Summary

Sistema di cocultura multidimensionale per modellare la progressione del carcinoma squamoso polmonare

Published: March 17, 2020
doi:

Summary

È stato sviluppato un sistema di modelli in vitro per catturare i cambiamenti architettonici dei tessuti durante la progressione del carcinoma squamoso polmonare (LUSC) in una co-coltura tridimensionale (3D) con fibroblasti associati al cancro (CAF). Questo sistema organoide fornisce una piattaforma unica per studiare i ruoli dei diversi cambiamenti delle cellule tumorali-intrinseche ed estrinseci che modulano il fenotipo tumorale.

Abstract

Le interazioni tumora-stroma svolgono un ruolo fondamentale nello sviluppo del carcinoma squamoso polmonare (LUSC). Tuttavia, comprendere come queste interazioni dinamiche contribuiscono ai cambiamenti architettonici dei tessuti osservati durante la tumorigenesi rimane difficile a causa della mancanza di modelli appropriati. In questo protocollo viene descritta la generazione di un modello di cocultura 3D utilizzando una coltura cellulare primaria LUSC nota come TUM622. Le cellule TUM622 sono state create da un xenotrapianto derivato dal paziente LUSC (PDX) e hanno la proprietà unica di formare strutture acinariche quando seminate in una matrice di membrana seminterrato. Dimostriamo che TUM622 acini nella cocultura 3D riassume le caratteristiche chiave dell’architettura tissutale durante la progressione del LUSC, nonché le interazioni dinamiche tra le cellule LUSC e i componenti del microambiente tumorale (TME), compreso l’extracellulare (ECM) e fibroblasti associati al cancro (CAF). Adattiamo ulteriormente il nostro principale protocollo di coltura 3D per dimostrare come questo sistema potrebbe essere utilizzato per varie analisi a valle. Nel complesso, questo modello organoide crea una piattaforma biologicamente ricca e adattabile che consente di ottenere informazioni sui meccanismi cellulari-intrinseci ed estrinseci che promuovono l’interruzione delle architetture epiteliali durante la progressione carcinoma e aiuteranno la ricerca di nuovi bersagli terapeutici e marcatori diagnostici.

Introduction

Il cancro del polmone è la principale causa di mortalità legata al cancro in tutto il mondo. Il carcinoma a cellule squamose polmonari (LUSC), che è il secondo tipo più comune di cancro del polmone non a piccole cellule (NSCLC) e rappresenta circa il 30% di tutto il cancro del polmone, viene spesso diagnosticato in fase avanzata e ha una prognosi infausta1. Le opzioni di trattamento per i pazienti affetti da LUSC sono un’importante necessità insoddisfatta che può essere migliorata da una migliore comprensione dei meccanismi cellulari e molecolari sottostanti che guidano la tumorigenesi LUSC.

Come per la maggior parte dei tumori umani, la patogenesi di LUSC è caratterizzata dalla rottura dell’architettura del tessuto epiteliale intatta e ben ordinata2. Durante questo processo, la corretta polarità delle cellule apicali-basali, i contatti cell-cell e cell-matrix vengono persi, permettendo una crescita incontrollata e un comportamento invasivo delle cellule tumorali. È ormai ampiamente risaputo che le caratteristiche maligne delle cellule tumorali non possono manifestarsi senza un’importante interazione tra le cellule tumorali e il loro microambiente tumorale locale (TME)3. Componenti chiave del TME, tra cui matrice extracellulare (ECM), fibroblasti associati al cancro (CAF), cellule endoteliali e cellule immunitarie infiltranti modellano attivamente il TME e guidano la tumorigenesi4. Tuttavia, la nostra attuale comprensione di come le cellule tumorali e questi componenti chiave del TME interagiscono per guidare i cambiamenti architettonici dei tessuti durante la progressione del LUSC è molto limitata.

La coltura tridimensionale (3D) è uno strumento importante per studiare le attività biologiche dei cambiamenti cellulari-intrinseci ed estrinseci nella regolazione dei cambiamenti architettonici dei tessuti nei tessuti normali e malati5. Le colture 3D forniscono il contesto strutturale e funzionale appropriato che di solito manca nelle tradizionali colture bidimensionali (2D). Le dimensioni aggiunte di tali sistemi imitano più da vicino il tessuto in vivo in molti aspetti della fisiologia cellulare e dei comportamenti cellulari, tra cui la proliferazione, la differenziazione, la migrazione, l’espressione proteica e la risposta al trattamento farmacologico. Negli ultimi anni, gli sforzi di vari laboratori hanno portato allo sviluppo di modelli 3D in vitro sia per il polmone normale che per NSCLC6,7,8. Tuttavia, non era disponibile un modello per il carcinoma squamoso polmonare che può ricapitolare sia i cambiamenti architettonici dei tessuti dinamici durante la tumorigenesi che incorporare i componenti stromali chiave.

Qui, descriviamo i metodi per stabilire un nuovo sistema di coculture tridimensionale (3D) utilizzando cellule LUSC primarie derivate da PDX (definite TUM622) e CAF9,10. Sia TUM622 che CAF sono derivati dal paziente NSCLC con tumori scarsamente differenziati10. Quando sono incorporate come singole cellule in ECM, una rara sottopopolazione di cellule TUM622 ha la capacità di formare organoidi con strutture acinari che mostrano una corretta polarità delle cellule apical-basali. Queste strutture acinari sono iperplastiche, mostrano un’espressione eterogenea di marcatori simili a gambi e di differenziazione simili al tumore originale, pur rimanendo non invasivi, e quindi imitano il primo stadio dello sviluppo lUSC. È importante sottolineare che abbiamo dimostrato che l’architettura tissutale delle strutture acinariche potrebbe essere alterata dall’inibizione delle vie di segnalazione intrinseche delle cellule con inibitori di piccole molecole o dall’aggiunta di componenti chiave nell’ECM, quest’ultimo dei quali migliora la formazione di acini e provoca ulteriormente l’invasivo acini quando si trovano in prossimità. Insieme, questi dati suggeriscono che questo sistema di cocoltura 3D di organoidi LUSC fornisce una piattaforma preziosa per lo studio della reciprocità dinamica tra le cellule LUSC e il TME e potrebbe essere adattato per monitorare la risposta delle cellule LUSC al trattamento farmacologico11.

Protocol

1. Passare e coltivare TUM622 Cellule e CAF in colture 2D Passare e coltivare cellule TUM622 Reagenti di dissociazione di dissociazione di coltura 3D caldi (vedi Tabella dei materiali)per le cellule TUM622 a 37 gradi centigradi. Passaggio delle cellule TUM622 con l’80% di confluenza nei flaconi 2D. Di solito, questo si verifica 1 settimana dopo il passaggio. Eliminare il vecchio mezzo da un flacone T75 e lavare una volta con 6 mL di buffer HEPES. Evitare di pipetta…

Representative Results

TUM622 e CAF nelle impostazioni cultura 2DFigura 1 presenta la morfologia tipica delle cellule TUM622 e CAF nella coltura 2D. Le cellule TUM622 sono arrotondate con grandi nuclei, mentre i CAF sono piatti e allungati. Le cellule TUM622 possono raggiungere l’80%-90% di confluenza nella coltura. Un’ulteriore proliferazione porta a più, ma le cellule più piccole aggregate in colonie che non entrano in contatto diretto. Al contrario, i CAF …

Discussion

I tumori sono tessuti eterogenei composti da cellule tumorali coesistenti fianco a fianco con cellule stromali come fibroblasti associati al cancro, cellule endoteliali e cellule immunitarie all’interno dell’ECM. Insieme, questi diversi componenti si incrociano e influenzano il microambiente tumorale, svolgendo un ruolo attivo nel guidare la tumorigenesi, un processo che comporta cambiamenti progressivi nell’architettura tumorale. Idealmente, un modello in vitro di sviluppo del tumore dovrebbe essere in grado di catturar…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo Magali Guffroy, John Kreeger e Stephani Bisulco del gruppo Pfizer-Oncology Histopathology and Biomarker per il supporto patologico/istologico e Michael Arensman per la revisione critica del manoscritto. Ringraziamo anche il pfizer Postdoctoral Program e il gruppo Oncology R&D, in particolare Robert Abraham, Puja Sapra, Karen Widbin e Jennifer Tejeda per il loro sostegno al programma.

Materials

Bronchial Epithelial Growth Medium Lonza CC-3170 BEGM
Cell Strainer 40um ThermoFisher 352340 For passing TUM622 cells
Cleaved Caspase 3 antibody Cell Signaling Technology 9661 (RRID:AB_2341188) Rabbit
CoolRack CFT30 Biocision BCS-138 For 3D culture
CoolSink XT96F Biocision BCS-536 For 3D culture
Cultrex 3D Cell Harvesting Kit Bio-Techne 3448-020-K
Cultrex (preferred for co-culture) Bio-Techne 3443-005-01 For 3D culture
CXCR4 antibody Abcam Ab124824 (RRID:AB_10975635) Rabbit
E-cadherin antibody BD Biosciences 610182 (RRID:AB_397581) Mouse
GelCount Oxford Optronix For Acini counts and measurements
GM130 antibody BD Biosciences 610822 (RRID:AB_398141) Mouse
Goat Serum Vector Labs S1000 (RRID:AB_2336615) For Immunofluorescence
Heat-inactivated FBS Gibco 10082-147 For CAFs
Histology sample gel Richard Allan Scientific HG-4000-012 For Immunofluorescence
Integrin alpha 6 antibody Millipore Sigma Mab1378 (RRID:AB_2128317) Rat
Involucrin antibody Abcam Ab68 (RRID:AB_305656) Mouse
Ki67 antibody Abcam Ab15580 (RRID:AB_443209) Rabbit
Lab-Tec II chambered #1.5 German Coverglass System Nalge Nunc International 155379 (2) For 3D culture
Lab-Tec II chambered #1.5 German Coverglass System Nalge Nunc International 155409 (8) For 3D culture
L-Glutamine Gibco 25030-081 For CAFs
Matrigel (preferred for mono-culture) Corning 356231 For 3D culture
p63 antibody Cell Signaling Technology 13109 (SRRID:AB_2637091) Rabbit
Pen/Strep Gibco 15140-122 For CAFs
ReagentPack Subculture Reagents Lonza CC-5034 For TUM622 cell dissociation
RPMI ThermoFisher 11875-093 For CAFs
Sox2 antibody Cell Signaling Technology 3579 (RRID:AB_2195767) Rabbit
TrypLE Express Gibco 12604-021 For CAF dissociation
Vi-Cell Bechman Coulter Automatic cell counter
Vimentin antibody Abcam Ab92547 (RRID:AB_10562134) Rabbit
β-catenin antibody Cell Signaling Technology 2677s (RRID:AB_1030943) Mouse

References

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Cite This Article
Chen, S., Giannakou, A., Golas, J., Geles, K. G. Multidimensional Coculture System to Model Lung Squamous Carcinoma Progression. J. Vis. Exp. (157), e60644, doi:10.3791/60644 (2020).

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