Summary
Um sistema de modelo in vitro foi desenvolvido para capturar alterações arquitetônicas teciduais durante a progressão do carcinoma escamoso pulmonar (LUSC) em uma cocultura tridimensional (3D) com fibroblastos associados ao câncer (CAFs). Este sistema organóide fornece uma plataforma única para investigar os papéis de diversas alterações tumorais intrínsecas e extrínsecas que modulam o fenótipo tumoral.
Abstract
As interações tumorais-estroma desempenham um papel crítico no desenvolvimento do carcinoma escamoso pulmonar (LUSC). No entanto, entender como essas interações dinâmicas contribuem para as mudanças arquitetônicas teciduais observadas durante a tumorigênese continua sendo desafiador devido à falta de modelos adequados. Neste protocolo, descrevemos a geração de um modelo de cocultura 3D usando uma cultura de células primárias LUSC conhecida como TUM622. As células TUM622 foram estabelecidas a partir de um xenoenxerto derivado do paciente LUSC (PDX) e têm a propriedade única para formar estruturas semelhantes a acinar quando semeadas em uma matriz de membrana de porão. Demonstramos que o TUM622 acini na cocultura 3D recapitula as principais características da arquitetura tecidual durante a progressão do LUSC, bem como as interações dinâmicas entre as células LUSC e componentes do microambiente tumoral (TME), incluindo o extracelular matriz (ECM) e fibroblastos associados ao câncer (CAFs). Adaptamos ainda nosso protocolo principal de cultivo 3D para demonstrar como esse sistema poderia ser utilizado para várias análises a jusante. No geral, este modelo organóide cria uma plataforma biologicamente rica e adaptável que permite obter uma visão sobre os mecanismos intrínsecos e extrínsecos que promovem a ruptura das arquiteturas epiteliais durante a progressão do carcinoma e ajudarão a busca por novos alvos terapêuticos e marcadores diagnósticos.
Introduction
O câncer de pulmão é a principal causa de mortalidade relacionada ao câncer em todo o mundo. Carcinoma de células escamosas pulmonares (LUSC), que é o segundo tipo mais comum de câncer de pulmão não-pequenas células (NSCLC) e é responsável por aproximadamente 30% de todo o câncer de pulmão, é frequentemente diagnosticado em estágios avançados e tem um prognóstico ruim1. As opções de tratamento para pacientes com LUSC são uma necessidade importante não atendida que pode ser melhorada por uma melhor compreensão dos mecanismos celulares e moleculares subjacentes que impulsionam a tumorigênese lusc.
Como na maioria dos cânceres humanos, a patogênese do LUSC é caracterizada pela ruptura da arquitetura de tecido epitelial intacta e bem ordenada2. Durante esse processo, são perdidos os contatos adequados das células-basais, células-células e matriz celular, permitindo crescimento descontrolado e comportamento invasivo das células tumorais. Agora é amplamente apreciado que as características malignas das células cancerosas não podem se manifestar sem uma interação importante entre as células cancerígenas e seu microambiente tumoral local (TME)3. Os principais componentes do TME, incluindo matriz extracelular (ECM), fibroblastos associados ao câncer (CAFs), bem como células endoteliais e células imunes infiltradas formam ativamente o TME e impulsionam a tumorigênese4. No entanto, nossa compreensão atual de como as células tumorais e esses componentes-chave no TME interagem para conduzir mudanças arquitetônicas teciduais durante a progressão do LUSC é muito limitada.
A cultura tridimensional (3D) é uma importante ferramenta para estudar as atividades biológicas das alterações células intrínsecas e extrínsecas na regulação das alterações arquitetônicas teciduais em tecidos normais e doentes5. As culturas 3D fornecem o contexto estrutural e funcional adequado que geralmente falta nas culturas bidimensionais tradicionais (2D). As dimensões adicionadas desses sistemas imitam mais de perto o tecido in vivo em muitos aspectos da fisiologia celular e comportamentos celulares, incluindo proliferação, diferenciação, migração, expressão proteica e resposta ao tratamento medicamentoso. Nos últimos anos, esforços de vários laboratórios levaram ao desenvolvimento de modelos 3D in vitro tanto para o pulmão normal quanto para o NSCLC6,7,8. No entanto, um modelo para carcinoma escamoso pulmonar que pode recapitular tanto as mudanças arquitetônicas dinâmicas do tecido durante a tumorigênese como incorporar componentes estrôneos-chave não estava disponível.
Aqui, descrevemos os métodos para estabelecer um novo sistema de cocultura tridimensional (3D) utilizando células LUSC derivadas do PDX primário (denominadas TUM622) e CAFs9,10. Tanto tum622 quanto CAFs são derivados de pacientes NSCLC com tumores mal diferenciados10. Quando incorporadas como células únicas em ECM, uma rara subpopulação de células TUM622 tem a capacidade de formar organóides com estruturas semelhantes a acinar que exibem polaridade celular apical-basal adequada. Essas estruturas semelhantes a acinar são hiperplásticas, exibem expressão heterogênea de marcadores semelhantes a hastes e diferenciais semelhantes ao tumor original, permanecendo não invasivos, e assim imitam o estágio mais antigo do desenvolvimento do LUSC. É importante ressaltar que a arquitetura tecidual das estruturas semelhantes ao acinar pode ser alterada pela inibição de vias de sinalização intrínsecas celulares com inibidores de pequenas moléculas ou adição de componentes-chave no ECM, como os CAFs, este último melhora a formação de acini e provoca ainda mais o acini a se tornar invasivo quando em proximidade. Juntos, esses dados sugerem que este sistema de cocultura 3D de organóides LUSC fornece uma plataforma valiosa para a investigação da reciprocidade dinâmica entre as células LUSC e o TME e poderia ser adaptado para monitorar a resposta das células LUSC ao tratamento medicamentoso11.
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Protocol
1. Passaging e Culturing TUM622 Células e CAFs em Culturas 2D
- Passaging e culturing Células TUM622
- Reagentes de cultura 3D aquecidos e reagentes de dissociação celular (ver Tabela de Materiais) para células TUM622 a 37 °C.
- Passagem Células TUM622 com 80% de confluência em frascos 2D. Normalmente, isso ocorre uma semana após a aprovação.
- Descarte o meio antigo de um frasco T75 e lave uma vez com 6 mL de tampão HEPES. Evite pipetting diretamente sobre as células.
- Apirateo o tampão HEPES. Adicione 4 mL de tripsina/EDTA (0,25 mg/mL, consulte Tabela de Materiais) para uma lavagem rápida e descarte a tripsina/EDTA.
- Adicione 2 mL de tripsina/EDTA e incubar a 37 °C por 5 min. Remova os frascos da incubadora e toque nos frascos para soltar as células sem criar bolhas de ar e retorne os frascos à incubadora por mais 5 min.
NOTA: A exposição prolongada à tripsina danificará irreversivelmente as células e alterará seu fenótipo, sendo assim recomendado limitar o tempo que as células são expostas à tripsina. - Confirmar as células se desprenderam e se dissociaram um microscópio leve (4x ou 10x). Adicionar 4 mL de buffer de neutralização (buffer TNS) (ver informações de reagente de subcultura na Tabela de Materiais) seguido por 10 mL de meio de cultura 3D (ver Tabela de Materiais).
- Pipeta para cima e para baixo suavemente para dissociar ainda mais as células usando uma pipeta de 10 mL. Transfira a suspensão através de um filtro de células de 40 μm para um tubo cônico de 50 mL.
- Conte números de células usando um hemocytometer ou contador de celular automatizado.
- Sementes 0,8 x 106 células/frasco T75 em 20 mL de meio de cultura 3D (ver Tabela de Materiais).
- Alimente as células todos os dias, substituindo metade do meio gasto por meio fresco.
- CaFs de passagem e cultivo
- Passagem CAFs quando as células atingem a confluência. Normalmente, isso ocorre após 5 dias de cultivo de uma divisão 1:2.
- Prepare o meio CAF utilizando o meio basal RPMI com 20% de soro bovino fetal inativado pelo calor, 1% de L-Glutamina e 1% de Penicilina/Estreptomicina. Aqueça o meio a 37 °C.
- Em um frasco T75, enxágue OS CAFs com solução salina tamponada por fosfato (PBS) uma vez, adicione 2 mL de tripsina/EDTA e incubar a 37 °C por 5 min.
- Observe um microscópio leve para garantir que as células tenham se dissociado no frasco (4x ou 10x). Caso assim, amplie a incubação por mais 2-3 min.
- Uma vez que as células tenham se destacado e dissociado, adicione 10 mL de meio de cultura 3D para neutralizar a tripsina/EDTA e a pipeta para cima e para baixo várias vezes para dissociar ainda mais os CAFs.
- Transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 50 mL e gire a 300 x g por 5 min em temperatura ambiente.
- Descarte o sobrenadante e resuspenda a pelota em um volume apropriado de meio de cultura 3D (ver Tabela de Materiais) e passe em dois novos frascos T75.
2. Células TUM622 emplacamento na matriz extracelular para cultura 3D
- Um dia antes do experimento, descongele frascos da matriz da membrana do porão em uma geladeira de 4 °C durante a noite. Pipetas plásticas de recarga (2 mL) e pontas a -20 °C durante a noite.
NOTA: Nem todos os lotes de matriz de membrana de porão têm a mesma capacidade de suportar o crescimento 3D de células TUM622. Portanto, é necessário adquirir e testar vários lotes de matriz de membrana de porão para identificar aqueles que suportam a formação robusta de acini. Normalmente, isso requer uma maior concentração proteica (16-18 mg/mL) na matriz. - No dia do experimento, meio de cultura 3D quente, tampão hepes, trypsin/EDTA e tampão de neutralização de tripsina (TNS) em um banho de água de 37 °C. Imediatamente antes de montar a cultura, retire a matriz de membrana do porão descongelado da geladeira e coloque o frasco no gelo.
- Remanereça as placas de cultura de tecido em um refrigerador de plataforma de metal colocado no gelo. Coloque tubos de centrífuga em um rack de resfriamento metálico no gelo.
- Utilizando células TUM622 obtidas a partir da etapa 1.1.7, calcule o número desejado de células necessárias para o revestimento. Normalmente, 15.000-30.000 células são necessárias por poço de uma placa de 24 poços. A densidade mais baixa é mais adequada para imagens e quantificação, enquanto a maior densidade é preferível ao coletar células para extração de RNA ou manchas ocidentais.
- Transfira a suspensão celular para um tubo de centrífuga resfriado (cada tubo contendo células para revestimento triplicado) e gire para baixo a 300 x g em uma centrífuga de balde suspensa a 4 °C por 5 min.
- Apirate o sobrenadante cuidadosamente com uma pipeta aspirante presa a uma ponta não filtrada (20 μL), deixando aproximadamente 100 μL do meio no tubo (use marcas no tubo como guia).
- Toque suavemente na lateral do tubo para desalojar e dissociar a pelota antes de devolvê-la ao rack de refrigeração.
- Usando as pipetas pré-resfriadas de 2 mL, misture suavemente a matriz, pipetando para cima e para baixo algumas vezes, mantendo o frasco em contato com o gelo. Pipeta a uma velocidade uniforme e moderada para que nenhuma bolha seja introduzida na matriz durante este procedimento.
- Transfira o volume apropriado da matriz para cada tubo de centrífuga. Para emplacar triplicados em uma placa de 24 poços, adicione 1,1 mL de matriz de membrana de porão a cada tubo.
- Usando pontas pré-resfriadas, pipeta a matriz em cada tubo para cima e para baixo cerca de 10 vezes para fazer uma suspensão celular uniforme.
- Transfira 310 μL de suspensão celular/matriz em cada poço de uma placa pré-resfriada de 24 poços. A pipeta é colocada em um ângulo de 90° para a superfície da placa e a suspensão adicionada ao centro do poço. A suspensão deve se espalhar e cobrir todo o poço sem precisar inclinar a placa.
- Para facilitar a análise de imunofluorescência a jusante, emplaca a suspensão celular/matriz em paralelo em lâminas de câmara de 2 poços. Transferir 100 μL de suspensão celular/matriz para o centro de um poço de 2 poços de lâmina de câmara (ver Tabela de Materiais). Isso permite que a matriz forme uma estrutura semelhante a uma cúpula com volume muito menor.
- Devolva a placa e a câmara deslize de volta para uma incubadora de cultura de tecidos e incubapor por 30 min para permitir que a matriz se solidifique. Examine a placa/slide um microscópio leve para garantir que as células únicas sejam distribuídas uniformemente dentro da matriz (4x ou 10x).
- Adicione 1 mL de cultura 3D pré-aquecida em cada poço e 1,5 mL de meio de cultura 3D para cada poço do slide da câmara e depois devolva-os à incubadora.
3. Coculturing 3D de células tum622 e CAFs na matriz extracelular
- Preparar suspensões celulares de TUM622 e CAFs de acordo com a seção 2.
- Conte a densidade celular CAF tomando 10 μL de suspensão celular e misturando-a com 10 μL de azul trypan.
- Adicione 10 μL da mistura a cada uma das duas câmaras em um hemaciatometro para contar e calcular a densidade celular.
NOTA: Os CAFs têm formas irregulares e podem não ser contados com precisão em um contador automático de células. - Co-incorporando células TUM622 e CAFs na matriz de membrana do porão
- Com base nas informações de densidade celular, calcule o número desejado de células utilizadas para chapeamento. Os CAFs são semeados a uma proporção de 2:1 de células TUM622. Por exemplo, para 30.000 células TUM622 semeadas, 60.000 CAFs são co-incorporados.
- Transfira o volume apropriado de TUM622, bem como a suspensão celular dos CAFs para o mesmo tubo de centrífuga e siga as etapas 2.5-2.11 para emplacamento em placas de 24 poços. Para imunofluorescência, transfira 60 μL de mistura tum622/CAFs para lâminas de câmara conforme descrito na etapa 2.12).
- Coculturing TUM622 com CAFs sobrepostos na matriz da membrana do porão (ver Tabela de Materiais)
- Configure a monocultura TUM622 de acordo com as etapas 2.5-2.13.
- Transfira o dobro do número de CAFs de suspensão (em comparação com o número de células TUM622 semeadas) em um tubo de centrífuga e gire para baixo a 300 x g por 5 min à temperatura ambiente.
- Apiratee o sobrenadante e resuspenda os CAFs em 1 mL de meio de cultura 3D.
- Transfira a suspensão de 1 mL de CAFs para o poço que contém as células TUM622 incorporadas.
4. Colheita de Acini TUM622 para Extração de RNA/Proteína e Triagem Celular Ativada por Fluorescência (FACS)
- Prepare o tampão de lavagem e o tampão de colheita celular de acordo com o protocolo do kit de colheita de células 3D no dia anterior e esfrie durante a noite a 4 °C.
- Mantenha as placas em um refrigerador de placas e outros reagentes no gelo antes de iniciar o processo de extração.
- Aspirar mídia de poços de cultura 3D sem tocar na matriz e lavar suavemente o poço 3 vezes com 1 mL de tampão de lavagem.
- Apiratee a lavagem final e adicione 1 mL de tampão de colheita de células a cada poço.
- Use uma ponta p1000 pipeta para raspar a matriz de cada poço.
- Pipeta para cima e para baixo para dissociar ainda mais a matriz.
- Transfira 1 mL da mistura para um tubo cônico pré-refrigerado de 15 mL. Adicione mais 1 mL de tampão de colheita ao mesmo poço.
- Repita as etapas 4.5-4.7 e transfira toda a mistura do mesmo poço em um tubo cônico de 15 mL.
- Tampe os tubos e arochar a 4 °C por 30 min.
- Encha cada tubo com PBS gelado até 10 mL e, em seguida, centrífuga a 300 x g por 5 min a 4 °C.
- Apire o supernadante sem tocar na pelota. O sobrenadante deve conter fragmentos de matriz, mas os esferóides devem ser todos coletados na parte inferior do tubo.
- Adicione PBS gelado para uma segunda lavagem. Inverta o tubo algumas vezes para dissociar a pelota. Gire a 300 x g por 5 min.
- Durante a fiação, prepare o tampão de lyse para a coleta de proteínas e RNA.
- Apiratee cuidadosamente o sobrenadante e adicione tampão de lyse para processamento a jusante para coletar proteína ou RNA. Alternativamente, as células podem ser resuspensas para análise de fluxo/triagem FACS ou passagem em série.
5. Imunofluorescência de TUM622 Acini
- Prepare o tampão de imunofluorescência (tampão IF: PBS com 0,1% de albumina de soro bovino (BSA), 0,2% Triton X-100 e 0,05% Tween-20), tampão de bloqueio primário (tampão IF com soro de cabra 10% ), tampão de bloqueio secundário (tampão de bloqueio primário com 20 μg/mL cabra anti-mouse F(ab')2)
- Aspire meio a partir de lâminas de câmara de 2 poços, enxágue uma vez com PBS e coloque o slide no refrigerador de placa de metal no gelo. O slide da câmara deve permanecer no refrigerador da placa metálica para o restante do protocolo.
- Adicione PFA pré-refrigerado de 4% para fixar o acini e incubar no gelo por 20 min.
- Remova 4% de PFA e lave três vezes com 2 mL de PBS pré-refrigerado cada um por 5 min com balanço suave em um roqueiro.
- Aspirar PBS e permeabilizar com 1,5 mL de 0,5% Triton X-100 em PBS (pré-refrigerado) por 20 min. Ao final deste procedimento, a estrutura em forma de cúpula se soltará.
- Atribua suavemente o tampão de permeabilização do slide da câmara para evitar a perda da amostra. Isso é conseguido adicionando uma ponta fina (20 μL) à pipeta aspiradora e pressionando a ponta em direção ao canto da câmara.
- Lave três vezes com 2 mL de PBS pré-refrigerado cada um por 5 min com balanço suave em um roqueiro.
- Bloqueie a amostra com o tampão de bloqueio primário no gelo por 1 h.
- Remova o buffer de bloqueio primário e adicione o buffer de bloqueio secundário e bloqueie por 30 min.
- Adicione anticorpos primários no tampão de bloqueio primário e incubadurante durante a noite a 4 °C.
NOTA: A concentração dos anticorpos aqui utilizados deve ser maior do que o normalmente utilizado para células de coloração na cultura 2D. A maioria dos anticorpos primários utilizados neste estudo são diluídos à diluição de 1:100 (ver Tabela de Materiais). - Remova os anticorpos primários e lave a amostra 3 vezes com 2 mL de tampão IF frio.
NOTA: As amostras podem estar soltas, tome cuidado extra ao aspirar. - Incubar as amostras em anticorpos secundários diluídos em tampão de bloqueio primário por 1h no RT. Os anticorpos secundários preferidos devem ser altamente interligados para reduzir a coloração do fundo. A maioria dos anticorpos secundários utilizados neste estudo são diluídos à diluição de 1:200.
- Remova os anticorpos secundários e lave a amostra 3 vezes com 2 mL de tampão IF frio.
NOTA: As amostras podem estar soltas, tome cuidado extra ao aspirar. - Adicione PBS com DAPI (1:1.000 de diluição) durante a última lavagem para colorir o núcleo. A realização de mais 2 lava-se na PBS.
- Imagem as amostras em um microscópio confocal dentro de 3 dias.
NOTA: Devido ao tamanho dos organóides e limites na distância de trabalho do objetivo, as amostras são geralmente imagens em ampliação de 10x ou 20x.
6. Preparar amostras de cultura 3D para imunohistoquímica
- Aspirar meio a partir de slides de câmara de 2 poços e enxágüe uma vez com PBS.
- Fixar culturas 3D em 4% pfa a 37 °C durante a noite.
- Remova 4% de PFA, certe culturas com 2,5 mL de gel de amostra de histologia (ver Tabela de Materiais) e coloque o slide a 4 °C para solidificar por pelo menos 1 h.
- Transferir amostras cercadas com gel de amostra histológica para de tecido e processadas em um processador de amostra de tecido automatizado durante a noite.
- Incorporar amostras em cera de parafina e preparar para a secção12.
7. Ensaio de citotoxicidade 3D para triagem composta (exemplo para uma placa de 96 poços)
- Coloque uma placa de 96 poços em um refrigerador de placa, um reservatório de 25 mL em um refrigerador de reservatório e um tubo cônico de 15 mL no gelo antes de iniciar o experimento.
- Prepare as suspensões da matriz celular das células TUM622 em um tubo cônico de polipropileno pré-refrigerado de 15 mL adicionando o volume apropriado da matriz de membrana do porão às células. A densidade desejada para células TUM622 é de 10.000 células por 70-75 μL de matriz de membrana de porão. Pipeta para cima e para baixo algumas vezes para permitir até mesmo a mistura de células dentro da matriz.
- Mova a placa com refrigerador de placa e reservatório com um refrigerador de reservatório longe do gelo para uma superfície seca para evitar o contato da matriz de membrana do porão com gelo durante a transferência.
- Transfira a mistura celular matriz para o reservatório de resfriamento sem criar bolhas.
- Utilizando uma pipeta multicanal mecânica (10-300 μL), transfira 70-75 μL das células de mistura para cada poço apropriado de uma placa de 96 poços.
- Incubar placa a 37 °C e 5% CO2 por 30 min para solidificar a matriz da membrana do porão.
- Adicione 100 μL de mídia em todas as linhas e devolva a placa à incubadora.
- Comece a dosagem composta no dia seguinte ou mais tarde, dependendo do objetivo do experimento.
- Os esferóides podem ser realimentados e re-dosados a cada 2-3 dias por até 10 dias, removendo a mídia gasta com um coletor de vácuo de 8 ou 12 poços e substituindo por mídia fresca com ou sem compostos desejados.
- O número de esferóides TUM622 poderia ser quantificado usando imagens 3D de acordo com o protocolo do fabricante.
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Representative Results
TUM622 e CAFs na cultura 2D
A Figura 1 apresenta a morfologia típica de células TUM622 e CAFs na cultura 2D. As células TUM622 são arredondadas com núcleos grandes, enquanto os CAFs são planos e alongados. As células TUM622 podem atingir 80%-90% de confluência na cultura. A proliferação leva a mais, mas células menores agregadas em colônias que não entram em contato direto. Em contraste, os CAFs preferem crescer em maior densidade celular e continuarão a proliferar em confluência total se forem fornecidos nutrientes suficientes.
Crescimento e morfologia de TUM622 acini em 3D ECM
A Figura 2 apresenta um experimento de curso de tempo de células TUM622 semeadas na cultura 3D. Os dados mostram que células tum622 únicas são capazes de formar organóides com morfologias semelhantes a acinar quando incorporadas. Entre os dias 5 e 7, um lúmen se torna aparente nas estruturas semelhantes a acinar e permanece oco a partir daí(Figura 2A). Cada acinus, composto por uma monocamada de células ao redor do lúmen oco, exibe polaridade apical-basal adequada semelhante à do epitélio pulmonar in vivo(Figura 2B). Essas estruturas semelhantes a acinar são hiperplásticas e continuam a crescer enquanto nutrientes suficientes forem fornecidos. A cultura pode ser mantida por até 24 dias antes que o ECM se desintegre completamente(Figura 2C). Através da limitação do ensaio de diluição (LDA) (dados não mostrados), estima-se que apenas uma rara subpopulação de células TUM622 (<0,02%) têm a capacidade de formar estruturas semelhantes a acinar9.
Crescimento e morfologia da cocultura TUM622-CAFs
A Figura 3 retrata os resultados de configuração e representação das coculturas TUM622-CAF. Os CAFs poderiam ser integrados à cocultura, sobrepondo-se à matriz ou co-incorporados com as células TUM622. Independentemente da configuração, a presença de CAFs aumentou muito o número e o tamanho dos esferóides formados (Figura 3B). Curiosamente, quando os acini TUM622 se aproximam dos CAFs, eles induzem os acini a se tornarem invasivos e migrarem em direção aos CAFs, formando "queda de lágrimas" como estruturas(Figura 3C). Observe que o TUM622 acini na monocultura não exibe comportamento invasivo e só forma "tear-drop" como estruturas quando perto de CAFs.
Resultados representativos de coloração imunofluorescente e imunohistoquímica
A Figura 4 apresenta resultados representativos da imunofluorescência e da coloração imunohistoquímica de TUM622 acini após 10 dias de cultivo. Imagens confocais foram tiradas no plano equatorial de imunofluorescente tum622 acini(Figura 4A). Em contraste, cada seção da amostra de imunohistoquímica pode capturar acini em diferentes planos(Figura 4B). Ambos os resultados mostraram expressão heterogênea de células semelhantes a tronco seletos e diferenciadas dentro de cada acinus.
Ensaio de citotoxicidade 3D TUM622 usando um inibidor da via Wnt
A Figura 5 mostra a dose-resposta de TUM622 acini tratado com XAV939, um inibidor de tankyrase(Figura 5A,B). XAV939 foi adicionado à cultura 1 dia após o revestimento e atualizado a cada 2 dias por um total de 10 dias. No final do experimento, o número de acini foi quantificado por um imager. Imagens brightfield em maior ampliação também foram adquiridas para capturar a morfologia dos esferóides no controle versus poços tratados com XAV939(Figura 5C). No geral, XAV939 exibe inibição dependente de dose na formação de acini e altera a arquitetura tecidual dos esferóides formados. Estes resultados sugerem que a ativação da via canônica wnt é necessária durante a morfogênese acinar TUM622.
Figura 1: TUM622 e CAFs na cultura 2D. Imagens representativas de campo brilhante de células TUM622 e CAFs cultivadas em 2D. Barra de escala = 100 μm. Esta figura foi modificada de Chen et al.9 e usada com permissão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Crescimento e morfologia de TUM622 acini em ECM 3D. (A) Imagens do curso do tempo de células TUM622 cultivadas em matriz de membrana de porão durante um período de 10 dias. Barra de escala = 100 μm.(B) Imunofluorescência de TUM622 acini manchado com marcadores de polaridade celular apical-basal, enzima Golgi (GM-130, verde, apical) e Integrin alfa 6 (CD49f, basal, vermelho). (C) Quantificação do número acini (eixo y direito, vermelho) e do tamanho médio de acini (eixo y esquerdo, azul) banhado em triplicado em uma placa de 24 poços ao longo de 24 dias na cultura. As barras de erro representam o SD. Esta figura foi modificada de Chen et al.9 e usada com permissão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Crescimento e morfologia da cocultura TUM622-CAFs. (A) Desenho esquemático da configuração da cocultura TUM622-CAFs. Os CAFs são sobrepostos ou co-incorporados com células TUM62 em ECM. Após 6-12 dias na cocultura, as células TUM622 são capazes de formar acini cada vez maior em comparação com a monocultura e invadir o ECM quando em proximidade e contato direto com CAFs. Note-se que o fenótipo invasivo só poderia ser observado na cocultura. (B) Imagem brightfield de culturas TUM622 3D na presença ou ausência de CAFs sobrepostos após 8 dias. Barras de escala = 200 μm.(C) Imagens brightfield mostrando acini em forma de gota de lágrima formando-se em coculturas, independentemente dos CAFs, são sobrepostas ou co-incorporadas no ECM. Barras de escala = 200 μm. Esta figura foi modificada de Chen et al.9 e usada com permissão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Resultados representativos de coloração imunofluorescente e imunohistoquímica. ( A) Coloração de anticorpos de acini com marcadores de células-tronco/progenitoras (CXCR4 e SOX2), mesenquime (Vimentin), diferenciação epitelial (Involucrina), apoptose (Cleaved-Caspase-3) e proliferação (Ki67) em verde, DAPI em azul, E-cadherin e Phalloidin em vermelho. Barra de escala = 50 μm. (B) Imunohistoquímica em seções ffpe de TUM622 acini. Barra de escala = 100 μm (superior) e 50 μm (inferior). Esta figura foi modificada de Chen et al.9 e usada com permissão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Ensaio de citotoxicidade 3D TUM622 usando um inibidor da via Wnt. (A) Quantificação de números esferóides em uma placa de 96 poços onde as células TUM622 foram tratadas com sulfóxido de dimetila (Controle) ou XAV939. Cada condição é avaliada em triplicados. Barras de erro representam SD. (B) Imagens completas de uma placa de 24 poços tiradas com um imager mostrando os efeitos inibidores de XAV939 na formação acini. (C) Imagens representativas de brightfield dos poços de controle vs. tratados demonstrando as alterações morfológicas causadas pelo tratamento XAV939. Barras de escala = 100 μm. Esta figura foi modificada de Chen et al.9 e usada com permissão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Os tumores são tecidos heterogêneos compostos por células cancerígenas coexistindo lado a lado com células estrômicas, como fibroblastos associados ao câncer, células endoteliais e células imunes dentro do ECM. Juntos, esses diversos componentes conversam e influenciam o microambiente tumoral, desempenhando um papel ativo na condução da tumorigênese, processo que envolve mudanças progressivas na arquitetura tumoral. Idealmente, um modelo in vitro de desenvolvimento tumoral deve ser capaz de capturar as mudanças arquitetônicas dinâmicas do tecido observadas em tumores humanos in vivo, a interação complexa de diversos tipos de células dentro do microambiente tumoral e, ao mesmo tempo, permitir manipulação experimental em ambas as células tumorais e componentes no TME. Embora muito progresso tenha sido feito em modelos de câncer 3D nos últimos anos, tais modelos não foram prontamente próximos para o LUSC. A maioria dos modelos relatados até agora incorpora apenas alguns aspectos dessas características importantes. Aqui relatamos os métodos para um sistema de cocultura 3D do LUSC que captura simultaneamente as principais alterações arquitetônicas teciduais observadas durante o desenvolvimento do LUSC, bem como interações dinâmicas entre células tumorais e componentes principais do TME, incluindo o ECM e Cafs.
A capacidade deste sistema de modelar com mais precisão as mudanças arquitetônicas teciduais baseia-se na propriedade única das células TUM622 na formação de organóides com morfologias semelhantes a acinar quando incorporadas em 3D EC. Formado a partir de uma célula única auto-renovadora, cada acinus é composto de uma monocamada de células em torno de um lúmen oco. Esta monocamada de células exibe polaridade celular apical-basal e permanece não invasiva, assemelhando-se à arquitetura tecidual do epitélio pulmonar. Enquanto tum622 como uma monocultura 3D exibe crescimento hiperplástico, a adição de CAFs aumenta ainda mais a morfogênese acinar e induz a forma cada vez maior a acini. É importante ressaltar que os CAFs invocam mudanças arquitetônicas dinâmicas do tecido nas células TUM622 quando os dois tipos de células se aproximam, permitindo que as células TUM622 percam sua polaridade apical-basal e invadam a matriz em direção aos CAFs. Estas alterações faiotípicas recapitulam tanto a hiperplasia precoce quanto os estágios invasivos tardios do LUSC.
Ao contrário de muitos modelos esferóides tumorais onde cada esferóide é formado pela agregação de muitas células, cada acinus TUM622 é derivado de uma única célula9. Por LDA in vitro, estima-se que apenas uma subpopulação menor (≤0,02%) de células TUM622 têm tal capacidade9. Embora raras, essas células poderiam se auto-renovar como evidenciada por sua capacidade de se submeter à passagem em série em 3D, bem como diferenciar-se em uma população heterogênea de células semelhantes à do tumor original. Devido a esta característica única das células TUM622, é fundamental garantir a distribuição uniforme de células TUM622 únicas dentro do ECM no momento do revestimento para uma análise bem sucedida de cultivo e downstream. Para alcançar esse objetivo, vários pontos-chave precisam ser seguidos com cuidado no protocolo, incluindo a determinação da densidade de semeada adequada, mantendo todas as ferramentas e reagentes frescos durante a mistura de células e matriz para evitar a solidificação prematura, evitando a introdução de bolhas durante o processo de mistura e permitindo tempo suficiente para a matriz se solidificar totalmente antes de adicionar o meio de cultura. Juntas, essas precauções ajudarão a alcançar um substrato de matriz mais uniforme e condição de cultura para todas as células incorporadas.
Uma vez estabelecida com sucesso, esta cultura pode ser usada para uma variedade de análises a jusante para dissecar o processo celular e bioquímico que regulam a tumorigênese. O número e o tamanho do acini formado em cada poço podem ser monitorados ao longo do tempo com imagens de campo brilhantes e usados como leitura para a capacidade proliferativa e de auto-renovação das células TUM622. Dinâmicas mais detalhadas na morfogênese de cada acinus poderiam ser observadas com imagens vivas em um microscópio confocal, com ou sem vários corantes de rotulagem. O meio condicionado pode ser coletado em vários pontos de tempo durante o período de cultura para análise de fatores solúveis que podem mediar as cruzadas entre células ou células- matriz. As células TUM622 extraídas diretamente do ECM utilizando o protocolo 4 são adequadas para a extração de RNA e proteína para análise de expressão genética, quantificação de citometria de fluxo ou classificação FACS com base em marcadores de superfície celular. Alternativamente, as culturas poderiam ser fixadas para estudos in situ imunofluorescence ou imunohistoquímica para entender as distribuições espaço-temporais de vários marcadores. Embora semelhante, a imunohistoquímica complementa os métodos de imunofluorescência na forma que permite a amostragem de acini inteiro que pode não ser possível devido à limitação da profundidade de imagem dos objetivos confocais. Para ambos os métodos, o tempo e a temperatura em que a fixação e a permeabilização são realizadas são críticos, especialmente dado que as células TUM622 estão inseridas em uma matriz densa (>90% matriz de membrana de porão) em contraste com muitas outras culturas 3D onde densidade da matriz é muito menor. Portanto, a atenção à fixação e processamento padronizados e consistentes é necessária para obter resultados replicativos.
Usando este sistema como plataforma, pode-se então investigar como as alterações intrínsecas das células nas células tumorais, bem como as alterações extrínsecas das células no microambiente tumoral, influenciam a arquitetura epitelial e modelam eventos iniciais envolvidos na formação do carcinoma. Por exemplo, os papéis dos oncogenes ou genes supressores tumorais na regulação da arquitetura do tecido tumoral poderiam ser estudados por experimentos de ganho ou perda de função visando o gene de interesse nas células tumorais. De fato, demonstramos que a superexpressão do SOX2, comumente observada no LUSC, altera o fenótipo das células TUM622 como evidenciado por uma perda de hiperplasia em 3D e progressão para o crescimento displástico9. Por outro lado, pode-se comparar fibroblastos normais versus associados ao câncer em ambientes de cocultura, determinar como componentes matriciais ou sua rigidez impactam o crescimento acini/morfologia/invasão, e se o bloqueio de certas citocinas poderia interferir na comunicação celular-célula e, por sua vez, afetar a arquitetura tecidual e a progressão do tumor. É importante ressaltar que todos esses ensaios poderiam ser realizados na presença ou ausência de determinados agentes terapêuticos e serem utilizados como ferramenta para determinar a resposta medicamentosa das células LUSC com leitura multidimensional11. Também é importante notar que este sistema é limitado em relação aos caminhos que poderia ser usado para interrogar, pois apenas algumas, mas não todas as principais vias de sinalização regulam o crescimento e a morfologia dos organóides TUM622 na cultura (ou seja, a inibição da wnt, mas não a sinalização de Entalhe afeta a mofogênese acinar das células TUM622)9.
Em resumo, demonstramos que este sistema organóide fornece uma plataforma única para gerar novas percepções sobre a interação dinâmica entre as células LUSC e o microambiente tumoral durante a progressão do tumor. Prevemos que nosso sistema modelo será uma plataforma valiosa para a descoberta e desenvolvimento de drogas. Nesse sentido, o rastreamento de novas terapêuticas anticancerígenas em um contexto de tecido tumoral nativo deve auxiliar na seleção e desenvolvimento de terapêuticas mais eficazes voltadas para o LUSC.
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Disclosures
Os autores são funcionários e acionistas da Pfizer Inc.
Acknowledgments
Agradecemos a Magali Guffroy, John Kreeger e Stephani Bisulco do grupo Pfizer-Oncology Histopathology and Biomarker pelo apoio à patologia/histologia e Michael Arensman pela revisão crítica do manuscrito. Agradecemos também ao Programa de Pós-Doutorado da Pfizer e ao grupo de P&D de Oncologia, especificamente Robert Abraham, Puja Sapra, Karen Widbin e Jennifer Tejeda pelo apoio ao programa.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bronchial Epithelial Growth Medium | Lonza | CC-3170 | BEGM |
| Cell Strainer 40um | ThermoFisher | 352340 | For passing TUM622 cells |
| Cleaved Caspase 3 antibody | Cell Signaling Technology | 9661 (RRID:AB_2341188) | Rabbit |
| CoolRack CFT30 | Biocision | BCS-138 | For 3D culture |
| CoolSink XT96F | Biocision | BCS-536 | For 3D culture |
| Cultrex 3D Cell Harvesting Kit | Bio-Techne | 3448-020-K | |
| Cultrex (preferred for co-culture) | Bio-Techne | 3443-005-01 | For 3D culture |
| CXCR4 antibody | Abcam | Ab124824 (RRID:AB_10975635) | Rabbit |
| E-cadherin antibody | BD Biosciences | 610182 (RRID:AB_397581) | Mouse |
| GelCount | Oxford Optronix | For Acini counts and measurements | |
| GM130 antibody | BD Biosciences | 610822 (RRID:AB_398141) | Mouse |
| Goat Serum | Vector Labs | S1000 (RRID:AB_2336615) | For Immunofluorescence |
| Heat-inactivated FBS | Gibco | 10082-147 | For CAFs |
| Histology sample gel | Richard Allan Scientific | HG-4000-012 | For Immunofluorescence |
| Integrin alpha 6 antibody | Millipore Sigma | Mab1378 (RRID:AB_2128317) | Rat |
| Involucrin antibody | Abcam | Ab68 (RRID:AB_305656) | Mouse |
| Ki67 antibody | Abcam | Ab15580 (RRID:AB_443209) | Rabbit |
| Lab-Tec II chambered #1.5 German Coverglass System | Nalge Nunc International | 155379 (2) | For 3D culture |
| Lab-Tec II chambered #1.5 German Coverglass System | Nalge Nunc International | 155409 (8) | For 3D culture |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | For CAFs |
| Matrigel (preferred for mono-culture) | Corning | 356231 | For 3D culture |
| p63 antibody | Cell Signaling Technology | 13109 (SRRID:AB_2637091) | Rabbit |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | For CAFs |
| ReagentPack Subculture Reagents | Lonza | CC-5034 | For TUM622 cell dissociation |
| RPMI | ThermoFisher | 11875-093 | For CAFs |
| Sox2 antibody | Cell Signaling Technology | 3579 (RRID:AB_2195767) | Rabbit |
| TrypLE Express | Gibco | 12604-021 | For CAF dissociation |
| Vi-Cell | Bechman Coulter | Automatic cell counter | |
| Vimentin antibody | Abcam | Ab92547 (RRID:AB_10562134) | Rabbit |
| β-catenin antibody | Cell Signaling Technology | 2677s (RRID:AB_1030943) | Mouse |
References
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