A)TUM622-CAFs 의 설정의 개략도면 CA는 ECM의 TUM62 셀과 오버레이되거나 공동 으로 삽입됩니다. 동배양에서 6-12일 후에, TUM622 세포는 모노 배양에 비해 점점 더 큰 아시니를 형성하고 CAF와 가까운 근접 및 직접 접촉시 ECM을 침범할 수 있다. 침략적인 표현형은 공동 문화권에서만 관찰될 수 있었다는 점에 유의하십시오. (B)8일 후 오버레이된 CA의 존재 또는 부재 시에 TUM622 3D 배양물의 브라이트필드 이미지. 스케일 바 = 200 μm.(C)CA에 관계없이 공동 배양에서 형성되는 눈물 방울 모양의 아시니를 보여주는 브라이트필드 이미지는 ECM에 오버레이되거나 공동 으로 매립된다. 배율 막대 = 200 μm. 이 그림은 Chen et al.9에서 수정되었으며 허가하에 사용되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: 대표적인 면역형광 및 면역성화학 염색 결과. (A)줄기 / 전구 세포 (CXCR4 및 SOX2), 중간 엽 (Vimentin), 상피 분화 (인볼루크린), 사멸 (Cleaved-Caspase-3) 및 증식 (Ki67)의 마커가있는 아시니의 항체 염색은 녹색, 파란색의 DAPI, E-cadherin. 스케일 바 = 50 μm.(B)TUM622 아시니의 FFPE 절편에서 면역 히스토화학. 배율 막대 = 100 μm(위쪽) 및 50 μm(아래쪽). 이 그림은 Chen et al.9에서 수정되었으며 허가하에 사용되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 5: WNt 통로 억제제등을 이용한 TUM622 3D 세포독성 분석. (A)TUM622 세포가 디메틸 설폭사이드(Control) 또는 XAV939로 처리된 96웰 플레이트에서 스페로이드 수치를 정량화하였다. 각 조건은 삼중으로 분석됩니다. 오차 막대는 SD.(B)아시니 형성에 대한 XAV939의 억제 효과를 보여주는 이미저로 촬영한 24웰 플레이트의 전체 웰 이미지를 나타낸다. (C)XAV939 치료에 의한 형태학적 변화를 보여주는 대조군 대 처리웰의 대표적인 브라이트필드 이미지. 배율 막대 = 100 μm. 이 그림은 Chen et al.9에서 수정되었으며 허가하에 사용되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
종양은 ECM 내의 암 관련 섬유아세포, 내피 세포 및 면역 세포와 같은 기질 세포와 나란히 존재하는 암세포로 구성된 이기종 조직이다. 함께, 이러한 다양한 구성 요소는 교차 이야기와 종양 미세 환경에 영향을, 종양 발생을 구동에 적극적인 역할을, 종양 아키텍처에 있는 점진적인 변화를 수반하는 프로세스. 이상적으로, 종양 발달의 시험관내 모델은 생체 내에서 인간 종양에서 관찰되는 동적 조직 건축 적 변화를 포착할 수 있어야 하며, 종양 미세 환경 내에서 다양한 세포 유형의 복잡한 상호 작용을 동시에 허용할 수 있어야 한다. 종양 세포와 TME의 구성 요소 모두에 대한 실험 적 조작. 최근 몇 년 동안 3D 암 모델에서 많은 진전이 있었지만, 이러한 모델은 LUSC에 쉽게 나오지 않았습니다. 현재까지 보고된 대부분의 모델에는 이러한 중요한 기능의 몇 가지 측면만 포함됩니다. 여기에서 우리는 LUSC 발달 도중 관찰된 중요한 조직 건축 변경뿐만 아니라 종양 세포와 TME의 주요 분대 사이 동적 상호 작용을 동시에 포착하는 LUSC의 3D 공동 배양 시스템을 위한 방법을 보고합니다, ECM 및 CAF.
조직 건축 변화를 보다 정확하게 모델링하는 이 시스템의 능력은 3D EC에 내장될 때 아시나 유사 형태와 함께 오르가노이드를 형성하는 TUM622 세포의 고유한 특성을 기반으로 합니다. 자가 갱신 단세포에서 형성된 각 acinus는 중공 루멘을 둘러싼 세포의 단층으로 구성됩니다. 세포의 이 단층은 상피 기저 세포 극성을 전시하고 폐 상피의 조직 건축을 닮은 비침습적 남아 있습니다. TUM622는 3D 모노 배양으로 하이퍼 플라스틱 성장을 표시하는 동안, CAFs의 추가는 더욱 acinar 형태 형성을 강화하고 형성하기 위하여 더 큰 acini를 유도합니다. 중요한 것은, CAF는 두 세포 모형이 가까운 근접에 올 때 TUM622 세포에 있는 동적 조직 건축 변경을 호출합니다, TUM622 세포가 그들의 정점 기저 극성을 분실하고 CAFs를 향해 매트릭스를 침입하는 것을 허용하. 이 현상형 변경은 LUSC의 초기 증식 뿐만 아니라 후기 침략적인 단계 둘 다 되풀이합니다.
각 스페로이드가 많은 세포의 응체에 의해 형성되는 많은 종양 스페로이드 모델과는 달리, 각 TUM622 acinus는 단일 세포9로부터유래된다. 체외 LDA에 의해, 그것은 단지 작은 소집단것으로 추정된다 (≤0.02%) TUM622 셀의 용량9. 비록 드문, 이 세포는 3D에 있는 연속적인 통과를 겪기 위하여 그들의 수용량에 의해 입증된 것과 같이 각자 갱신할 수 있었습니다 뿐만 아니라 본래 종양의 그것과 유사한 세포의 이기종 인구로 분화할 수 있었습니다. TUM622 셀의 이 독특한 기능으로 인해 성공적인 배양 및 다운스트림 분석을 위해 도금 시 ECM 내에서 단일 TUM622 셀을 균등하게 분포하는 것이 중요합니다. 이 목표를 달성하기 위해 적절한 시드 밀도의 결정, 세포와 매트릭스의 혼합 중에 모든 도구와 시약을 냉각시켜 조기 응고를 방지하고 혼합 공정 중에 기포가 도입되는 것을 방지하고 배양 배지를 추가하기 전에 매트릭스가 완전히 고형화할 수 있는 충분한 시간을 허용하는 등 프로토콜에서 몇 가지 핵심 사항을 신중하게 따라야 합니다. 함께, 이러한 예방 조치는 모든 임베디드 세포에 대한 보다 균일한 매트릭스 기판 및 배양 조건을 달성하는 데 도움이 될 것이다.
일단 성공적으로 확립되면, 이 배양은 종양발생을 조절하는 세포 및 생화학적 과정을 해부하기 위해 다양한 다운스트림 분석에 사용될 수 있다. 각 웰에서 형성된 아시니의 수와 크기는 밝은 필드 이미저와 함께 시간이 지남에 따라 모니터링될 수 있으며 TUM622 셀의 증식 및 자체 갱신 용량에 대한 판독으로 사용할 수 있습니다. 각 acinus의 형태 형성에 있는 더 상세한 역학은 다양한 표지 염료의 유무에 관계없이 공초점 현미경에 살아있는 화상 진찰로 관찰될 수 있었습니다. 컨디셔닝된 배지는 세포 세포 또는 세포 매트릭스 교차 회담을 중재할 수 있는 수용성 인자를 분석하기 위한 배양 기간 동안 여러 시점에서 수집될 수 있다. 프로토콜 4를 사용하여 ECM로부터 직접 추출된 TUM622 세포는 세포 표면 마커에 기초한 유전자 발현 분석, 유량 세포분석 정량화 또는 FACS 선별을 위한 RNA 및 단백질 추출에 적합하다. 대안적으로, 배양은 다양한 마커의 공간-측두분포 분포를 이해하기 위해 구내 면역형광 또는 면역히스토화학 연구에서 고정될 수 있다. 유사하지만, 면역성 화학은 공초점 목표의 영상 깊이 제한으로 인해 불가능할 수 있는 전체 아시니의 샘플링을 허용한다는 점에서 면역형광 방법을 보완한다. 이 두 방법 모두에 대해, 특히 TUM622 세포가 조밀한 매트릭스(>90% 지하 막 매트릭스)에 내장되어 있는 다른 많은 3D 배양물과 는 대조적으로 고정 및 투과가 수행되는 시간과 온도가 중요합니다. 매트릭스 밀도가 훨씬 낮습니다. 따라서 복제 결과를 얻으려면 표준화되고 일관된 고정 및 처리에 주의해야 합니다.
플랫폼으로이 시스템을 사용 하 여, 하나는 종양 세포에 세포 본질적인 변화, 종양 미세 환경에서 세포 외적 변화 뿐만 아니라 조사 할 수 있습니다., 상피 아키텍처에 영향을 미치는 고 암 종 형성에 관련 된 초기 이벤트를 모델. 예를 들어, 종양 조직 구조를 조절하는 종양유전자 또는 종양 억제유전자의 역할은 종양 세포에서 관심 있는 유전자를 표적화하는 이득-또는 기능 상실 실험에 의해 연구될 수 있다. 실제로, 우리는 LUSC에서 일반적으로 관찰되는 SOX2의 과발현이 3D에서 증식의 손실과 이형성성장으로의진행에 의해 입증된 바와 같이 TUM622 세포의 표현형을 변화시키는 것을 입증했습니다 9. 다른 한편으로는, 하나는 동문화 조정에 있는 정상 대 암 관련 섬유아세포를 비교할 수 있고, 매트릭스 분대 또는 그것의 뻣뻣함 충격 acini 성장/형태학/침략을 결정하고, 특정 사이토카인을 막는 경우에 세포 통신을 방해하고 차례차례로 조직 건축 및 종양 진행에 영향을 미칠 수 있었습니다. 중요하게도, 이들 모든 실험은 특정 치료제의 존재 또는 부재에서 수행될 수 있고 다차원판독(11)을이용한 LUSC 세포의 약물 반응을 결정하는 도구로 사용될 수 있다. 또한 이 시스템은 배양에서 TUM622 오르가노이드의 성장 및 형태를 조절하는 일부만하지만 모든 주요 신호 경로가 아닌 일부만 이에 사용될 수 있는 경로에 관하여 제한적이라는 점에 유의하는 것이 중요하다(즉, Wnt의 억제하지만 노치 신호는 TUM622 세포의 acinar mophogenesis에 영향을 미치지않음). 9.
요약하면, 우리는 이 오르가노이드 시스템이 종양 진행 동안 LUSC 세포와 종양 미세 환경 사이의 동적 상호 작용에 대한 새로운 통찰력을 생성하기 위한 독특한 플랫폼을 제공한다는 것을 보여줍니다. 우리는 우리의 모델 시스템이 신약 발견 및 개발을위한 가치있는 플랫폼이 될 것으로 기대합니다. 이러한 점에서, 원어민 종양 조직 맥락에서 신규 한 항암 치료제를 선별하는 것은 LUSC를 표적으로 하는 보다 효과적인 치료제의 선택 및 개발에 도움이 되어야 한다.
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Disclosures
저자는 화이자 의 직원과 주주입니다.
Acknowledgments
우리는 병리학/조직학 지원을 위한 화이자-종양학 조직 병리학 및 Biomarker 그룹의 Magali Guffroy, 존 Kreeger 및 스테파니 비술코에게 감사하고 원고의 비판적인 검토를 위한 마이클 아렌스만. 우리는 또한 화이자 박사 후 프로그램과 종양학 R & D 그룹, 특히 로버트 아브라함, 푸자 사프라, 카렌 위드빈과 제니퍼 테제다 프로그램의 지원에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bronchial Epithelial Growth Medium | Lonza | CC-3170 | BEGM |
| Cell Strainer 40um | ThermoFisher | 352340 | For passing TUM622 cells |
| Cleaved Caspase 3 antibody | Cell Signaling Technology | 9661 (RRID:AB_2341188) | Rabbit |
| CoolRack CFT30 | Biocision | BCS-138 | For 3D culture |
| CoolSink XT96F | Biocision | BCS-536 | For 3D culture |
| Cultrex 3D Cell Harvesting Kit | Bio-Techne | 3448-020-K | |
| Cultrex (preferred for co-culture) | Bio-Techne | 3443-005-01 | For 3D culture |
| CXCR4 antibody | Abcam | Ab124824 (RRID:AB_10975635) | Rabbit |
| E-cadherin antibody | BD Biosciences | 610182 (RRID:AB_397581) | Mouse |
| GelCount | Oxford Optronix | For Acini counts and measurements | |
| GM130 antibody | BD Biosciences | 610822 (RRID:AB_398141) | Mouse |
| Goat Serum | Vector Labs | S1000 (RRID:AB_2336615) | For Immunofluorescence |
| Heat-inactivated FBS | Gibco | 10082-147 | For CAFs |
| Histology sample gel | Richard Allan Scientific | HG-4000-012 | For Immunofluorescence |
| Integrin alpha 6 antibody | Millipore Sigma | Mab1378 (RRID:AB_2128317) | Rat |
| Involucrin antibody | Abcam | Ab68 (RRID:AB_305656) | Mouse |
| Ki67 antibody | Abcam | Ab15580 (RRID:AB_443209) | Rabbit |
| Lab-Tec II chambered #1.5 German Coverglass System | Nalge Nunc International | 155379 (2) | For 3D culture |
| Lab-Tec II chambered #1.5 German Coverglass System | Nalge Nunc International | 155409 (8) | For 3D culture |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | For CAFs |
| Matrigel (preferred for mono-culture) | Corning | 356231 | For 3D culture |
| p63 antibody | Cell Signaling Technology | 13109 (SRRID:AB_2637091) | Rabbit |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | For CAFs |
| ReagentPack Subculture Reagents | Lonza | CC-5034 | For TUM622 cell dissociation |
| RPMI | ThermoFisher | 11875-093 | For CAFs |
| Sox2 antibody | Cell Signaling Technology | 3579 (RRID:AB_2195767) | Rabbit |
| TrypLE Express | Gibco | 12604-021 | For CAF dissociation |
| Vi-Cell | Bechman Coulter | Automatic cell counter | |
| Vimentin antibody | Abcam | Ab92547 (RRID:AB_10562134) | Rabbit |
| β-catenin antibody | Cell Signaling Technology | 2677s (RRID:AB_1030943) | Mouse |
References
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