Flerdimensionella coculture system för att modellera Lung Skivepitelcancer Progression
Summary
Ett in vitro-modellsystem utvecklades för att fånga vävnadarkitektoniska förändringar under lungskivepiteli (LUSC) progression i en 3-dimensionell (3D) co-kultur med cancer-associerade fibroblaster (CAFs). Detta organoidsystem ger en unik plattform för att undersöka rollerna av olika tumör cell-inneboende och extrinsic förändringar som modulerar tumör fenotyp.
Abstract
Tumor-stroma interaktioner spelar en avgörande roll i utvecklingen av lungskivepitelcancer (LUSC). Att förstå hur dessa dynamiska interaktioner bidrar till vävnadsarkitektoniska förändringar som observerats under tumorigenesis är dock fortfarande utmanande på grund av bristen på lämpliga modeller. I det här protokollet beskriver vi genereringen av en 3D-coculturemodell med hjälp av en LUSC primärcellkultur som kallas TUM622. TUM622 celler etablerades från en LUSC patient-härledda xenograft (PDX) och har den unika egenskapen att bilda acinar-liknande strukturer när sådd i en källare membran matris. Vi visar att TUM622 acini i 3D coculture rekapitulera viktiga funktioner i vävnadarkitektur under LUSC progression samt dynamiska interaktioner mellan LUSC celler och komponenter i tumör mikromiljö (TME), inklusive extracellulära (ECM) och cancerrelaterade fibroblaster (CAFs). Vi anpassar vidare vårt huvudsakliga 3D-odlingsprotokoll för att visa hur detta system skulle kunna användas för olika nedströmsanalyser. Sammantaget skapar denna organoidmodell en biologiskt rik och anpassningsbar plattform som gör det möjligt för en att få insikt i de cellinneboende och yttre mekanismerna som främjar störningar av epitelialarkitekturer under carcinom progression och kommer att hjälpa sökandet efter nya terapeutiska mål och diagnostiska markörer.
Introduction
Lungcancer är den främsta orsaken till cancerrelaterad dödlighet i hela världen. Lung skivepitelcancer (LUSC), som är den näst vanligaste typen av icke-småcellig lungcancer (NSCLC) och står för cirka 30% av all lungcancer, diagnostiseras ofta i avancerade stadier och har en dålig prognos1. Behandlingsalternativ för LUSC patienter är ett stort otillfredsställt behov som kan förbättras genom en bättre förståelse av de underliggande cellulära och molekylära mekanismer som driver LUSC tumorigenesis.
Som med de flesta mänskliga cancerformer kännetecknas patogenesen vid LUSC av störningar na i den intakta, välordnade epitelialvävnadsarkitekturen2. Under denna process, korrekt apikala-basalcell polaritet, cell-cell och cell-matris kontakter går förlorade, vilket möjliggör okontrollerad tillväxt och invasivt beteende av tumörcellerna. Det är nu allmänt uppskattat att de maligna funktionerna i cancerceller inte kan manifesteras utan ett viktigt samspel mellan cancerceller och deras lokala tumör mikromiljö (TME)3. Viktiga komponenter i TME inklusive extracellulär matris (ECM), cancer-associerade fibroblaster (CAFs) samt endotelceller och infiltrera immunceller aktivt forma TME och driver tumorigenesis4. Ändå är vår nuvarande förståelse av hur tumörcellerna och dessa nyckelkomponenter i TME interagerar för att driva vävnadsarkitektoniska förändringar under LUSC-progression en mycket begränsad.
Tredimensionell (3D) kultur är ett viktigt verktyg för att studera biologiska aktiviteter av cellinneboende och intrinsiska förändringar i regleringen av vävnad arkitektoniska förändringar i både normala och sjuka vävnader5. 3D-kulturer ger lämpligt strukturellt och funktionellt sammanhang som vanligtvis saknas i traditionella tvådimensionella (2D) kulturer. De extra dimensionerna av sådana system mer närmare efterlikna vävnad in vivo i många aspekter av cellfysiologi och cellulära beteenden, inklusive spridning, differentiering, migration, protein uttryck och svar på läkemedelsbehandling. Under de senaste åren har insatser från olika laboratorier lett till utvecklingen av in vitro 3D-modeller för både den normala lungan samt NSCLC6,7,8. Men en modell för lungskivepitelcancer som kan rekapitulera både den dynamiska vävnaden arkitektoniska förändringar under tumorigenesis samt införliva viktiga stromal komponenter var inte tillgänglig.
Här beskriver vi metoderna för att upprätta ett nytt 3-dimensionellt (3D) coculturesystem med hjälp av primära PDX-härledda LUSC-celler (kallas TUM622) och CAFs9,10. Både TUM622 och CAFs kommer från NSCLC patienten med dåligt differentierade tumörer10. När inbäddade som enstaka celler i ECM, en sällsynt subpopulation av TUM622 celler har kapacitet att bilda organoider med acinar-liknande strukturer som visar korrekt apikala-basalcell polaritet. Dessa acinar-liknande strukturer är hyperplastiska, visa heterogena uttryck för stam-liknande och differentiering markörer som liknar den ursprungliga tumören samtidigt som de förblir icke-invasiva, och därmed efterlikna det tidigaste skedet av LUSC utveckling. Viktigt, Vi visade att vävnadsarkitekturen i acinar-liknande strukturer kan ändras genom hämning av cellinneboende signalering vägar med små molekylhämmare eller tillägg av viktiga komponenter i ECM såsom CAFs, varav den senare förbättrar acini bildning och ytterligare provocerar acini att bli invasiv när i närheten. Tillsammans tyder dessa uppgifter på att detta 3D-co-culture system av LUSC organoider ger en värdefull plattform för undersökning av den dynamiska ömsesidighet mellan LUSC celler och TME och skulle kunna anpassas för övervakning av svaret från LUSC celler till läkemedelsbehandling11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tumörer är heterogena vävnader som består av cancerceller som samexisterar sida vid sida med stromalceller såsom cancerassocierade fibroblaster, endotelceller och immunceller inom ECM. Tillsammans, dessa olika komponenter cross-talk och påverka tumör mikromiljön, spelar en aktiv roll i körning tumorigenesis, en process som innebär progressiva förändringar i tumör arkitektur. Helst bör en in vitro-modell av tumörutveckling kunna fånga de dynamiska vävnadsarkitektoniska förändringar som observerats i mä…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Magali Guffroy, John Kreeger och Stephani Bisulco från Pfizer-Oncology Histopathology and Biomarker group for pathology/histology support and Michael Arensman for critical review of the manuscript. Vi tackar också Pfizer postdoktorala programmet och Oncology R & D-gruppen, särskilt Robert Abraham, Puja Sapra, Karen Widbin och Jennifer Tejeda för deras stöd för programmet.
Materials
| Bronchial Epithelial Growth Medium | Lonza | CC-3170 | BEGM |
| Cell Strainer 40um | ThermoFisher | 352340 | For passing TUM622 cells |
| Cleaved Caspase 3 antibody | Cell Signaling Technology | 9661 (RRID:AB_2341188) | Rabbit |
| CoolRack CFT30 | Biocision | BCS-138 | For 3D culture |
| CoolSink XT96F | Biocision | BCS-536 | For 3D culture |
| Cultrex 3D Cell Harvesting Kit | Bio-Techne | 3448-020-K | |
| Cultrex (preferred for co-culture) | Bio-Techne | 3443-005-01 | For 3D culture |
| CXCR4 antibody | Abcam | Ab124824 (RRID:AB_10975635) | Rabbit |
| E-cadherin antibody | BD Biosciences | 610182 (RRID:AB_397581) | Mouse |
| GelCount | Oxford Optronix | For Acini counts and measurements | |
| GM130 antibody | BD Biosciences | 610822 (RRID:AB_398141) | Mouse |
| Goat Serum | Vector Labs | S1000 (RRID:AB_2336615) | For Immunofluorescence |
| Heat-inactivated FBS | Gibco | 10082-147 | For CAFs |
| Histology sample gel | Richard Allan Scientific | HG-4000-012 | For Immunofluorescence |
| Integrin alpha 6 antibody | Millipore Sigma | Mab1378 (RRID:AB_2128317) | Rat |
| Involucrin antibody | Abcam | Ab68 (RRID:AB_305656) | Mouse |
| Ki67 antibody | Abcam | Ab15580 (RRID:AB_443209) | Rabbit |
| Lab-Tec II chambered #1.5 German Coverglass System | Nalge Nunc International | 155379 (2) | For 3D culture |
| Lab-Tec II chambered #1.5 German Coverglass System | Nalge Nunc International | 155409 (8) | For 3D culture |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | For CAFs |
| Matrigel (preferred for mono-culture) | Corning | 356231 | For 3D culture |
| p63 antibody | Cell Signaling Technology | 13109 (SRRID:AB_2637091) | Rabbit |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | For CAFs |
| ReagentPack Subculture Reagents | Lonza | CC-5034 | For TUM622 cell dissociation |
| RPMI | ThermoFisher | 11875-093 | For CAFs |
| Sox2 antibody | Cell Signaling Technology | 3579 (RRID:AB_2195767) | Rabbit |
| TrypLE Express | Gibco | 12604-021 | For CAF dissociation |
| Vi-Cell | Bechman Coulter | Automatic cell counter | |
| Vimentin antibody | Abcam | Ab92547 (RRID:AB_10562134) | Rabbit |
| β-catenin antibody | Cell Signaling Technology | 2677s (RRID:AB_1030943) | Mouse |
References
- Cancer Genome Atlas Research Network. Comprehensive genomic characterization of squamous cell lung cancers. Nature. 489 (7417), 519-525 (2012).
- Nelson, C. M., Bissell, M. J. Of Extracellular Matrix, Scaffolds, and Signaling: Tissue Architecture Regulates Development, Homeostasis, and Cancer. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 22 (1), 287-309 (2006).
- Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nature Medicine. 19 (11), 1423-1437 (2013).
- Balkwill, F. R., Capasso, M., Hagemann, T. The tumor microenvironment at a glance. Journal of Cell Science. 125 (23), 5591-5596 (2012).
- Schmeichel, K. L., Bissell, M. J. Modeling tissue-specific signaling and organ function in three dimensions. Journal of Cell Science. 116 (Pt 12), 2377-2388 (2003).
- Wu, X., Peters-Hall, J. R., Bose, S., Pena, M. T., Rose, M. C. Human bronchial epithelial cells differentiate to 3D glandular acini on basement membrane matrix. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 44 (6), 914-921 (2011).
- Godugu, C., Singh, M. AlgiMatrix-Based 3D Cell Culture System as an In Vitro Tumor Model: An Important Tool in Cancer Research. Methods in Molecular Biology. 1379, 117-128 (2016).
- Amann, A., et al. Development of an innovative 3D cell culture system to study tumour–stroma interactions in non-small cell lung cancer cells. PLoS One. 9 (3), e92511 (2014).
- Chen, S., et al. Cancer-associated fibroblasts suppress SOX2-induced dysplasia in a lung squamous cancer coculture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (50), E11671-E11680 (2018).
- Damelin, M., et al. Delineation of a cellular hierarchy in lung cancer reveals an oncofetal antigen expressed on tumor-initiating cells. Cancer Research. 71 (12), 4236-4246 (2011).
- Sapra, P., et al. Long-term tumor regression induced by an antibody-drug conjugate that targets 5T4, an oncofetal antigen expressed on tumor-initiating cells. Molecular Cancer Therapeutics. 12 (1), 38-47 (2013).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, pdb.prot4989 (2008).
