Wir präsentieren eine Methode, die Membranproteinreinigung und Rekonstitution zu Peptidiscs in einem einzigen chromatographischen Schritt kombiniert. Biotinylatierte Gerüste werden zur direkten Oberflächenbefestigung und Messung von Protein-Ligand-Wechselwirkungen mittels Biolayer-Interferometrie eingesetzt.
Membranproteine, einschließlich Transporter, Kanäle und Rezeptoren, machen fast ein Viertel des zellulären Proteoms und mehr als die Hälfte der aktuellen Wirkstoffziele aus. Ein großes Hindernis für ihre Charakterisierung und Ausbeutung im akademischen oder industriellen Umfeld besteht jedoch darin, dass die meisten biochemischen, biophysikalischen und medikamentösen Screening-Strategien erfordern, dass sich diese Proteine in einem wasserlöslichen Zustand befinden. Unser Labor hat vor kurzem die Peptidisc entwickelt, eine Membran-Mimetik, die einen “One-size-fits-all”-Ansatz für das Problem der Membranproteinlöslichkeit bietet. Wir präsentieren hier ein schlankes Protokoll, das Proteinreinigung und Peptidisc-Rekonstitution in einem einzigen chromatographischen Schritt kombiniert. Dieser Workflow, peptiQuick, ermöglicht die Umgehung der Dialyse und Inkubation mit Polystyrolperlen und reduziert damit die Exposition gegenüber Waschmitteln, Proteindenaturierung und Probenverlust erheblich. Wenn PeptiQuick mit biotinylierten Gerüsten durchgeführt wird, kann das Präparat direkt an Streptavidin-beschichteten Oberflächen befestigt werden. Es besteht keine Notwendigkeit, das Membranproteinziel zu biotinylatieren oder zu modifizieren. PeptiQuick wird hier mit dem Membranrezeptor FhuA und antimikrobiellem Ligandkolicin M vorgestellt, mit Hilfe der Biolayer-Interferometrie, um die genaue Kinetik ihrer Interaktion zu bestimmen. Es wird der Schluss gezogen, dass PeptiQuick eine bequeme Möglichkeit ist, Membranprotein-Ligand-Wechselwirkungen innerhalb eines Tages in einer waschmittelfreien Umgebung vorzubereiten und zu analysieren.
Membranproteine sind oft von Denk- oder Antikörperforschungsprogrammen ausgeschlossen, da Membranproteine außerhalb der Lipid-Zweischichtumgebung aggregieren, insbesondere in Gegenwart von Detergenzien1. Daher wurden in den letzten Jahren mehrere Membranmimetiken (sogenannte Gerüste) entwickelt, um die Isolierung und Abfrage von Membranproteinen in einer vollständig waschmittelfreien Umgebung zu erleichtern (z. B. Nanoscheiben, SMALPs, Amphipols usw.). 2,3,4,5,6. Die Rekonstitution von Membranproteinen in diesen Mimetiken erfordert jedoch oft eine umfassende Optimierung, die zeitaufwändig ist und in der Regel mit dem Verlust der Proteinrückgewinnung7,8einhergeht. Um diese Einschränkungen zu überwinden, hat unser Labor vor kurzem eine “One-size-fits-all”-Formulierung entwickelt, die als Peptidisc9bekannt ist. Die Peptidisc entsteht, wenn mehrere Kopien eines 4,5 kDa-amphipathischen bihelischen Peptids an die hydrophobe Oberfläche eines Zielmembranproteins binden. Eine stabile Rekonstitution in Peptidisc erfolgt bei entfernung durch Reinigungsmittel, indem sowohl endogene Lipide als auch lösliche Membranproteine in wasserlösliche Partikel eingeschlossen werden. Diese stabilisierten Partikel sind nun für zahlreiche nachgeschaltete Anwendungen zugänglich.
Die Peptidisc-Methode bietet mehrere Vorteile; Zum Beispiel ist die Rekonstitution einfach, da die Bindung des Peptidisc-Gerüstes an das Ziel durch die Proteinschablone selbst9,10geleitet wird. Die Peptidstoichiometrie ist ebenfalls selbstbestimmt, und eine Zugabe von exogenen Lipiden ist nicht notwendig. Die Peptidbildung erfolgt durch einfache Waschmittelverdünnung, ein wichtiger Vorteil gegenüber der Dialyse oder Adsorption auf Polystyrolperlen, die oft aufgrund einer unspezifischen Oberflächenassoziation und Aggregation zu einem geringen Proteinertrag führen11,12 ,13. Die endgültige Peptidisc-Baugruppe ist hochthermostabil und ausnahmslos in verschiedenen Puffern oder in Gegenwart von divalenten Kationen (z.B. Ni2+)löslich. Die Reinheit und strukturelle Homogenität des Gerüstes ist ebenfalls hoch (z.B. Endotoxinfrei), und das Peptid kann mit funktionellen Gruppen an verschiedenen Positionen angepasst werden.
Wir präsentieren hier einen Labor-Workflow namens PeptiQuick, auch bekannt als On-Perlen-Rekonstitution9. Dieses Protokoll kombiniert Membranproteinreinigung und Peptidisc-Rekonstitution in einem einzigen Schritt und auf der gleichen chromatographischen Unterstützung. Wie der Name schon sagt, PeptiQuick ist schnell im Vergleich zu anderen Rekonstitutionsmethoden, und es reduziert auch ernsthaft die Expositionszeit gegenüber Reinigungsmittel. Negative Waschmitteleffekte wie Proteinentfaltung und Aggregation treten oft zeitabhängig auf; Daher ist die Minimierung der Waschmittelexposition entscheidend, um die native Proteinkonformation14,15aufrecht zu erhalten. Dies ist entscheidend für die Genauigkeit von Methoden, die über Proteinwechselwirkungen und Ligandenbindungsaffinitäten berichten.
Bei der Entwicklung dieses Protokolls stellen wir die neuartige biotinytierte Version des Peptidisc-Gerüsts vor, das als Bio-Peptidisc bezeichnet wird. Die biotinfunktionellen Gruppen ermöglichen die Befestigung des Zielmembranproteins auf Streptavidin-beschichteten Oberflächen. Da die Biotinkennzeichnung auf das Gerüst beschränkt ist, bleiben Bindungsstellen am Zielmembranprotein unverändert. Mit Bio-Peptidisc werden die Bindungskinetik des bakteriellen Membranrezeptors FhuA und des antimikrobiellen Peptids Kolikin M (ColM) bestimmt16. Diese Affinität wird mittels Biolayer-Interferometrie (BLI) gemessen, die Wechselwirkungen in Echtzeit anhand von Interferenzmustern für weißes Licht analysiert, die von einer Sensorspitze reflektiert werden.
Durch die Verwendung dieses Protokolls entfällt der Bedarf an Reinigungsmitteln während der BLI-Analyse, was eine wichtige Entwicklung darstellt, da Detergenzien Wechselwirkungen stören können. Bindungsaffinitäten können mit dieser Methode schnell gemessen werden, und die Ergebnisse sind vergleichbar mit denen, die früher mit Nanoscheiben und isothermen Titrationskalorimetrie (ITC)16berichtet wurden. Die kritischen Schritte im PeptiQuick-Workflow werden gezeigt und diskutiert, wie Proteinzubereitung, Waschmittelverdünnung, Peptidzugabe und Rekonstitution sowie Tipps zur Fehlerbehebung bei Liganden und Analytbindung im BLI-Assay. Mit hilfe des PeptiQuick-Workflows wird festgestellt, dass Membranproteine in Peptidiscs erfasst und ihre Wechselwirkungen innerhalb eines Tages gemessen werden können.
Während Detergenzien nach wie vor die einfachste Methode zur Extraktion und Reinigung von Membranproteinen sind, können diese Tenside viele unerwünschte Auswirkungen auf die Proteinstabilität, -funktion und die nachgeschalteten Analysen1,2,3, 4,5,6,7,8,9. Diese Schwierigkeiten haben die Entwicklung von Membran-Mimetik motiviert, die darauf abzielen, das Vorhandensein von Detergenzien zu minimieren und die native Membranumgebung so weit wie möglich zu replizieren2,3,4 ,5,6. Die meisten Rekonstitutionsmethoden erfordern jedoch eine signifikante Optimierung der Rekonstitutionsbedingungen und erfordern oft zusätzliche Reinigungsschritte, die den Endertrag7,8verringern. Die Peptidisc passt sich spontan an das Zielmembranprotein an und erfordert vergleichsweise wenig Optimierung und nachgeschaltete Reinigung9,10. In diesem Protokoll wird PeptiQuick als einfaches Mittel zur Rationalisierung des Rekonstitutionsprotokolls für die nachgeschaltete Protein-Protein-Interaktionsanalyse vorgestellt.
Obwohl einfach, gibt es mehrere experimentelle Vorbehalte, die zu einer erfolglosen Rekonstitution führen können. Unter diesen, die häufigste ist durch Protein-Aggregation. Daher ist es wichtig, eine Größenausschlusschromatographie durchzuführen, um den Rekonstitutionsprozess zu überwachen. Beispielsweise ist ein Größenausschluss-Spitzenwert, der am Leerraumvolumen eluiert, ein Hinweis auf Proteinaggregate (Abbildung 3B)17,18. Membranproteinaggregate bilden sich typischerweise bei längerer Exposition gegenüber suboptimalen Waschmittelbedingungen vor der Rekonstitution. Insbesondere wurde festgestellt, dass Membranproteine in Detergenzien dazu neigen, Aggregate zu bilden, wenn sie durch Ultrafiltration auf Zentrifugalvorrichtungen konzentriert werden. In diesem Fall können empfindliche Membranproteine mit Vakuum-Ultrafiltration konzentriert werden, einer schonenderen und homogeneren Konzentrationsmethode, da die Adsorption von Proteinen an den Filter verringert wird.
Im Allgemeinen sollten zur Vermeidung der Proteinkonzentration die eluierten IMAC-Fraktionen gepoolt und ein Aliquot auf eine Größenausschlussspalte injiziert werden, um die Rekonstitutionsqualität zu überprüfen. Es sei darauf hingewiesen, dass frei von der Freien Peptidung kurz nach dem Hauptpeptidisc-Peak(Abbildung 3B) nicht inkorporiert. Das freie Gerüst behindert nicht unbedingt nachgelagerte Experimente. Bei Bedarf kann dieser Überschuss jedoch durch die Größenausschlusschromatographie entfernt werden. Alternativ reicht die Erhöhung des Waschvolumens während der Rekonstitution und vor der Elution aus dem IMAC-Harz aus, um den größten Teil des freien Peptidpeptids effektiv zu entfernen. Daher wird die Größenausschlusschromatographie als schnelles und einfaches Mittel zur Überprüfung der Rekonstitutionsqualität empfohlen.
Das BLI-Experiment erfordert eine sorgfältige Optimierung der Liganden- und Analytkonzentrationen. Ligandbindung muss ausreichen, um ein klares Signal zu erhalten, aber Überlastung führt zu Signalsättigung, was zu Datenartefakten durch Überfüllung und sterische Behinderung auf der Spitzenoberfläche führt. Daher müssen sowohl die Konzentration des Liganden als auch die Zeitdauer, die die Spitze in der Ligandenlösung verbringt, für jede Proteinprobe optimiert werden (Ergänzende Abbildung 2). Auch die Analytkonzentration muss optimiert werden. Wenn die Dissoziationskonstante bekannt ist, wird dieser Schritt einfacher, da der Konzentrationsbereich angenähert werden kann. Ein guter Ausgangspunkt für diese Analyse ist die Verwendung von Proteinkonzentrationen zwischen dem 0,1- und dem 20-fachen des erwarteten Kd19.
Nach der BLI-Datenerfassung muss eine sorgfältige Datenanalyse durchgeführt werden, um Fehlinterpretationen zu vermeiden. Die Berechnung der Dissoziationskonstante hängt von der Passung einer Bindungskurve ab. Sofern die Bindungsstoichiometrie nicht bereits bekannt ist, sollte für die Erstmontage ein klassisches 1:1-Bimolekulare Interaktionsmodell verwendet werden. Es sei darauf hingewiesen, dass eine heterogene Bindungskurve oft das Ergebnis von Artefakten und einem nicht idealen Verhalten ist, das durch eine hohe Analytkonzentration verursacht wird, die als komplexes Bindungsmodell fehlinterpretiert werden kann. Daher kann das Senken der Analytkonzentration, bis das Sensorgrammprofil 1:1-Bindungsstoichiometrie anzeigt, dazu beitragen, heterogene Bindungen von komplexeren Wechselwirkungen zu unterscheiden. Alle verbleibenden heterogenen Bindungsdaten werden dann diskontiert, wie in Abbildung 420dargestellt.
In diesem Bericht wird eine Dissoziationskonstante von 2,28 x 0,74 nM für die FhuA-ColM-Wechselwirkung gemessen. Dieser Wert stimmt mit der zuvor in unserer Gruppe mit Nanodisc oder Peptidisc mit ITC bzw. MST ermittelten Dissoziationskonstante überein (Abbildung 4E)16. Diese Konsistenz gibt Vertrauen in die Peptidisc-Rekonstitution und BLI-Analyse als Mittel zur Bestimmung der Interaktionskinetik. Wichtig ist, dass Proteine in der Regel auf Streptavidin-Biosensoren immobilisiert werden, entweder durch biotinchemische Vernetzung oder ortsspezifische Zugabe mit dem E. coli biotin ligase BirA21. Offensichtlich hat die Biotinylatierung des Peptidisc-Gerüsts anstelle des Zielmembranproteins viele Vorteile. Gerüstbiotinylierung spart Zeit und minimiert das Potenzial, wichtige Proteinbindungsstellen zu stören. Wir haben auch festgestellt, dass PeptiQuick auf eine breite Palette von Protein-Zielklassen anwendbar ist, einschließlich G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs), Ionenkanäle und Membranproteine. Im Allgemeinen ist zu beachten, dass der anfängliche Waschmittelextrakt von Membranproteinen in einen aggregatfreien Zustand kritisch ist und dass die sofortige Rekonstitution bei Peptidisc nachgelagerte Aggregationsprobleme verringert. Angesichts der Einfachheit ist vorgesehen, dass PeptiQuick auf andere Streptavidin-basierte Bindungstests wie Oberflächenplasmonresonanz (SPR), ELISA-Assays und Affinitäts-Pull-Downs mit Streptavidin-Perlen ausgedehnt wird.
The authors have nothing to disclose.
Wir danken dem Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada. JS besitzt ein CGS-M CIHR-Stipendium. LT wurde vom Biotechnology and Biological Sciences Research Council unterstützt, der vom South West Biosciences Doctoral Training Partnership [Ausbildungsstipendium Referenz BB/M009122/1] finanziert wurde. FD ist ein Tier II Canada Research Chair.
30 kDa cut-off centrifugal concentrator | Millipore Sigma | C7715 | – |
Ampicillin | BioShop | 69-52-3 | Sodium Salt |
Bio-Peptidisc Peptide | Peptidisc Biotech | https://peptidisc.com | – |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | 9048-46-8 | Lyophilized powder |
CaCl2 | Fisher Chemical | 10035-04-8 | Certified ACS |
EDTA | BioShop | 6381-92-6 | Biotechnology Grade |
Ettan LC (AKTA) | Amersham Pharmacia Biotech | 18-1145-58 | – |
Glucose | BioShop | 50-99-7 | Anhydrous, Reagent Grade |
Glycerol | Fisher Chemical | 56-81-5 | Certified ACS |
Imidazole | BioShop | 288-32-4 | Biotechnology Grade |
Lauryldimethylamine oxide (LDAO) | Sigma | 101822204 | ~30% in H2O |
MgSO4 | Fisher Chemical | 10034-99-8 | Certified ACS |
Microfluidizer | Microfluidics | M-110L | Fit with F20Y 75µ diruption chamber |
Ni-NTA Resin | Gold Biotechnology | H-320-50 | – |
Non-binding 96well BLI Plate | Greiner Bio-one | 655076 | Microplate, PS, 96 well, F-Bottom (chimney well), Black, Fluotrac, Med. Binding |
Octet Red96 | FortéBio | OCTET RED96E-GxP | Octet RED96e instrument, Octet CFR software, desktop computer, LC monitor, accessory kit, IQ/OQ kit, PQ Kits and one-year warranty |
Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) | Sigma | P-7626 | – |
Protein Assay Dye – Reagent Concentrate | Bio-Rad | 5000006 | Used in the bradford assay to determine protein concentration – 5x concentration |
Sodium Chloride (NaCl) | BioShop | 7647-14-5 | Biotechnology Grade |
Streptavidin (SA) Biosensors | ForteBio | 18-5019 | One tray of 96 biosensors coated with streptavidin for quantitation, screening, or kinetic applications. |
Superdex S200 (300/10) | Amersham Pharmacia Biotech | 175175-01 | – |
Thiamine | Merck | 69271 | – |
Tris-HCl | BioShop | 77-86-1 | Reagent Grade |
Triton X-100 | BioShop | 900998-1 | Biotechnology Grade |
Tween-20 | BioShop | 56-40-6 | Reagent Grade |
Ultra centrifuge | Beckman Coulter | 365668 | – |