Summary

Flerdimensionella coculture system för att modellera Lung Skivepitelcancer Progression

Published: March 17, 2020
doi:

Summary

Ett in vitro-modellsystem utvecklades för att fånga vävnadarkitektoniska förändringar under lungskivepiteli (LUSC) progression i en 3-dimensionell (3D) co-kultur med cancer-associerade fibroblaster (CAFs). Detta organoidsystem ger en unik plattform för att undersöka rollerna av olika tumör cell-inneboende och extrinsic förändringar som modulerar tumör fenotyp.

Abstract

Tumor-stroma interaktioner spelar en avgörande roll i utvecklingen av lungskivepitelcancer (LUSC). Att förstå hur dessa dynamiska interaktioner bidrar till vävnadsarkitektoniska förändringar som observerats under tumorigenesis är dock fortfarande utmanande på grund av bristen på lämpliga modeller. I det här protokollet beskriver vi genereringen av en 3D-coculturemodell med hjälp av en LUSC primärcellkultur som kallas TUM622. TUM622 celler etablerades från en LUSC patient-härledda xenograft (PDX) och har den unika egenskapen att bilda acinar-liknande strukturer när sådd i en källare membran matris. Vi visar att TUM622 acini i 3D coculture rekapitulera viktiga funktioner i vävnadarkitektur under LUSC progression samt dynamiska interaktioner mellan LUSC celler och komponenter i tumör mikromiljö (TME), inklusive extracellulära (ECM) och cancerrelaterade fibroblaster (CAFs). Vi anpassar vidare vårt huvudsakliga 3D-odlingsprotokoll för att visa hur detta system skulle kunna användas för olika nedströmsanalyser. Sammantaget skapar denna organoidmodell en biologiskt rik och anpassningsbar plattform som gör det möjligt för en att få insikt i de cellinneboende och yttre mekanismerna som främjar störningar av epitelialarkitekturer under carcinom progression och kommer att hjälpa sökandet efter nya terapeutiska mål och diagnostiska markörer.

Introduction

Lungcancer är den främsta orsaken till cancerrelaterad dödlighet i hela världen. Lung skivepitelcancer (LUSC), som är den näst vanligaste typen av icke-småcellig lungcancer (NSCLC) och står för cirka 30% av all lungcancer, diagnostiseras ofta i avancerade stadier och har en dålig prognos1. Behandlingsalternativ för LUSC patienter är ett stort otillfredsställt behov som kan förbättras genom en bättre förståelse av de underliggande cellulära och molekylära mekanismer som driver LUSC tumorigenesis.

Som med de flesta mänskliga cancerformer kännetecknas patogenesen vid LUSC av störningar na i den intakta, välordnade epitelialvävnadsarkitekturen2. Under denna process, korrekt apikala-basalcell polaritet, cell-cell och cell-matris kontakter går förlorade, vilket möjliggör okontrollerad tillväxt och invasivt beteende av tumörcellerna. Det är nu allmänt uppskattat att de maligna funktionerna i cancerceller inte kan manifesteras utan ett viktigt samspel mellan cancerceller och deras lokala tumör mikromiljö (TME)3. Viktiga komponenter i TME inklusive extracellulär matris (ECM), cancer-associerade fibroblaster (CAFs) samt endotelceller och infiltrera immunceller aktivt forma TME och driver tumorigenesis4. Ändå är vår nuvarande förståelse av hur tumörcellerna och dessa nyckelkomponenter i TME interagerar för att driva vävnadsarkitektoniska förändringar under LUSC-progression en mycket begränsad.

Tredimensionell (3D) kultur är ett viktigt verktyg för att studera biologiska aktiviteter av cellinneboende och intrinsiska förändringar i regleringen av vävnad arkitektoniska förändringar i både normala och sjuka vävnader5. 3D-kulturer ger lämpligt strukturellt och funktionellt sammanhang som vanligtvis saknas i traditionella tvådimensionella (2D) kulturer. De extra dimensionerna av sådana system mer närmare efterlikna vävnad in vivo i många aspekter av cellfysiologi och cellulära beteenden, inklusive spridning, differentiering, migration, protein uttryck och svar på läkemedelsbehandling. Under de senaste åren har insatser från olika laboratorier lett till utvecklingen av in vitro 3D-modeller för både den normala lungan samt NSCLC6,7,8. Men en modell för lungskivepitelcancer som kan rekapitulera både den dynamiska vävnaden arkitektoniska förändringar under tumorigenesis samt införliva viktiga stromal komponenter var inte tillgänglig.

Här beskriver vi metoderna för att upprätta ett nytt 3-dimensionellt (3D) coculturesystem med hjälp av primära PDX-härledda LUSC-celler (kallas TUM622) och CAFs9,10. Både TUM622 och CAFs kommer från NSCLC patienten med dåligt differentierade tumörer10. När inbäddade som enstaka celler i ECM, en sällsynt subpopulation av TUM622 celler har kapacitet att bilda organoider med acinar-liknande strukturer som visar korrekt apikala-basalcell polaritet. Dessa acinar-liknande strukturer är hyperplastiska, visa heterogena uttryck för stam-liknande och differentiering markörer som liknar den ursprungliga tumören samtidigt som de förblir icke-invasiva, och därmed efterlikna det tidigaste skedet av LUSC utveckling. Viktigt, Vi visade att vävnadsarkitekturen i acinar-liknande strukturer kan ändras genom hämning av cellinneboende signalering vägar med små molekylhämmare eller tillägg av viktiga komponenter i ECM såsom CAFs, varav den senare förbättrar acini bildning och ytterligare provocerar acini att bli invasiv när i närheten. Tillsammans tyder dessa uppgifter på att detta 3D-co-culture system av LUSC organoider ger en värdefull plattform för undersökning av den dynamiska ömsesidighet mellan LUSC celler och TME och skulle kunna anpassas för övervakning av svaret från LUSC celler till läkemedelsbehandling11.

Protocol

1. Översättning och odling AV TUM622 Celler och CAFs i 2D-kulturer Genom att övervälta och odla TUM622-celler Varm 3D-odling medium och cell dissociation reagenser (se Tabell över material)för TUM622 celler vid 37 °C. Passage TUM622 celler vid 80% confluency i 2D-flaskor. Vanligtvis inträffar detta 1 vecka efter översättningar. Kassera gammalt medium från en T75-kolv och tvätta en gång med 6 ml HEPES-buffert. Undvik att pipettera direkt på cellerna.</…

Representative Results

TUM622 och CAFs i 2D-kulturFigur 1 presenterar den typiska morfologi av TUM622 celler och CAFs i 2D-kultur. TUM622 celler avrundas med stora kärnor medan CAFs är platta och långsträckta. TUM622 celler kan nå 80%-90% samfluens i kulturen. Ytterligare spridning leder till mer, men mindre celler aggregerade i kolonier som inte kommer i direkt kontakt. Däremot CAFs föredrar att växa vid högre celltäthet och kommer att hålla välst?…

Discussion

Tumörer är heterogena vävnader som består av cancerceller som samexisterar sida vid sida med stromalceller såsom cancerassocierade fibroblaster, endotelceller och immunceller inom ECM. Tillsammans, dessa olika komponenter cross-talk och påverka tumör mikromiljön, spelar en aktiv roll i körning tumorigenesis, en process som innebär progressiva förändringar i tumör arkitektur. Helst bör en in vitro-modell av tumörutveckling kunna fånga de dynamiska vävnadsarkitektoniska förändringar som observerats i mä…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi tackar Magali Guffroy, John Kreeger och Stephani Bisulco från Pfizer-Oncology Histopathology and Biomarker group for pathology/histology support and Michael Arensman for critical review of the manuscript. Vi tackar också Pfizer postdoktorala programmet och Oncology R & D-gruppen, särskilt Robert Abraham, Puja Sapra, Karen Widbin och Jennifer Tejeda för deras stöd för programmet.

Materials

Bronchial Epithelial Growth Medium Lonza CC-3170 BEGM
Cell Strainer 40um ThermoFisher 352340 For passing TUM622 cells
Cleaved Caspase 3 antibody Cell Signaling Technology 9661 (RRID:AB_2341188) Rabbit
CoolRack CFT30 Biocision BCS-138 For 3D culture
CoolSink XT96F Biocision BCS-536 For 3D culture
Cultrex 3D Cell Harvesting Kit Bio-Techne 3448-020-K
Cultrex (preferred for co-culture) Bio-Techne 3443-005-01 For 3D culture
CXCR4 antibody Abcam Ab124824 (RRID:AB_10975635) Rabbit
E-cadherin antibody BD Biosciences 610182 (RRID:AB_397581) Mouse
GelCount Oxford Optronix For Acini counts and measurements
GM130 antibody BD Biosciences 610822 (RRID:AB_398141) Mouse
Goat Serum Vector Labs S1000 (RRID:AB_2336615) For Immunofluorescence
Heat-inactivated FBS Gibco 10082-147 For CAFs
Histology sample gel Richard Allan Scientific HG-4000-012 For Immunofluorescence
Integrin alpha 6 antibody Millipore Sigma Mab1378 (RRID:AB_2128317) Rat
Involucrin antibody Abcam Ab68 (RRID:AB_305656) Mouse
Ki67 antibody Abcam Ab15580 (RRID:AB_443209) Rabbit
Lab-Tec II chambered #1.5 German Coverglass System Nalge Nunc International 155379 (2) For 3D culture
Lab-Tec II chambered #1.5 German Coverglass System Nalge Nunc International 155409 (8) For 3D culture
L-Glutamine Gibco 25030-081 For CAFs
Matrigel (preferred for mono-culture) Corning 356231 For 3D culture
p63 antibody Cell Signaling Technology 13109 (SRRID:AB_2637091) Rabbit
Pen/Strep Gibco 15140-122 For CAFs
ReagentPack Subculture Reagents Lonza CC-5034 For TUM622 cell dissociation
RPMI ThermoFisher 11875-093 For CAFs
Sox2 antibody Cell Signaling Technology 3579 (RRID:AB_2195767) Rabbit
TrypLE Express Gibco 12604-021 For CAF dissociation
Vi-Cell Bechman Coulter Automatic cell counter
Vimentin antibody Abcam Ab92547 (RRID:AB_10562134) Rabbit
β-catenin antibody Cell Signaling Technology 2677s (RRID:AB_1030943) Mouse

References

  1. Cancer Genome Atlas Research Network. Comprehensive genomic characterization of squamous cell lung cancers. Nature. 489 (7417), 519-525 (2012).
  2. Nelson, C. M., Bissell, M. J. Of Extracellular Matrix, Scaffolds, and Signaling: Tissue Architecture Regulates Development, Homeostasis, and Cancer. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 22 (1), 287-309 (2006).
  3. Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nature Medicine. 19 (11), 1423-1437 (2013).
  4. Balkwill, F. R., Capasso, M., Hagemann, T. The tumor microenvironment at a glance. Journal of Cell Science. 125 (23), 5591-5596 (2012).
  5. Schmeichel, K. L., Bissell, M. J. Modeling tissue-specific signaling and organ function in three dimensions. Journal of Cell Science. 116 (Pt 12), 2377-2388 (2003).
  6. Wu, X., Peters-Hall, J. R., Bose, S., Pena, M. T., Rose, M. C. Human bronchial epithelial cells differentiate to 3D glandular acini on basement membrane matrix. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 44 (6), 914-921 (2011).
  7. Godugu, C., Singh, M. AlgiMatrix-Based 3D Cell Culture System as an In Vitro Tumor Model: An Important Tool in Cancer Research. Methods in Molecular Biology. 1379, 117-128 (2016).
  8. Amann, A., et al. Development of an innovative 3D cell culture system to study tumour–stroma interactions in non-small cell lung cancer cells. PLoS One. 9 (3), e92511 (2014).
  9. Chen, S., et al. Cancer-associated fibroblasts suppress SOX2-induced dysplasia in a lung squamous cancer coculture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (50), E11671-E11680 (2018).
  10. Damelin, M., et al. Delineation of a cellular hierarchy in lung cancer reveals an oncofetal antigen expressed on tumor-initiating cells. Cancer Research. 71 (12), 4236-4246 (2011).
  11. Sapra, P., et al. Long-term tumor regression induced by an antibody-drug conjugate that targets 5T4, an oncofetal antigen expressed on tumor-initiating cells. Molecular Cancer Therapeutics. 12 (1), 38-47 (2013).
  12. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, pdb.prot4989 (2008).

Play Video

Cite This Article
Chen, S., Giannakou, A., Golas, J., Geles, K. G. Multidimensional Coculture System to Model Lung Squamous Carcinoma Progression. J. Vis. Exp. (157), e60644, doi:10.3791/60644 (2020).

View Video