Summary
È stato sviluppato un sistema di modelli in vitro per catturare i cambiamenti architettonici dei tessuti durante la progressione del carcinoma squamoso polmonare (LUSC) in una co-coltura tridimensionale (3D) con fibroblasti associati al cancro (CAF). Questo sistema organoide fornisce una piattaforma unica per studiare i ruoli dei diversi cambiamenti delle cellule tumorali-intrinseche ed estrinseci che modulano il fenotipo tumorale.
Abstract
Le interazioni tumora-stroma svolgono un ruolo fondamentale nello sviluppo del carcinoma squamoso polmonare (LUSC). Tuttavia, comprendere come queste interazioni dinamiche contribuiscono ai cambiamenti architettonici dei tessuti osservati durante la tumorigenesi rimane difficile a causa della mancanza di modelli appropriati. In questo protocollo viene descritta la generazione di un modello di cocultura 3D utilizzando una coltura cellulare primaria LUSC nota come TUM622. Le cellule TUM622 sono state create da un xenotrapianto derivato dal paziente LUSC (PDX) e hanno la proprietà unica di formare strutture acinariche quando seminate in una matrice di membrana seminterrato. Dimostriamo che TUM622 acini nella cocultura 3D riassume le caratteristiche chiave dell'architettura tissutale durante la progressione del LUSC, nonché le interazioni dinamiche tra le cellule LUSC e i componenti del microambiente tumorale (TME), compreso l'extracellulare (ECM) e fibroblasti associati al cancro (CAF). Adattiamo ulteriormente il nostro principale protocollo di coltura 3D per dimostrare come questo sistema potrebbe essere utilizzato per varie analisi a valle. Nel complesso, questo modello organoide crea una piattaforma biologicamente ricca e adattabile che consente di ottenere informazioni sui meccanismi cellulari-intrinseci ed estrinseci che promuovono l'interruzione delle architetture epiteliali durante la progressione carcinoma e aiuteranno la ricerca di nuovi bersagli terapeutici e marcatori diagnostici.
Introduction
Il cancro del polmone è la principale causa di mortalità legata al cancro in tutto il mondo. Il carcinoma a cellule squamose polmonari (LUSC), che è il secondo tipo più comune di cancro del polmone non a piccole cellule (NSCLC) e rappresenta circa il 30% di tutto il cancro del polmone, viene spesso diagnosticato in fase avanzata e ha una prognosi infausta1. Le opzioni di trattamento per i pazienti affetti da LUSC sono un'importante necessità insoddisfatta che può essere migliorata da una migliore comprensione dei meccanismi cellulari e molecolari sottostanti che guidano la tumorigenesi LUSC.
Come per la maggior parte dei tumori umani, la patogenesi di LUSC è caratterizzata dalla rottura dell'architettura del tessuto epiteliale intatta e ben ordinata2. Durante questo processo, la corretta polarità delle cellule apicali-basali, i contatti cell-cell e cell-matrix vengono persi, permettendo una crescita incontrollata e un comportamento invasivo delle cellule tumorali. È ormai ampiamente risaputo che le caratteristiche maligne delle cellule tumorali non possono manifestarsi senza un'importante interazione tra le cellule tumorali e il loro microambiente tumorale locale (TME)3. Componenti chiave del TME, tra cui matrice extracellulare (ECM), fibroblasti associati al cancro (CAF), cellule endoteliali e cellule immunitarie infiltranti modellano attivamente il TME e guidano la tumorigenesi4. Tuttavia, la nostra attuale comprensione di come le cellule tumorali e questi componenti chiave del TME interagiscono per guidare i cambiamenti architettonici dei tessuti durante la progressione del LUSC è molto limitata.
La coltura tridimensionale (3D) è uno strumento importante per studiare le attività biologiche dei cambiamenti cellulari-intrinseci ed estrinseci nella regolazione dei cambiamenti architettonici dei tessuti nei tessuti normali e malati5. Le colture 3D forniscono il contesto strutturale e funzionale appropriato che di solito manca nelle tradizionali colture bidimensionali (2D). Le dimensioni aggiunte di tali sistemi imitano più da vicino il tessuto in vivo in molti aspetti della fisiologia cellulare e dei comportamenti cellulari, tra cui la proliferazione, la differenziazione, la migrazione, l'espressione proteica e la risposta al trattamento farmacologico. Negli ultimi anni, gli sforzi di vari laboratori hanno portato allo sviluppo di modelli 3D in vitro sia per il polmone normale che per NSCLC6,7,8. Tuttavia, non era disponibile un modello per il carcinoma squamoso polmonare che può ricapitolare sia i cambiamenti architettonici dei tessuti dinamici durante la tumorigenesi che incorporare i componenti stromali chiave.
Qui, descriviamo i metodi per stabilire un nuovo sistema di coculture tridimensionale (3D) utilizzando cellule LUSC primarie derivate da PDX (definite TUM622) e CAF9,10. Sia TUM622 che CAF sono derivati dal paziente NSCLC con tumori scarsamente differenziati10. Quando sono incorporate come singole cellule in ECM, una rara sottopopolazione di cellule TUM622 ha la capacità di formare organoidi con strutture acinari che mostrano una corretta polarità delle cellule apical-basali. Queste strutture acinari sono iperplastiche, mostrano un'espressione eterogenea di marcatori simili a gambi e di differenziazione simili al tumore originale, pur rimanendo non invasivi, e quindi imitano il primo stadio dello sviluppo lUSC. È importante sottolineare che abbiamo dimostrato che l'architettura tissutale delle strutture acinariche potrebbe essere alterata dall'inibizione delle vie di segnalazione intrinseche delle cellule con inibitori di piccole molecole o dall'aggiunta di componenti chiave nell'ECM, quest'ultimo dei quali migliora la formazione di acini e provoca ulteriormente l'invasivo acini quando si trovano in prossimità. Insieme, questi dati suggeriscono che questo sistema di cocoltura 3D di organoidi LUSC fornisce una piattaforma preziosa per lo studio della reciprocità dinamica tra le cellule LUSC e il TME e potrebbe essere adattato per monitorare la risposta delle cellule LUSC al trattamento farmacologico11.
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Protocol
1. Passare e coltivare TUM622 Cellule e CAF in colture 2D
- Passare e coltivare cellule TUM622
- Reagenti di dissociazione di dissociazione di coltura 3D caldi (vedi Tabella dei materiali)per le cellule TUM622 a 37 gradi centigradi.
- Passaggio delle cellule TUM622 con l'80% di confluenza nei flaconi 2D. Di solito, questo si verifica 1 settimana dopo il passaggio.
- Eliminare il vecchio mezzo da un flacone T75 e lavare una volta con 6 mL di buffer HEPES. Evitare di pipettare direttamente sulle cellule.
- Aspirati il buffer HEPES. Aggiungere 4 mL di trypsin/EDTA (0,25 mg/mL, vedere Tabella dei materiali) per un rapido risciacquo e scartare la trypsin/EDTA.
- Aggiungere 2 mL di orpsina/EDTA e incubare a 37 gradi centigradi per 5 min. Rimuovere i flaconi dall'incubatrice e toccare i flaconi per allentare le cellule senza creare bolle d'aria e restituire i flaconi all'incubatrice per altri 5 min.
NOTA: L'esposizione prolungata alla trypsin danneggerà irreversibilmente le cellule e altererà il loro fenotipo, quindi si consiglia di limitare il tempo in cui le cellule sono esposte alla trypsina. - Confermare che le cellule si sono staccate e dissociate al microscopio luminoso (4x o 10x). Aggiungere 4 mL di buffer di neutralizzazione (tNS buffer) (vedere le informazioni sul reagente di sottolingua nella tabella dei materiali) seguito da 10 mL di supporto di coltura 3D (vedere Tabella dei materiali).
- Pipetta su e giù delicatamente per dissociare ulteriormente le cellule utilizzando una pipetta da 10 mL. Trasferire la sospensione attraverso un colino a celle da 40 m in un tubo conico da 50 ml.
- Contare i numeri di cella utilizzando un emocitometro o un contatore cellulare automatizzato.
- Seme 0,8 x 106 cellule/T75 fiaschetta in 20 mL di mezzo di coltura 3D (vedere Tabella dei materiali).
- Alimentare le cellule ogni due giorni sostituendo metà del mezzo speso con un mezzo fresco.
- Superamento e coltura di CAF
- Passaggio CAF quando le cellule raggiungono la confluenza. Di solito, questo si verifica dopo 5 giorni di coltura da una divisione 1:2.
- Preparare il mezzo CAF utilizzando il mezzo basale RPMI con il 20% di siero bovino fetale inattivato dal calore, l'1% L-Glutamine e l'1% Penicillin/Streptomycin. Riscaldare il mezzo a 37 gradi centigradi.
- In un flacone T75, risciacquare i FILE CAF con la salina con buffer fosfato (PBS) una volta quindi aggiungere 2 mL di orpsina/EDTA e incubare a 37 gradi centigradi per 5 min.
- Osservare al microscopio leggero per garantire che le cellule si siano dissociate nel pallone (4x o 10x). In caso contrario, estendere l'incubazione per altri 2-3 min.
- Una volta che le cellule si sono staccate e dissociate, aggiungere 10 mL di mezzo di coltura 3D per neutralizzare la trippsina/EDTA e la pipetta su e giù più volte per dissociare ulteriormente i CAF.
- Trasferire la sospensione cellulare in un tubo conico da 50 mL e girare verso il basso a 300 x g per 5 min a temperatura ambiente.
- Scartare il supernatante e risospendere nuovamente il pellet in un volume appropriato di supporto di coltura 3D (vedi Tabella dei materiali)e passare in due nuovi flaconi T75.
2. placcatura delle cellule TUM622 nella matrice extracellulare per la coltura 3D
- Il giorno prima dell'esperimento, scongelare le fiale della matrice della membrana del seminterrato in un frigorifero di 4 gradi centigradi durante la notte. Raffreddare le pipette di plastica (2 mL) e punte a -20 gradi durante la notte.
NOTA: Non tutti i lotti di matrice di membrana seminterrato hanno la stessa capacità di sostenere la crescita 3D delle cellule TUM622. Pertanto, è necessario acquisire e testare più lotti di matrice di membrana seminterrato per identificare quelli che supportano una robusta formazione di acini. Di solito, questo richiede una maggiore concentrazione proteica (16-18 mg/mL) nella matrice. - Il giorno dell'esperimento, mezzo di coltura 3D caldo, tampone HEPES, trypsin/EDTA e trypsin neutralizzazione buffer (TNS) in un bagno d'acqua a 37 gradi centigradi. Immediatamente prima di impostare la coltura, togliere la matrice della membrana del seminterrato scongelato dal frigorifero e mettere la fiala sul ghiaccio.
- Raffreddare le piastre di coltura dei tessuti su un dispositivo di raffreddamento della piattaforma metallica posto sul ghiaccio. Posizionare i tubi di centrifuga su una cremagliera di raffreddamento metallica sul ghiaccio.
- Utilizzando le cellule TUM622 ottenute dal passaggio 1.1.7, calcolare il numero desiderato di celle necessarie per la placcatura. Tipicamente, 15,000-30,0000 cellule sono necessari per pozzo di una piastra di 24 pozzetti. La densità più bassa è più adatta per l'imaging e la quantificazione, mentre una maggiore densità è preferibile quando si raccolgono cellule per l'estrazione dell'RNA o il gonfiore occidentale.
- Trasferire la sospensione cellulare in un tubo di centrifuga raffreddato (ogni tubo contenente cellule per placcatura triplicato) e girare verso il basso a 300 x g in un secchio appeso centrifuga a 4 gradi centigradi per 5 min.
- Aspirare il supernatante con una pipetta aspirante attaccata a una punta non filtrata (20 gradi l), lasciando circa 100 ll del mezzo nel tubo (usare marcature sul tubo come guida).
- Toccare delicatamente sul lato del tubo per sloggiare e dissociare il pellet prima di restituirlo al rack di raffreddamento.
- Utilizzando le pipette pre-raffreddate da 2 mL, mescolare delicatamente la matrice coniando su e giù un paio di volte mantenendo la fiala a contatto con il ghiaccio. Pipetta ad una velocità uniforme e moderata in modo che nessuna bolla venga introdotta nella matrice durante questa procedura.
- Trasferire il volume appropriato della matrice in ogni tubo di centrifuga. Per i triplicati di placcatura in una piastra di 24 pozze, aggiungere 1,1 mL di matrice di membrana seminterrato ad ogni tubo.
- Utilizzando punte pre-raffreddate, pipette la matrice in ogni tubo su e giù circa 10 volte per fare una sospensione cellulare uniforme.
- Trasferire 310 litri di sospensione cellulare/matrice in ogni pozzo di una piastra pre-raffreddata di 24 pozze. La pipetta viene posizionata ad un angolo di 90 gradi rispetto alla superficie della piastra e alle sospensioni aggiunte al centro del pozzo. Le sospensioni dovrebbero stendere e coprire l'intero pozzo senza dover inclinare la piastra.
- Per facilitare l'analisi dell'immunofluorescenza a valle, piastra la sospensione cella/matrice in parallelo in vetrini a 2 bengeni. Trasferire 100 l di sospensione cella/matrice al centro di un pozzo di 2 pozze scorrevoli camera (vedere Tabella dei materiali). Ciò consente alla matrice di formare una struttura a cupola con un volume molto più piccolo.
- Riportare la piastra e la camera scivolare di nuovo in un incubatore di coltura dei tessuti e incubare per 30 min per consentire alla matrice di solidificare. Esaminare la piastra/diapositiva al microscopio luminoso per assicurarsi che le singole cellule siano distribuite uniformemente all'interno della matrice (4x o 10x).
- Aggiungere 1 mL di coltura 3D preriscaldato mezzo completo in ogni pozzo e 1,5 mL di mezzo di coltura 3D per ogni pozzetto dello scivolo camera poi riportarli all'incubatrice.
3. Coculturing 3D di TUM622 Cellule e CAF nella matrice extracellulare
- Preparare le sospensioni delle celle di TUM622 e CAF secondo la sezione 2.
- Contare la densità cellulare CAF prendendo 10 - L di sospensione cellulare e mescolandola con 10 - L di trypan blu.
- Aggiungete 10 l della miscela a ciascuna delle due camere su un emacytometro per contare e calcolare la densità cellulare.
NOTA: i CAF hanno forme irregolari e non possono essere conteggiati con precisione su un contatore di celle automatico. - Co-incorporamento di cellule e CAF TUM622 nella matrice della membrana del seminterrato
- In base alle informazioni sulla densità delle celle, calcolare il numero desiderato di celle utilizzate per la placcatura. I FILE CAF vengono semizzati con un rapporto 2:1 delle cellule TUM622. Ad esempio, per 30.000 celle TUM622 seeded, 60.000 CAF sono co-incorporati.
- Trasferire il volume appropriato di TUM622 e le sospensioni cellulari CAF nello stesso tubo centrifuga e seguire i passaggi 2.5-2.11 per la placcatura in piastre di 24 pozze. Per l'immunofluorescenza, trasferire 60 gradi di TUM622/CAF mescolati ai vetrini della camera come descritto al punto 2.12).
- Coculturaing TUM622 con CAF sovrapposti nella matrice della membrana del seminterrato (vedere Tabella dei materiali)
- Configurare la monocultura di TUM622 in base ai passaggi 2.5-2.13.
- Trasferire il doppio del numero di sospensioni CAF (rispetto al numero di tuM622 cellule semi) in un tubo di centrifuga e girare verso il basso a 300 x g per 5 min a temperatura ambiente.
- Aspirare il supernatante e risospendere i CAF in 1 mL di media di coltura 3D.
- Trasferire la sospensione di 1 mL di CAF nel pozzo contenente le celle TUM622 incorporate.
4. Raccolta TUM622 Acini per l'estrazione di RNA/proteine e la selezione delle cellule attivate dalla fluorescenza (FACS)
- Preparare il buffer di lavaggio e il buffer di raccolta cellulare secondo il protocollo del kit di raccolta delle cellule 3D il giorno precedente e raffreddare durante la notte a 4 gradi centigradi.
- Tenere le piastre su un refrigeratore di piastra e altri reagenti sul ghiaccio prima di iniziare il processo di estrazione.
- Aspirati supporti da pozzi di coltura 3D senza toccare la matrice e lavare delicatamente il pozzo 3 volte con 1 mL di lavaggio tampone.
- Aspirare il lavaggio finale e aggiungere 1 mL di tampone di raccolta cellulare ad ogni pozzo.
- Utilizzare una punta di pipetta p1000 per raschiare la matrice da ogni pozzo.
- Pipetta su e giù per dissociare ulteriormente la matrice.
- Trasferire 1 mL della miscela su un tubo conico pre-freddo da 15 mL. Aggiungere un altro buffer di 1 mL di raccolta allo stesso pozzo.
- Ripetere i passaggi da 4,5 a 4,7 e trasferire tutto lo stesso mix in un tubo conico da 15 mL.
- Far a doccapare i tubi e la roccia a 4 gradi centigradi per 30 min.
- Riempire ogni tubo con PBS ghiacciato fino a 10 mL e quindi centrifugare a 300 x g per 5 min a 4 gradi centigradi.
- Aspirare il supernatante senza toccare il pellet. Il supernatante deve contenere frammenti di matrice, ma gli sferoidi devono essere raccolti tutti nella parte inferiore del tubo.
- Aggiungere PBS ghiacciato per un secondo lavaggio. Invertire il tubo un paio di volte per dissociare il pellet. Girare verso il basso a 300 x g per 5 min.
- Durante la filatura, preparare il buffer di lisi per la raccolta di proteine e RNA.
- Aspirare attentamente il supernatante e aggiungere il buffer di lisi per la lavorazione a valle per raccogliere proteine o RNA. In alternativa, le celle potrebbero essere risospese per l'analisi del flusso/ordinamento FACS o il passaggio seriale.
5. Immunofluorescenza di TUM622 Acini
- Preparare il buffer di immunofluorescenza (IF buffer: PBS con 0,1% di albumina del siero bovino (BSA), 0,2% Triton X-100 e 0.05% Tween-20), buffer di blocco primario (buffer IF con 10% siero di capra), buffer di blocco secondario (buffer di blocco primario con 20 g/mL anti-mouse F(ab')2)
- Media aspirata da vetrini a 2 camere, risciacquare una volta con PBS e impostare lo scivolo sul dispositivo di raffreddamento della piastra metallica sul ghiaccio. Lo scivolo della camera deve rimanere sul dispositivo di raffreddamento della piastra metallica per il resto del protocollo.
- Aggiungere pre-raffreddato 4% PFA per fissare gli acini e incubare sul ghiaccio per 20 min.
- Rimuovere il 4% di PFA e lavare tre volte con 2 mL di PBS pre-raffreddato ciascuno per 5 min con dondolo delicato su un rocker.
- Aspirate PBS e permeabilize con 1,5 mL di 0,5% Triton X-100 in PBS (pre-chilled) per 20 min. Alla fine di questa procedura, la struttura a cupola si allenterà.
- Aspirare delicatamente il buffer di permeabilizzazione dalla diapositiva della camera per evitare la perdita del campione. Ciò si ottiene aggiungendo una punta fine (20 gradi centigradi) alla pipetta aspirante e premendo la punta verso l'angolo della camera.
- Lavare tre volte con 2 mL di PBS pre-raffreddato ciascuno per 5 min con dondolo delicato su un rocker.
- Bloccare il campione con il buffer di blocco primario sul ghiaccio per 1 h.
- Rimuovere il buffer di blocco primario e aggiungere buffer di blocco secondario e il blocco per 30 min.
- Aggiungere gli anticorpi primari nel buffer di blocco primario e incubare durante la notte a 4 gradi centigradi.
NOTA: La concentrazione degli anticorpi qui utilizzati dovrebbe essere superiore al normale utilizzata per le cellule coloranti nella coltura 2D. La maggior parte degli anticorpi primari utilizzati in questo studio sono diluiti a 1:100 diluizione (vedi Tabella dei materiali). - Rimuovere gli anticorpi primari e lavare il campione 3 volte con 2 mL di tampone IF freddo.
NOTA: I campioni potrebbero essere allentati, prestare particolare attenzione quando si aspira. - Incubare i campioni negli anticorpi secondari diluiti nel buffer di blocco primario per 1 h a RT. Gli anticorpi secondari preferiti devono essere adsorbiti altamente incrociati per ridurre la colorazione dello sfondo. La maggior parte degli anticorpi secondari utilizzati in questo studio sono diluiti a 1:200 diluizione.
- Rimuovere gli anticorpi secondari e lavare il campione 3 volte con 2 mL di tampone IF freddo.
NOTA: I campioni potrebbero essere allentati, prestare particolare attenzione quando si aspira. - Aggiungere PBS con DAPI (1:1,000 diluizione) durante l'ultimo lavaggio per macchiare il nucleo. L'esecuzione di altri 2 lavamenti in PBS.
- Immagina i campioni su un microscopio confocale entro 3 giorni.
NOTA: a causa delle dimensioni degli organoidi e dei limiti della distanza di lavoro dell'obiettivo, i campioni sono di solito immagini a un ingrandimento 10x o 20x.
6. Preparazione di campioni di cultura 3D per l'immunostochimica
- Mezzo aspirato da due vetrini camera e risciacquare una volta con PBS.
- Fissare le colture 3D nel 4% PFA a 37 gradi durante la notte.
- Rimuovere il 4% di PFA, colture surround con 2,5 mL di gel campione di istologia (vedi Tabella dei materiali) e posizionare lo scivolo a 4 gradi centigradi per solidificare per almeno 1 h.
- Trasferire campioni circondati con gel campione istologico a cassette di tessuto e lavorati in un processore di campioni di tessuto automatizzato durante la notte.
- Incorporare i campioni in cera di paraffina e prepararsi per la sezionamento12.
7. 3D Cytotoxicity Saggio per lo screening composto (Esempio per una piastra da 96 pozzetto)
- Mettere una piastra di 96 pozze su un refrigeratore di piastra, un serbatoio da 25 mL su un refrigeratore e un tubo conico da 15 mL sul ghiaccio prima di iniziare l'esperimento.
- Preparare le sospensioni a matrice cellulare delle cellule TUM622 in un tubo conico in polipropilene pre-raffreddato da 15 mL aggiungendo il volume appropriato della matrice della membrana del seminterrato alle cellule. La densità desiderata per le cellule TUM622 è di 10.000 celle per 70-75 - L della matrice della membrana del seminterrato. Pipette su e giù un paio di volte per consentire anche la miscelazione di cellule all'interno della matrice.
- Spostare la piastra con piastra più fredda e serbatoio con un refrigeratore serbatoio lontano dal ghiaccio ad una superficie asciutta per evitare il contatto della matrice della membrana seminterrato con ghiaccio durante il trasferimento.
- Trasferire la miscela di cellule a matrice nel serbatoio di raffreddamento senza creare bolle.
- Utilizzando una pipetta multicanale meccanica (10-300 ) , trasferire 70-75 celle di miscela in ogni pozzo appropriato di una piastra di 96 pozze.
- Incubare la piastra a 37 e il 5% di CO2 per 30 min per solidificare la matrice della membrana del seminterrato.
- Aggiungete 100 l di supporti in tutte le file e riportare la piastra all'incubatrice.
- Iniziare il dosing composto il giorno successivo o più tardi a seconda dell'obiettivo dell'esperimento.
- Gli sferoidi possono essere ri-nutriti e re-dopanti ogni 2-3 giorni per un massimo di 10 giorni, rimuovendo i supporti spesi con un collettore di vuoto di 8 o 12 pozze tramite e sostituendo con supporti freschi con o senza composti desiderati.
- Il numero di sferoidi TUM622 potrebbe essere quantificato utilizzando imager 3D secondo il protocollo del produttore.
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Representative Results
TUM622 e CAF nelle impostazioni cultura 2D
Figura 1 presenta la morfologia tipica delle cellule TUM622 e CAF nella coltura 2D. Le cellule TUM622 sono arrotondate con grandi nuclei, mentre i CAF sono piatti e allungati. Le cellule TUM622 possono raggiungere l'80%-90% di confluenza nella coltura. Un'ulteriore proliferazione porta a più, ma le cellule più piccole aggregate in colonie che non entrano in contatto diretto. Al contrario, i CAF preferiscono crescere a una maggiore densità cellulare e continueranno a proliferare a piena confluenza se vengono forniti nutrienti sufficienti.
Crescita e morfologia di TUM622 acini in 3D ECM
La figura 2 presenta un esperimento di percorso temporale delle cellule TUM622 semiseed in coltura 3D. I dati mostrano che singole cellule TUM622 sono in grado di formare organoidi con morfologie acinari quando incorporate. Tra i giorni 5 e 7, un lume diventa evidente nelle strutture acinari e rimane vuoto in seguito (Figura 2A). Ogni acinus, composto da un monostrato di cellule che circondano il lume cavo, mostra una polarità apicale-basale corretta simile a quella dell'epitelio polmonare in vivo (Figura 2B). Queste strutture acinari sono iperplastiche e continuano a crescere finché vengono forniti nutrienti sufficienti. La cultura può essere mantenuta fino a 24 giorni prima che l'ECM si disintegri completamente (Figura 2C). Limitando l'analisi di diluizione (LDA) (dati non visualizzati), si stima che solo una rara sottopopolazione di cellule TUM622 (<0,02%) hanno la capacità di formare strutture acinari che assomiglianoa 9.
Crescita e morfologia della cocultura TUM622-CAFs
Nella figura 3 sono illustrati i risultati di configurazione e rappresentativi delle coculture TUM622-CAF. I CAF potrebbero essere integrati nella cocultura sovrapponendosi alla matrice o co-incorporati con le celle TUM622. Indipendentemente dalla configurazione, la presenza di ANF ha notevolmente migliorato il numero e le dimensioni degli sferoidi formati (Figura 3B). È interessante notare che, quando TUM622 acini si avvicina no?Figure 3C Si noti che gli acini TUM622 nella monocoltura non mostrano un comportamento invasivo e formano solo strutture simili a "tear-drop" quando sono vicine ai CAF.
Risultati rappresentativi dell'immunofluorescente e dell'immunohistochimica
La figura 4 mostra i risultati rappresentativi dell'immunofluorescenza e della colorazione immunohistochimica di TUM622 acini dopo 10 giorni di coltura. Le immagini confocali sono state scattate sul piano equatoriale di TUM622 acini color macchiato immunofluorescente(Figura 4A). Al contrario, ogni sezione del campione di immunohistochimica può catturare acini su piani diversi (Figura 4B). Entrambi i risultati hanno mostrato un'espressione eterogenea di cellule simili a stelo e differenziate all'interno di ogni acinus.
TUM622 3D citotossicità saggio utilizzando un inibitore della via Wnt
La figura 5 mostra la risposta alla dose di TUM622 acini trattata con XAV939, un inibitore della tankyrase (Figura 5A,B). XAV939 è stato aggiunto alla cultura 1 giorno dopo placcatura e aggiornato ogni 2 giorni per un totale di 10 giorni. Alla fine dell'esperimento, il numero di acini è stato quantificato da un imager. Le immagini di Brightfield con un ingrandimento più elevato sono state acquisite anche per catturare la morfologia degli sferoidi in controllo rispetto ai pozzi trattati con XAV939 (Figura 5C). Nel complesso, XAV939 mostra l'inibizione dipendente dalla dose sulla formazione di acini e altera l'architettura tissutale degli sferoidi formati. Questi risultati suggeriscono che l'attivazione della via Wnt canonica è necessaria durante la morfogenesi acinare TUM622.
Figura 1: TUM622 e CAF nelle impostazioni cultura 2D. Rappresentativo delle immagini a campo luminoso delle cellule TUM622 e dei CAF coltivate in 2D. Barra della scala: 100 m. Questa cifra è stata modificata da Chen et al.9 e utilizzata con il permesso. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Crescita e morfologia di TUM622 acini in 3D ECM. (A) Immagini del corso temporale delle cellule TUM622 coltivate nella matrice della membrana del seminterrato in un periodo di 10 giorni. Barra di scala - 100 m. (B) Immunofluorescenza di TUM622 acini macchiata con marcatori di polarità delle cellule apili-basali, Golgi-enzima (GM-130, verde, apicale) e Integrin alpha 6 (CD49f, basal, rosso). (C) Quantificazione del numero di acini (asse y destro, rosso) e dimensione media di acini (asse y sinistro, blu) placcato in triplice copia in una piastra di 24 piani per 24 giorni di coltura. Le barre di errore rappresentano SD. Questa cifra è stata modificata da Chen et al.9 e utilizzata con il permesso. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Crescita e morfologia della cocultura TUM622-CAFs. (A) Disegno schematico dell'impostazione della cocultura TUM622-CAF. I CAIf sono sovrapposti o co-incorporati con celle TUM62 in ECM. Dopo 6-12 giorni in cocultura, le cellule TUM622 sono in grado di formare acini sempre più grandi rispetto alla monocoltura e invadere l'ECM quando sono in stretta vicinanza e contatto diretto con i CAF. Si noti che il fenotipo invasivo potrebbe essere osservato solo nella co-coltura. (B) Immagine di campo luminoso delle colture TUM622 3D in presenza o assenza di CAF sovrapposti dopo 8 giorni. Le barre di scala (C) Immagini di Brightfield che mostrano la formazione di acini a forma di goccia nelle coculture, indipendentemente dai CAIf, sono sovrapposte o co-incorporate nell'ECM. Barre della scala: 200 m. Questa cifra è stata modificata da Chen et al.9 e utilizzata con il permesso. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Risultati rappresentativi immunofluorescenti e immunohistochimica. (A) Colorazione anticorpale di acini con marcatori di cellule staminali/progenitrici (CXCR4 e SOX2), mesenchyme (Vimentin), differenziazione epiteliale (Involucrin), apoptosi (Cleaved-Caspase-3) e proliferazione (Ki67) in verde, DAPI in blu, E-cadherin e Phalloidin in rosso. Barra della scala - 50 m. (B) Immunostochimica su sezioni FFPE di TUM622 acini. Barra della scala: 100 m (in alto) e 50 m (in basso). Questa cifra è stata modificata da Chen et al.9 e utilizzata con il permesso. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: TUM622 citotossicità 3D utilizzando un inibitore della via Wnt. (A) Quantificazione del numero di sferoidi in una piastra di 96 pozzeini in cui le cellule TUM622 sono state trattate con apelossido di dimetilo (controllo) o XAV939. Ogni condizione è di attualizzata in triplicati. Le barre di errore rappresentano SD. (B) Immagini intere di un pozzo di 24 pozze scattate con un imager che mostra gli effetti inibitori di XAV939 sulla formazione di acini. (C) Immagini rappresentative del campo luminoso dei pozzi di controllo e dei pozzi trattati che dimostrano i cambiamenti morfologici causati dal trattamento Con XAV939. Barre della scala: 100 m. Questa cifra è stata modificata da Chen et al.9 e utilizzata con il permesso. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
I tumori sono tessuti eterogenei composti da cellule tumorali coesistenti fianco a fianco con cellule stromali come fibroblasti associati al cancro, cellule endoteliali e cellule immunitarie all'interno dell'ECM. Insieme, questi diversi componenti si incrociano e influenzano il microambiente tumorale, svolgendo un ruolo attivo nel guidare la tumorigenesi, un processo che comporta cambiamenti progressivi nell'architettura tumorale. Idealmente, un modello in vitro di sviluppo del tumore dovrebbe essere in grado di catturare i cambiamenti architettonici del tessuto dinamico osservati nei tumori umani in vivo, la complessa interazione di diversi tipi di cellule all'interno del microambiente tumorale e allo stesso tempo consentire manipolazione sperimentale sia sulle cellule tumorali che sui componenti del TME. Anche se negli ultimi anni sono stati compiuti molti progressi nei modelli di cancro 3D, tali modelli non sono stati facilmente disponibili per LUSC. La maggior parte dei modelli riportati fino ad oggi incorpora solo alcuni aspetti di queste importanti caratteristiche. Qui riportiamo i metodi per un sistema di cocultura 3D di LUSC che cattura contemporaneamente i cambiamenti architettonici dei tessuti chiave osservati durante lo sviluppo di LUSC, nonché le interazioni dinamiche tra le cellule tumorali e i principali componenti del TME, tra cui l'ECM e i CAF.
La capacità di questo sistema di modellare in modo più accurato i cambiamenti architettonici dei tessuti si basa sulla proprietà unica delle cellule TUM622 nella formazione di organoidi con morfologie acinariche quando incorporate in 3D EC. Formata da una singola cellula auto-rinnovante, ogni acinus è composto da un monostrato di cellule che circondano un lume cavo. Questo mostrato di cellule presenta la polarità cellulare apicale-basale e rimane non invasivo, simile all'architettura tissutale dell'epitelio polmonare. Mentre TUM622 come una monocoltura 3D mostra la crescita iperplastica, l'aggiunta di CAF migliora ulteriormente la morfogenesi acida e induce sempre più acini a formarsi. È importante sottolineare che i CAF invocano cambiamenti dell'architettura dei tessuti dinamici nelle cellule TUM622 quando i due tipi di cellule si avvicinano, consentendo alle cellule TUM622 di perdere la polarità apicale-basale e invadere la matrice verso i CAF. Questi cambiamenti fenotipici riassumono sia l'iperplasia precoce che gli stadi tardivi invasivi di LUSC.
A differenza di molti modelli di sferoide tumorale in cui ogni sferoide è formato dall'aggregazione di molte cellule, ogni acinus TUM622 è derivato da una singola cellula9. Con l'LDA in vitro, si stima che solo una sottopopolazione minore (0,02%) di cellule TUM622 hanno tale capacità9. Anche se rare, queste cellule potrebbero rinnovarsi come dimostra la loro capacità di subire il passaggio seriale in 3D, nonché differenziarsi in una popolazione eterogenea di cellule simile a quella del tumore originale. A causa di questa caratteristica unica delle cellule TUM622, è fondamentale garantire la distribuzione uniforme delle singole celle TUM622 all'interno dell'ECM al momento della placcatura per la coltura di successo e l'analisi a valle. Per raggiungere questo obiettivo, è necessario seguire attentamente diversi punti chiave nel protocollo, tra cui la determinazione di un'adeguata densità di semina, mantenendo freschi tutti gli strumenti e i reagenti durante la miscelazione di cellule e matrici per evitare la solidificazione prematura, evitando l'introduzione di bolle durante il processo di miscelazione e consentendo il tempo sufficiente per la matrice per solidificarsi completamente prima di aggiungere il mezzo di coltura. Insieme, queste precauzioni aiuteranno a ottenere un substrato matrice più uniforme e condizione di coltura per tutte le cellule incorporate.
Una volta stabilita con successo, questa coltura può essere utilizzata per una varietà di analisi a valle per sezionare la cellula e il processo biochimico che regolano la tumorigenesi. Il numero e le dimensioni degli acini formati in ogni pozzo possono essere monitorati nel tempo con immagini di campo luminoso e utilizzati come lettura per la capacità proliferale e di auto-rinnovamento delle cellule TUM622. Dinamica più dettagliata nella morfogenesi di ogni acinus potrebbe essere osservata con l'imaging dal vivo al microscopio confocale, con o senza vari coloranti di etichettatura. Il mezzo condizionato può essere raccolto in più momenti temporali durante il periodo di coltura per analizzare i fattori solubili che possono mediare le contro-cellule cellulari o cellule-matrici. Le cellule TUM622 estratte direttamente dall'ECM utilizzando il protocollo 4 sono adatte per l'estrazione di RNA e proteine per l'analisi dell'espressione genica, la quantificazione della citometria del flusso o lo smistamento FACS in base ai marcatori di superficie cellulare. In alternativa, le colture potrebbero essere fissate per l'immunofluorescenza in situ o gli studi di immunohistochimica per comprendere le distribuzioni spazio-temporali di vari marcatori. Anche se simile, l'immunohistochimica integra i metodi di immunofluorescenza in quanto consente il campionamento di interi acini che potrebbero non essere possibili a causa della limitazione della profondità di imaging degli obiettivi confocali. Per entrambi questi metodi, il tempo e la temperatura in cui vengono eseguite la fissazione e la permeabilizzazione sono fondamentali, soprattutto in considerazione del fatto che le cellule TUM622 sono incorporate in una matrice densa (>90% di membrana scantinata) in contrasto con molte altre colture 3D in cui densità di matrice è molto più bassa. Pertanto, è necessaria attenzione alla fissazione e all'elaborazione standardizzate e coerenti per ottenere risultati replicativi.
Utilizzando questo sistema come piattaforma, si può quindi studiare come le cellule intrinseche cambiano le cellule tumorali, così come i cambiamenti estrinseci delle cellule nel microambiente tumorale, influenzano l'architettura epiteliale e modellano i primi eventi coinvolti nella formazione di carcinoma. Ad esempio, i ruoli degli oncogeni o dei geni soppressori tumorali nella regolazione dell'architettura del tessuto tumorale potrebbero essere studiati mediante esperimenti di guadagno o perdita di funzione che prendono di mira il gene di interesse per le cellule tumorali. Infatti, abbiamo dimostrato che la sovraespressione di SOX2, che è comunemente osservata in LUSC, altera il fenotipo delle cellule TUM622 come evidenziato da una perdita di iperplasia in 3D e la progressione verso la crescita displastica9. D'altra parte, si potrebbero confrontare i fibroblasti normali con fibroblasti associati al cancro nelle impostazioni di cocultura, determinare come i componenti della matrice o la sua rigidità influenzano la crescita/morfologia/invasione dell'acini e se il blocco di determinate citochine potrebbe interferire con la comunicazione cellulare-cellula e a sua volta influenzare l'architettura dei tessuti e la progressione del tumore. È importante sottolineare che tutti questi saggi potrebbero essere eseguiti in presenza o assenza di alcuni agenti terapeutici ed essere utilizzati come strumento per determinare la risposta farmacologica delle cellule LUSC con una lettura multidimensionale11. È anche importante notare che questo sistema è limitato per quanto riguarda i percorsi che potrebbe essere utilizzato per interrogare, poiché solo alcuni ma non tutti i principali percorsi di segnalazione regolano la crescita e la morfologia degli organiidi TUM622 nella coltura (cioè, l'inibizione della segnalazione di Wnt ma notch influisce sulla mofogenesi acinara delle cellule TUM622)9.
Riassumendo, dimostriamo che questo sistema organoide fornisce una piattaforma unica per generare nuove intuizioni sull'interazione dinamica tra le cellule LUSC e il microambiente tumorale durante la progressione del tumore. Prevediamo che il nostro sistema modello sarà una piattaforma preziosa per la scoperta e lo sviluppo di farmaci. A questo proposito, lo screening di nuove terapie anti-cancro in un contesto nativo del tessuto tumorale dovrebbe aiutare nella selezione e nello sviluppo di terapie più efficaci rivolte a LUSC.
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Disclosures
Gli autori sono dipendenti e azionisti di Pfizer Inc.
Acknowledgments
Ringraziamo Magali Guffroy, John Kreeger e Stephani Bisulco del gruppo Pfizer-Oncology Histopathology and Biomarker per il supporto patologico/istologico e Michael Arensman per la revisione critica del manoscritto. Ringraziamo anche il pfizer Postdoctoral Program e il gruppo Oncology R&D, in particolare Robert Abraham, Puja Sapra, Karen Widbin e Jennifer Tejeda per il loro sostegno al programma.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bronchial Epithelial Growth Medium | Lonza | CC-3170 | BEGM |
| Cell Strainer 40um | ThermoFisher | 352340 | For passing TUM622 cells |
| Cleaved Caspase 3 antibody | Cell Signaling Technology | 9661 (RRID:AB_2341188) | Rabbit |
| CoolRack CFT30 | Biocision | BCS-138 | For 3D culture |
| CoolSink XT96F | Biocision | BCS-536 | For 3D culture |
| Cultrex 3D Cell Harvesting Kit | Bio-Techne | 3448-020-K | |
| Cultrex (preferred for co-culture) | Bio-Techne | 3443-005-01 | For 3D culture |
| CXCR4 antibody | Abcam | Ab124824 (RRID:AB_10975635) | Rabbit |
| E-cadherin antibody | BD Biosciences | 610182 (RRID:AB_397581) | Mouse |
| GelCount | Oxford Optronix | For Acini counts and measurements | |
| GM130 antibody | BD Biosciences | 610822 (RRID:AB_398141) | Mouse |
| Goat Serum | Vector Labs | S1000 (RRID:AB_2336615) | For Immunofluorescence |
| Heat-inactivated FBS | Gibco | 10082-147 | For CAFs |
| Histology sample gel | Richard Allan Scientific | HG-4000-012 | For Immunofluorescence |
| Integrin alpha 6 antibody | Millipore Sigma | Mab1378 (RRID:AB_2128317) | Rat |
| Involucrin antibody | Abcam | Ab68 (RRID:AB_305656) | Mouse |
| Ki67 antibody | Abcam | Ab15580 (RRID:AB_443209) | Rabbit |
| Lab-Tec II chambered #1.5 German Coverglass System | Nalge Nunc International | 155379 (2) | For 3D culture |
| Lab-Tec II chambered #1.5 German Coverglass System | Nalge Nunc International | 155409 (8) | For 3D culture |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | For CAFs |
| Matrigel (preferred for mono-culture) | Corning | 356231 | For 3D culture |
| p63 antibody | Cell Signaling Technology | 13109 (SRRID:AB_2637091) | Rabbit |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | For CAFs |
| ReagentPack Subculture Reagents | Lonza | CC-5034 | For TUM622 cell dissociation |
| RPMI | ThermoFisher | 11875-093 | For CAFs |
| Sox2 antibody | Cell Signaling Technology | 3579 (RRID:AB_2195767) | Rabbit |
| TrypLE Express | Gibco | 12604-021 | For CAF dissociation |
| Vi-Cell | Bechman Coulter | Automatic cell counter | |
| Vimentin antibody | Abcam | Ab92547 (RRID:AB_10562134) | Rabbit |
| β-catenin antibody | Cell Signaling Technology | 2677s (RRID:AB_1030943) | Mouse |
References
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