Sistema di cocultura multidimensionale per modellare la progressione del carcinoma squamoso polmonare
Summary
È stato sviluppato un sistema di modelli in vitro per catturare i cambiamenti architettonici dei tessuti durante la progressione del carcinoma squamoso polmonare (LUSC) in una co-coltura tridimensionale (3D) con fibroblasti associati al cancro (CAF). Questo sistema organoide fornisce una piattaforma unica per studiare i ruoli dei diversi cambiamenti delle cellule tumorali-intrinseche ed estrinseci che modulano il fenotipo tumorale.
Abstract
Le interazioni tumora-stroma svolgono un ruolo fondamentale nello sviluppo del carcinoma squamoso polmonare (LUSC). Tuttavia, comprendere come queste interazioni dinamiche contribuiscono ai cambiamenti architettonici dei tessuti osservati durante la tumorigenesi rimane difficile a causa della mancanza di modelli appropriati. In questo protocollo viene descritta la generazione di un modello di cocultura 3D utilizzando una coltura cellulare primaria LUSC nota come TUM622. Le cellule TUM622 sono state create da un xenotrapianto derivato dal paziente LUSC (PDX) e hanno la proprietà unica di formare strutture acinariche quando seminate in una matrice di membrana seminterrato. Dimostriamo che TUM622 acini nella cocultura 3D riassume le caratteristiche chiave dell’architettura tissutale durante la progressione del LUSC, nonché le interazioni dinamiche tra le cellule LUSC e i componenti del microambiente tumorale (TME), compreso l’extracellulare (ECM) e fibroblasti associati al cancro (CAF). Adattiamo ulteriormente il nostro principale protocollo di coltura 3D per dimostrare come questo sistema potrebbe essere utilizzato per varie analisi a valle. Nel complesso, questo modello organoide crea una piattaforma biologicamente ricca e adattabile che consente di ottenere informazioni sui meccanismi cellulari-intrinseci ed estrinseci che promuovono l’interruzione delle architetture epiteliali durante la progressione carcinoma e aiuteranno la ricerca di nuovi bersagli terapeutici e marcatori diagnostici.
Introduction
Il cancro del polmone è la principale causa di mortalità legata al cancro in tutto il mondo. Il carcinoma a cellule squamose polmonari (LUSC), che è il secondo tipo più comune di cancro del polmone non a piccole cellule (NSCLC) e rappresenta circa il 30% di tutto il cancro del polmone, viene spesso diagnosticato in fase avanzata e ha una prognosi infausta1. Le opzioni di trattamento per i pazienti affetti da LUSC sono un’importante necessità insoddisfatta che può essere migliorata da una migliore comprensione dei meccanismi cellulari e molecolari sottostanti che guidano la tumorigenesi LUSC.
Come per la maggior parte dei tumori umani, la patogenesi di LUSC è caratterizzata dalla rottura dell’architettura del tessuto epiteliale intatta e ben ordinata2. Durante questo processo, la corretta polarità delle cellule apicali-basali, i contatti cell-cell e cell-matrix vengono persi, permettendo una crescita incontrollata e un comportamento invasivo delle cellule tumorali. È ormai ampiamente risaputo che le caratteristiche maligne delle cellule tumorali non possono manifestarsi senza un’importante interazione tra le cellule tumorali e il loro microambiente tumorale locale (TME)3. Componenti chiave del TME, tra cui matrice extracellulare (ECM), fibroblasti associati al cancro (CAF), cellule endoteliali e cellule immunitarie infiltranti modellano attivamente il TME e guidano la tumorigenesi4. Tuttavia, la nostra attuale comprensione di come le cellule tumorali e questi componenti chiave del TME interagiscono per guidare i cambiamenti architettonici dei tessuti durante la progressione del LUSC è molto limitata.
La coltura tridimensionale (3D) è uno strumento importante per studiare le attività biologiche dei cambiamenti cellulari-intrinseci ed estrinseci nella regolazione dei cambiamenti architettonici dei tessuti nei tessuti normali e malati5. Le colture 3D forniscono il contesto strutturale e funzionale appropriato che di solito manca nelle tradizionali colture bidimensionali (2D). Le dimensioni aggiunte di tali sistemi imitano più da vicino il tessuto in vivo in molti aspetti della fisiologia cellulare e dei comportamenti cellulari, tra cui la proliferazione, la differenziazione, la migrazione, l’espressione proteica e la risposta al trattamento farmacologico. Negli ultimi anni, gli sforzi di vari laboratori hanno portato allo sviluppo di modelli 3D in vitro sia per il polmone normale che per NSCLC6,7,8. Tuttavia, non era disponibile un modello per il carcinoma squamoso polmonare che può ricapitolare sia i cambiamenti architettonici dei tessuti dinamici durante la tumorigenesi che incorporare i componenti stromali chiave.
Qui, descriviamo i metodi per stabilire un nuovo sistema di coculture tridimensionale (3D) utilizzando cellule LUSC primarie derivate da PDX (definite TUM622) e CAF9,10. Sia TUM622 che CAF sono derivati dal paziente NSCLC con tumori scarsamente differenziati10. Quando sono incorporate come singole cellule in ECM, una rara sottopopolazione di cellule TUM622 ha la capacità di formare organoidi con strutture acinari che mostrano una corretta polarità delle cellule apical-basali. Queste strutture acinari sono iperplastiche, mostrano un’espressione eterogenea di marcatori simili a gambi e di differenziazione simili al tumore originale, pur rimanendo non invasivi, e quindi imitano il primo stadio dello sviluppo lUSC. È importante sottolineare che abbiamo dimostrato che l’architettura tissutale delle strutture acinariche potrebbe essere alterata dall’inibizione delle vie di segnalazione intrinseche delle cellule con inibitori di piccole molecole o dall’aggiunta di componenti chiave nell’ECM, quest’ultimo dei quali migliora la formazione di acini e provoca ulteriormente l’invasivo acini quando si trovano in prossimità. Insieme, questi dati suggeriscono che questo sistema di cocoltura 3D di organoidi LUSC fornisce una piattaforma preziosa per lo studio della reciprocità dinamica tra le cellule LUSC e il TME e potrebbe essere adattato per monitorare la risposta delle cellule LUSC al trattamento farmacologico11.
Protocol
Representative Results
Discussion
I tumori sono tessuti eterogenei composti da cellule tumorali coesistenti fianco a fianco con cellule stromali come fibroblasti associati al cancro, cellule endoteliali e cellule immunitarie all’interno dell’ECM. Insieme, questi diversi componenti si incrociano e influenzano il microambiente tumorale, svolgendo un ruolo attivo nel guidare la tumorigenesi, un processo che comporta cambiamenti progressivi nell’architettura tumorale. Idealmente, un modello in vitro di sviluppo del tumore dovrebbe essere in grado di catturar…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Magali Guffroy, John Kreeger e Stephani Bisulco del gruppo Pfizer-Oncology Histopathology and Biomarker per il supporto patologico/istologico e Michael Arensman per la revisione critica del manoscritto. Ringraziamo anche il pfizer Postdoctoral Program e il gruppo Oncology R&D, in particolare Robert Abraham, Puja Sapra, Karen Widbin e Jennifer Tejeda per il loro sostegno al programma.
Materials
| Bronchial Epithelial Growth Medium | Lonza | CC-3170 | BEGM |
| Cell Strainer 40um | ThermoFisher | 352340 | For passing TUM622 cells |
| Cleaved Caspase 3 antibody | Cell Signaling Technology | 9661 (RRID:AB_2341188) | Rabbit |
| CoolRack CFT30 | Biocision | BCS-138 | For 3D culture |
| CoolSink XT96F | Biocision | BCS-536 | For 3D culture |
| Cultrex 3D Cell Harvesting Kit | Bio-Techne | 3448-020-K | |
| Cultrex (preferred for co-culture) | Bio-Techne | 3443-005-01 | For 3D culture |
| CXCR4 antibody | Abcam | Ab124824 (RRID:AB_10975635) | Rabbit |
| E-cadherin antibody | BD Biosciences | 610182 (RRID:AB_397581) | Mouse |
| GelCount | Oxford Optronix | For Acini counts and measurements | |
| GM130 antibody | BD Biosciences | 610822 (RRID:AB_398141) | Mouse |
| Goat Serum | Vector Labs | S1000 (RRID:AB_2336615) | For Immunofluorescence |
| Heat-inactivated FBS | Gibco | 10082-147 | For CAFs |
| Histology sample gel | Richard Allan Scientific | HG-4000-012 | For Immunofluorescence |
| Integrin alpha 6 antibody | Millipore Sigma | Mab1378 (RRID:AB_2128317) | Rat |
| Involucrin antibody | Abcam | Ab68 (RRID:AB_305656) | Mouse |
| Ki67 antibody | Abcam | Ab15580 (RRID:AB_443209) | Rabbit |
| Lab-Tec II chambered #1.5 German Coverglass System | Nalge Nunc International | 155379 (2) | For 3D culture |
| Lab-Tec II chambered #1.5 German Coverglass System | Nalge Nunc International | 155409 (8) | For 3D culture |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | For CAFs |
| Matrigel (preferred for mono-culture) | Corning | 356231 | For 3D culture |
| p63 antibody | Cell Signaling Technology | 13109 (SRRID:AB_2637091) | Rabbit |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | For CAFs |
| ReagentPack Subculture Reagents | Lonza | CC-5034 | For TUM622 cell dissociation |
| RPMI | ThermoFisher | 11875-093 | For CAFs |
| Sox2 antibody | Cell Signaling Technology | 3579 (RRID:AB_2195767) | Rabbit |
| TrypLE Express | Gibco | 12604-021 | For CAF dissociation |
| Vi-Cell | Bechman Coulter | Automatic cell counter | |
| Vimentin antibody | Abcam | Ab92547 (RRID:AB_10562134) | Rabbit |
| β-catenin antibody | Cell Signaling Technology | 2677s (RRID:AB_1030943) | Mouse |
References
- Cancer Genome Atlas Research Network. Comprehensive genomic characterization of squamous cell lung cancers. Nature. 489 (7417), 519-525 (2012).
- Nelson, C. M., Bissell, M. J. Of Extracellular Matrix, Scaffolds, and Signaling: Tissue Architecture Regulates Development, Homeostasis, and Cancer. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 22 (1), 287-309 (2006).
- Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nature Medicine. 19 (11), 1423-1437 (2013).
- Balkwill, F. R., Capasso, M., Hagemann, T. The tumor microenvironment at a glance. Journal of Cell Science. 125 (23), 5591-5596 (2012).
- Schmeichel, K. L., Bissell, M. J. Modeling tissue-specific signaling and organ function in three dimensions. Journal of Cell Science. 116 (Pt 12), 2377-2388 (2003).
- Wu, X., Peters-Hall, J. R., Bose, S., Pena, M. T., Rose, M. C. Human bronchial epithelial cells differentiate to 3D glandular acini on basement membrane matrix. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 44 (6), 914-921 (2011).
- Godugu, C., Singh, M. AlgiMatrix-Based 3D Cell Culture System as an In Vitro Tumor Model: An Important Tool in Cancer Research. Methods in Molecular Biology. 1379, 117-128 (2016).
- Amann, A., et al. Development of an innovative 3D cell culture system to study tumour–stroma interactions in non-small cell lung cancer cells. PLoS One. 9 (3), e92511 (2014).
- Chen, S., et al. Cancer-associated fibroblasts suppress SOX2-induced dysplasia in a lung squamous cancer coculture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (50), E11671-E11680 (2018).
- Damelin, M., et al. Delineation of a cellular hierarchy in lung cancer reveals an oncofetal antigen expressed on tumor-initiating cells. Cancer Research. 71 (12), 4236-4246 (2011).
- Sapra, P., et al. Long-term tumor regression induced by an antibody-drug conjugate that targets 5T4, an oncofetal antigen expressed on tumor-initiating cells. Molecular Cancer Therapeutics. 12 (1), 38-47 (2013).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, pdb.prot4989 (2008).
