Sistema de Cocultura Multidimensional para Modelar Progressão do Carcinoma Escamoso Pulmonar
Summary
Um sistema de modelo in vitro foi desenvolvido para capturar alterações arquitetônicas teciduais durante a progressão do carcinoma escamoso pulmonar (LUSC) em uma cocultura tridimensional (3D) com fibroblastos associados ao câncer (CAFs). Este sistema organóide fornece uma plataforma única para investigar os papéis de diversas alterações tumorais intrínsecas e extrínsecas que modulam o fenótipo tumoral.
Abstract
As interações tumorais-estroma desempenham um papel crítico no desenvolvimento do carcinoma escamoso pulmonar (LUSC). No entanto, entender como essas interações dinâmicas contribuem para as mudanças arquitetônicas teciduais observadas durante a tumorigênese continua sendo desafiador devido à falta de modelos adequados. Neste protocolo, descrevemos a geração de um modelo de cocultura 3D usando uma cultura de células primárias LUSC conhecida como TUM622. As células TUM622 foram estabelecidas a partir de um xenoenxerto derivado do paciente LUSC (PDX) e têm a propriedade única para formar estruturas semelhantes a acinar quando semeadas em uma matriz de membrana de porão. Demonstramos que o TUM622 acini na cocultura 3D recapitula as principais características da arquitetura tecidual durante a progressão do LUSC, bem como as interações dinâmicas entre as células LUSC e componentes do microambiente tumoral (TME), incluindo o extracelular matriz (ECM) e fibroblastos associados ao câncer (CAFs). Adaptamos ainda nosso protocolo principal de cultivo 3D para demonstrar como esse sistema poderia ser utilizado para várias análises a jusante. No geral, este modelo organóide cria uma plataforma biologicamente rica e adaptável que permite obter uma visão sobre os mecanismos intrínsecos e extrínsecos que promovem a ruptura das arquiteturas epiteliais durante a progressão do carcinoma e ajudarão a busca por novos alvos terapêuticos e marcadores diagnósticos.
Introduction
O câncer de pulmão é a principal causa de mortalidade relacionada ao câncer em todo o mundo. Carcinoma de células escamosas pulmonares (LUSC), que é o segundo tipo mais comum de câncer de pulmão não-pequenas células (NSCLC) e é responsável por aproximadamente 30% de todo o câncer de pulmão, é frequentemente diagnosticado em estágios avançados e tem um prognóstico ruim1. As opções de tratamento para pacientes com LUSC são uma necessidade importante não atendida que pode ser melhorada por uma melhor compreensão dos mecanismos celulares e moleculares subjacentes que impulsionam a tumorigênese lusc.
Como na maioria dos cânceres humanos, a patogênese do LUSC é caracterizada pela ruptura da arquitetura de tecido epitelial intacta e bem ordenada2. Durante esse processo, são perdidos os contatos adequados das células-basais, células-células e matriz celular, permitindo crescimento descontrolado e comportamento invasivo das células tumorais. Agora é amplamente apreciado que as características malignas das células cancerosas não podem se manifestar sem uma interação importante entre as células cancerígenas e seu microambiente tumoral local (TME)3. Os principais componentes do TME, incluindo matriz extracelular (ECM), fibroblastos associados ao câncer (CAFs), bem como células endoteliais e células imunes infiltradas formam ativamente o TME e impulsionam a tumorigênese4. No entanto, nossa compreensão atual de como as células tumorais e esses componentes-chave no TME interagem para conduzir mudanças arquitetônicas teciduais durante a progressão do LUSC é muito limitada.
A cultura tridimensional (3D) é uma importante ferramenta para estudar as atividades biológicas das alterações células intrínsecas e extrínsecas na regulação das alterações arquitetônicas teciduais em tecidos normais e doentes5. As culturas 3D fornecem o contexto estrutural e funcional adequado que geralmente falta nas culturas bidimensionais tradicionais (2D). As dimensões adicionadas desses sistemas imitam mais de perto o tecido in vivo em muitos aspectos da fisiologia celular e comportamentos celulares, incluindo proliferação, diferenciação, migração, expressão proteica e resposta ao tratamento medicamentoso. Nos últimos anos, esforços de vários laboratórios levaram ao desenvolvimento de modelos 3D in vitro tanto para o pulmão normal quanto para o NSCLC6,7,8. No entanto, um modelo para carcinoma escamoso pulmonar que pode recapitular tanto as mudanças arquitetônicas dinâmicas do tecido durante a tumorigênese como incorporar componentes estrôneos-chave não estava disponível.
Aqui, descrevemos os métodos para estabelecer um novo sistema de cocultura tridimensional (3D) utilizando células LUSC derivadas do PDX primário (denominadas TUM622) e CAFs9,10. Tanto tum622 quanto CAFs são derivados de pacientes NSCLC com tumores mal diferenciados10. Quando incorporadas como células únicas em ECM, uma rara subpopulação de células TUM622 tem a capacidade de formar organóides com estruturas semelhantes a acinar que exibem polaridade celular apical-basal adequada. Essas estruturas semelhantes a acinar são hiperplásticas, exibem expressão heterogênea de marcadores semelhantes a hastes e diferenciais semelhantes ao tumor original, permanecendo não invasivos, e assim imitam o estágio mais antigo do desenvolvimento do LUSC. É importante ressaltar que a arquitetura tecidual das estruturas semelhantes ao acinar pode ser alterada pela inibição de vias de sinalização intrínsecas celulares com inibidores de pequenas moléculas ou adição de componentes-chave no ECM, como os CAFs, este último melhora a formação de acini e provoca ainda mais o acini a se tornar invasivo quando em proximidade. Juntos, esses dados sugerem que este sistema de cocultura 3D de organóides LUSC fornece uma plataforma valiosa para a investigação da reciprocidade dinâmica entre as células LUSC e o TME e poderia ser adaptado para monitorar a resposta das células LUSC ao tratamento medicamentoso11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os tumores são tecidos heterogêneos compostos por células cancerígenas coexistindo lado a lado com células estrômicas, como fibroblastos associados ao câncer, células endoteliais e células imunes dentro do ECM. Juntos, esses diversos componentes conversam e influenciam o microambiente tumoral, desempenhando um papel ativo na condução da tumorigênese, processo que envolve mudanças progressivas na arquitetura tumoral. Idealmente, um modelo in vitro de desenvolvimento tumoral deve ser capaz de capturar as mudan…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Magali Guffroy, John Kreeger e Stephani Bisulco do grupo Pfizer-Oncology Histopathology and Biomarker pelo apoio à patologia/histologia e Michael Arensman pela revisão crítica do manuscrito. Agradecemos também ao Programa de Pós-Doutorado da Pfizer e ao grupo de P&D de Oncologia, especificamente Robert Abraham, Puja Sapra, Karen Widbin e Jennifer Tejeda pelo apoio ao programa.
Materials
| Bronchial Epithelial Growth Medium | Lonza | CC-3170 | BEGM |
| Cell Strainer 40um | ThermoFisher | 352340 | For passing TUM622 cells |
| Cleaved Caspase 3 antibody | Cell Signaling Technology | 9661 (RRID:AB_2341188) | Rabbit |
| CoolRack CFT30 | Biocision | BCS-138 | For 3D culture |
| CoolSink XT96F | Biocision | BCS-536 | For 3D culture |
| Cultrex 3D Cell Harvesting Kit | Bio-Techne | 3448-020-K | |
| Cultrex (preferred for co-culture) | Bio-Techne | 3443-005-01 | For 3D culture |
| CXCR4 antibody | Abcam | Ab124824 (RRID:AB_10975635) | Rabbit |
| E-cadherin antibody | BD Biosciences | 610182 (RRID:AB_397581) | Mouse |
| GelCount | Oxford Optronix | For Acini counts and measurements | |
| GM130 antibody | BD Biosciences | 610822 (RRID:AB_398141) | Mouse |
| Goat Serum | Vector Labs | S1000 (RRID:AB_2336615) | For Immunofluorescence |
| Heat-inactivated FBS | Gibco | 10082-147 | For CAFs |
| Histology sample gel | Richard Allan Scientific | HG-4000-012 | For Immunofluorescence |
| Integrin alpha 6 antibody | Millipore Sigma | Mab1378 (RRID:AB_2128317) | Rat |
| Involucrin antibody | Abcam | Ab68 (RRID:AB_305656) | Mouse |
| Ki67 antibody | Abcam | Ab15580 (RRID:AB_443209) | Rabbit |
| Lab-Tec II chambered #1.5 German Coverglass System | Nalge Nunc International | 155379 (2) | For 3D culture |
| Lab-Tec II chambered #1.5 German Coverglass System | Nalge Nunc International | 155409 (8) | For 3D culture |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | For CAFs |
| Matrigel (preferred for mono-culture) | Corning | 356231 | For 3D culture |
| p63 antibody | Cell Signaling Technology | 13109 (SRRID:AB_2637091) | Rabbit |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | For CAFs |
| ReagentPack Subculture Reagents | Lonza | CC-5034 | For TUM622 cell dissociation |
| RPMI | ThermoFisher | 11875-093 | For CAFs |
| Sox2 antibody | Cell Signaling Technology | 3579 (RRID:AB_2195767) | Rabbit |
| TrypLE Express | Gibco | 12604-021 | For CAF dissociation |
| Vi-Cell | Bechman Coulter | Automatic cell counter | |
| Vimentin antibody | Abcam | Ab92547 (RRID:AB_10562134) | Rabbit |
| β-catenin antibody | Cell Signaling Technology | 2677s (RRID:AB_1030943) | Mouse |
References
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