Summary
Wir präsentieren eine Methode, die Membranproteinreinigung und Rekonstitution zu Peptidiscs in einem einzigen chromatographischen Schritt kombiniert. Biotinylatierte Gerüste werden zur direkten Oberflächenbefestigung und Messung von Protein-Ligand-Wechselwirkungen mittels Biolayer-Interferometrie eingesetzt.
Abstract
Membranproteine, einschließlich Transporter, Kanäle und Rezeptoren, machen fast ein Viertel des zellulären Proteoms und mehr als die Hälfte der aktuellen Wirkstoffziele aus. Ein großes Hindernis für ihre Charakterisierung und Ausbeutung im akademischen oder industriellen Umfeld besteht jedoch darin, dass die meisten biochemischen, biophysikalischen und medikamentösen Screening-Strategien erfordern, dass sich diese Proteine in einem wasserlöslichen Zustand befinden. Unser Labor hat vor kurzem die Peptidisc entwickelt, eine Membran-Mimetik, die einen "One-size-fits-all"-Ansatz für das Problem der Membranproteinlöslichkeit bietet. Wir präsentieren hier ein schlankes Protokoll, das Proteinreinigung und Peptidisc-Rekonstitution in einem einzigen chromatographischen Schritt kombiniert. Dieser Workflow, peptiQuick, ermöglicht die Umgehung der Dialyse und Inkubation mit Polystyrolperlen und reduziert damit die Exposition gegenüber Waschmitteln, Proteindenaturierung und Probenverlust erheblich. Wenn PeptiQuick mit biotinylierten Gerüsten durchgeführt wird, kann das Präparat direkt an Streptavidin-beschichteten Oberflächen befestigt werden. Es besteht keine Notwendigkeit, das Membranproteinziel zu biotinylatieren oder zu modifizieren. PeptiQuick wird hier mit dem Membranrezeptor FhuA und antimikrobiellem Ligandkolicin M vorgestellt, mit Hilfe der Biolayer-Interferometrie, um die genaue Kinetik ihrer Interaktion zu bestimmen. Es wird der Schluss gezogen, dass PeptiQuick eine bequeme Möglichkeit ist, Membranprotein-Ligand-Wechselwirkungen innerhalb eines Tages in einer waschmittelfreien Umgebung vorzubereiten und zu analysieren.
Introduction
Membranproteine sind oft von Denk- oder Antikörperforschungsprogrammen ausgeschlossen, da Membranproteine außerhalb der Lipid-Zweischichtumgebung aggregieren, insbesondere in Gegenwart von Detergenzien1. Daher wurden in den letzten Jahren mehrere Membranmimetiken (sogenannte Gerüste) entwickelt, um die Isolierung und Abfrage von Membranproteinen in einer vollständig waschmittelfreien Umgebung zu erleichtern (z. B. Nanoscheiben, SMALPs, Amphipols usw.). 2,3,4,5,6. Die Rekonstitution von Membranproteinen in diesen Mimetiken erfordert jedoch oft eine umfassende Optimierung, die zeitaufwändig ist und in der Regel mit dem Verlust der Proteinrückgewinnung7,8einhergeht. Um diese Einschränkungen zu überwinden, hat unser Labor vor kurzem eine "One-size-fits-all"-Formulierung entwickelt, die als Peptidisc9bekannt ist. Die Peptidisc entsteht, wenn mehrere Kopien eines 4,5 kDa-amphipathischen bihelischen Peptids an die hydrophobe Oberfläche eines Zielmembranproteins binden. Eine stabile Rekonstitution in Peptidisc erfolgt bei entfernung durch Reinigungsmittel, indem sowohl endogene Lipide als auch lösliche Membranproteine in wasserlösliche Partikel eingeschlossen werden. Diese stabilisierten Partikel sind nun für zahlreiche nachgeschaltete Anwendungen zugänglich.
Die Peptidisc-Methode bietet mehrere Vorteile; Zum Beispiel ist die Rekonstitution einfach, da die Bindung des Peptidisc-Gerüstes an das Ziel durch die Proteinschablone selbst9,10geleitet wird. Die Peptidstoichiometrie ist ebenfalls selbstbestimmt, und eine Zugabe von exogenen Lipiden ist nicht notwendig. Die Peptidbildung erfolgt durch einfache Waschmittelverdünnung, ein wichtiger Vorteil gegenüber der Dialyse oder Adsorption auf Polystyrolperlen, die oft aufgrund einer unspezifischen Oberflächenassoziation und Aggregation zu einem geringen Proteinertrag führen11,12 ,13. Die endgültige Peptidisc-Baugruppe ist hochthermostabil und ausnahmslos in verschiedenen Puffern oder in Gegenwart von divalenten Kationen (z.B. Ni2+)löslich. Die Reinheit und strukturelle Homogenität des Gerüstes ist ebenfalls hoch (z.B. Endotoxinfrei), und das Peptid kann mit funktionellen Gruppen an verschiedenen Positionen angepasst werden.
Wir präsentieren hier einen Labor-Workflow namens PeptiQuick, auch bekannt als On-Perlen-Rekonstitution9. Dieses Protokoll kombiniert Membranproteinreinigung und Peptidisc-Rekonstitution in einem einzigen Schritt und auf der gleichen chromatographischen Unterstützung. Wie der Name schon sagt, PeptiQuick ist schnell im Vergleich zu anderen Rekonstitutionsmethoden, und es reduziert auch ernsthaft die Expositionszeit gegenüber Reinigungsmittel. Negative Waschmitteleffekte wie Proteinentfaltung und Aggregation treten oft zeitabhängig auf; Daher ist die Minimierung der Waschmittelexposition entscheidend, um die native Proteinkonformation14,15aufrecht zu erhalten. Dies ist entscheidend für die Genauigkeit von Methoden, die über Proteinwechselwirkungen und Ligandenbindungsaffinitäten berichten.
Bei der Entwicklung dieses Protokolls stellen wir die neuartige biotinytierte Version des Peptidisc-Gerüsts vor, das als Bio-Peptidisc bezeichnet wird. Die biotinfunktionellen Gruppen ermöglichen die Befestigung des Zielmembranproteins auf Streptavidin-beschichteten Oberflächen. Da die Biotinkennzeichnung auf das Gerüst beschränkt ist, bleiben Bindungsstellen am Zielmembranprotein unverändert. Mit Bio-Peptidisc werden die Bindungskinetik des bakteriellen Membranrezeptors FhuA und des antimikrobiellen Peptids Kolikin M (ColM) bestimmt16. Diese Affinität wird mittels Biolayer-Interferometrie (BLI) gemessen, die Wechselwirkungen in Echtzeit anhand von Interferenzmustern für weißes Licht analysiert, die von einer Sensorspitze reflektiert werden.
Durch die Verwendung dieses Protokolls entfällt der Bedarf an Reinigungsmitteln während der BLI-Analyse, was eine wichtige Entwicklung darstellt, da Detergenzien Wechselwirkungen stören können. Bindungsaffinitäten können mit dieser Methode schnell gemessen werden, und die Ergebnisse sind vergleichbar mit denen, die früher mit Nanoscheiben und isothermen Titrationskalorimetrie (ITC)16berichtet wurden. Die kritischen Schritte im PeptiQuick-Workflow werden gezeigt und diskutiert, wie Proteinzubereitung, Waschmittelverdünnung, Peptidzugabe und Rekonstitution sowie Tipps zur Fehlerbehebung bei Liganden und Analytbindung im BLI-Assay. Mit hilfe des PeptiQuick-Workflows wird festgestellt, dass Membranproteine in Peptidiscs erfasst und ihre Wechselwirkungen innerhalb eines Tages gemessen werden können.
Protocol
1. Vorbereitung und Löslichkeit des Membranrezeptors FhuA
- Express Seine6-tagged FhuA in Escherichia coli Stamm AW740. Wachsen Sie Zellen für 18 h bei 37 °C in M9-Medien (Tabelle 1). Ein detailliertes Ausdrucksprotokoll finden Sie unter Mills et al.16.
- Stammzellen durch Zentrifugation (5.000 x g, 10 min, 4 °C) ernten und in 50 ml Tris-Salz-Glyzerol (TSG)-Puffer wieder aufsetzen (Tabelle 1). Die resuspendierten Zellen abstoßen und Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF) kurz vor der Lyse zu einer Endkonzentration von 1 mM hinzufügen.
VORSICHT: PMSF ist giftig und ätzend. - Lyse die Zellen mit einem Mikrofluidisierer (drei Passagen) bei 15.000 psi oder einer französischen Presse (drei Passagen) bei 8.000 psi. Pellet die unlysierten Zellen und anderes unlösliches Material durch Low-Speed-Zentrifugation (5.000 x g, 10 min, 4 °C).
- Ultrazentrifugieren Sie den Überstand (200.000 x g, 40 min, 4 °C), um die rohe Membranfraktion zu isolieren. Entsorgen Sie den Überstand, setzen Sie das Membranpellet in einer minimalen Menge an TSG-Puffer wieder auf und tauchen Sie mit einem Glas- oder Metall-Douncer-Gerät, um Homogenität zu gewährleisten.
- Führen Sie einen Bradford-Test durch, um die Proteinkonzentration der resuspendierten Rohmembran zu überprüfen. Verdünnen Sie die Rohmembran mit einem TSG-Puffer vor der Löslichkeit auf eine Endkonzentration von 3 mg/ml.
- Waschmittel Triton X-100 zu einer Endkonzentration von 1% (v/v) hinzufügen, um die bakterielle Innenmembran selektiv für 1 h bei 4 °C mit sanftem Schaukeln zu saugen. Pellet das unlösliche Material (äußere Membranfraktion) durch Ultrazentrifugation (200.000 x g, 40 min, 4 °C).
- Entsorgen Sie den Überstand, der die lösliche Membran enthält, und setzen Sie das Pellet in DER TSG auf eine Endkonzentration von 3 mg/ml aus. Lauryldimethylaminoxid (LDAO) einer Konzentration von 1% (v/v) zur resuspendierten äußeren Membranfraktion hinzufügen und bei 4 °C bei sanftem Schaukeln 1 h auflösen.
- Führen Sie einen letzten Zentrifugationsschritt durch, um das gesamte unlösliche Material (200.000 x g, 40 min, 4 °C) zu pelleten.
HINWEIS: Der resultierende Überstand enthält die solubilisierten äußeren Membranproteine, einschließlich des Ziels, das er mit FhuA markiert hat.
2. Reinigung und Rekonstitution von FhuA unter Verwendung des PeptiQuick-Workflows
- Vorausgleich einer vorverpackten Ni-NTA-Säule (5 ml Harzvolumen) mit zwei Säulenvolumen der immobilisierten Metallaffinitätschromatographie (IMAC) Waschpuffer (Tabelle 1).
- Verdünnen Sie die lösliche äußere Membran von 1% LDAO auf 0,04% LDAO mit TSG. Fügen Sie dann Imidazol zu einer Endkonzentration von 5 mM hinzu.
VORSICHT: Imidazol ist giftig und ätzend. - Laden Sie die löslichen äußeren Membranproteine auf das Ni-NTA-Harz und sammeln Sie den Durchfluss. Laden Sie den Durchfluss auf das Harz neu, um die Harzbindung von FhuA zu erhöhen und den sekundären Durchfluss zu sammeln.
ANMERKUNG: Bewahren Sie eine 20-L-Aliquot aus solubilisiertem Material als Referenz für die spätere Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese(SDS-PAGE) auf. - Waschen Sie das Harz mit 250 ml IMAC-Waschpuffer und sammeln Sie die ersten 50 ml Eluat. Den Waschpuffer auf die Höhe des Harzbettvolumens abtropfen lassen und den Stopphahn an der Säule schließen.
- 1 ml konzentrierte 10 mg/ml Bio-Peptidisc-Peptidlösung (Tabelle 1) in die Spalte geben. 50 ml verdünnte 1 mg/ml Bio-Peptidisc-Peptidlösung in TSG geben und das Harz mit einer Glasstange rühren, um die Perlen in TSG wieder aufzuhängen.
- Nach dem Peptidisc-Fang lassen Sie das Harz absetzen und abtropfen lassen die überschüssige 1 mg/ml Bio-Peptidisc-Lösung durch das Harz abtropfen lassen.
- Waschen Sie die Ni-NTA-anhantibenen Peptidisc-Partikel mit 50 ml TSG. Elute die Peptidisc-Partikel mit 15 ml IMAC-Elutionspuffer (Tabelle 1) mit 600 mM Imidazol in TSG. Sammeln Sie 1 ml-Fraktionen und fügen Sie sofort 10 l 0,5 M EDTA hinzu, um ausgellaugende Nickelionen zu chelatieren.
VORSICHT: EDTA ist reizend.
3. Bewertung der PeptiQuick-Rekonstitution
- SDS-PAGE-Analyse
- Laden Sie 10 L-Aliquots des Startmaterials, durchfließen, waschen(en) und eluierte Fraktionen aus der PeptiQuick-Rekonstitution auf ein 12%iges SDS-denaturing Gel und Elektrophorese für 30 min bei einem konstanten Strom von 60 mA.
- Färben Sie das Gel mit Coomassie blaufarbstoff, destain das Gel, und visualisieren Sie auf einem Scanner.
- Größenausschlusschromatographie (SEC)
- Basierend auf der 12% SDS-PAGE-Analyse der PeptiQuick-Rekonstitution, isolieren und bündeln Sie die relevanten Fraktionen und konzentrieren Sie sie mit einem 30 kDa Cut-off Zentrifugalkonzentrator.
HINWEIS: Im begleitenden Video werden die Fraktionen F3–F7 zusammengepoolt und unter 1 ml konzentriert (die Einspritzschleifenlautstärke auf dem SEC-Instrument). - Injizieren Sie 1 ml der gepoolten IMAC-Elutionsfraktionen in eine Gelfiltrations-S200-Säule (300/10) mit einer Durchflussrate von 0,25 ml/min im TSG-Puffer. Sammeln Sie 1 ml Brüche und führen Sie sie auf einem 12% SDS-Gel, um zu bestimmen, welche SEC-Fraktionen zu bündeln und zu konzentrieren.
HINWEIS: Die eluierten PeptiQuick-Fraktionen können ohne Konzentration gepoolt werden, und ein Aliquot kann in die SEC injiziert werden, um die Qualität der Rekonstitution zu überprüfen. Dies ist eine wichtige Kontrolle für Membranproteine, die während der Zentrifugalkonzentration potenziell anfällig für Aggregation sind.
- Basierend auf der 12% SDS-PAGE-Analyse der PeptiQuick-Rekonstitution, isolieren und bündeln Sie die relevanten Fraktionen und konzentrieren Sie sie mit einem 30 kDa Cut-off Zentrifugalkonzentrator.
4. Biolayer-Interferometrie
- BLI-Versuchsaufbau
- Richten Sie die 96 Well Platte von Hand ein.
HINWEIS: Alle Brunnen werden mit einem Endvolumen von 200 l gefüllt. - In Spalte 1, Zeilen A-E, laden Sie 200 L Kinetikpuffer, damit die Spitzen ausdemalibrisieren und ein Basissignal bilden können.
- Den Liganden (FhuA in Bio-Peptidisc) im Kinetikpuffer auf eine Konzentration von 2,5 g/ml verdünnen (Tabelle 1). Laden Sie 200 l dieser Verdünnung in die Zeilen A-D in Spalte 2.
- Fügen Sie den Kinetikpuffer nur 200 l Kinetikpuffer nur zu E2 (dem Referenzsensor) hinzu.
- Fügen Sie 200 l Kinetikpuffer zu Spalte 3, Zeilen A-E, um überschüssiges FhuA von der Spitze zu waschen.
- Führen Sie in Spalte 4 zweifach serielle Verdünnungen des Analyten (ColM) von A4 nach D4 nach unten. Beginnen Sie mit 28 nM (8*Kd) in A4 bis 3,5 nM (1*Kd) in D4.
- Fügen Sie 28 nM ColM zu E4 hinzu, um die unspezifische Bindung zu messen (die höchste verwendete ColM-Konzentration).
- Fügen Sie Spalte 5, Zeilen A-E, 200 L Kinetikpuffer hinzu.
HINWEIS: Hier trennt sich der ColM von der Spitze, und die Dissoziation wird gemessen. - Legen Sie die Rüstplatte in das BLI-Instrument.
- Legen Sie das Sensorspitzenfach in das BLI-Instrument.
- Öffnen Sie die BLI-Datenerfassungssoftware, und wählen Sie Im Software-Assistenten "Neues Kinetikexperiment" aus.
- Verwenden Sie die Plattendefinitions-Registerkarte, um das Layout der 96 Well-Platte in die Software einzugeben.
HINWEIS: Die Brunnen, die den Liganden, FhuA enthalten, werden als "Load" eingegeben. Brunnen, die nur Puffer enthalten, werden als "Puffer" eingegeben. Brunnen, die den Analyten ColM enthalten, werden als "Sample" eingegeben. - Verwenden Sie die Registerkarte Assaydefinition, um die Dauer und die Plattendrehzahl für jeden Schritt im Experiment zu definieren.
ANMERKUNG: Die versuchsweisen Schritte sind wie folgt eingerichtet: 1) Basislinie: 60 s; 2) Beladung: 250 s; 3) Ausgangswert2: 300 s; 4) Verein: 450 s; und 5) Dissoziation: 900 s. Lassen Sie die Schüttelgeschwindigkeit als Standard (1.000 Rpm). Die obigen Schritte werden jeder Spalte in der 96-Well-Platte individuell zugewiesen, indem Sie den gewünschten Schritt auswählen und mit der rechten Maustaste assay Step in jeder Spalte klicken. - Weisen Sie den ersten Schritt zu, indem Sie mit der rechten Maustaste auf die erste Spalte klicken, und wählen Sie Neue Assay startenaus. Stellen Sie sicher, dass der Basisschritt mithilfe des unteren rechten Fensters korrekt zugewiesen ist, und ändern Sie ihn bei Bedarf mit dem Dropdown-Menü.
- Weisen Sie den folgenden Schritten die folgenden Schritte zu, indem Sie mit der rechten Maustaste auf die Platte klicken und Assay Step hinzufügenauswählen. Weisen Sie diese der entsprechenden Spalte zu, wie in Schritt 4.1.13 festgelegt.
- Verwenden Sie die Registerkarte Sensorzuweisung, um sicherzustellen, dass das Oktettinstrument BLI-Pins von der richtigen Position im Sensorfach nimmt.
HINWEIS: Auf der Registerkarte Sensorzuweisung sollte nur A1-E1 blau hervorgehoben werden. Stellen Sie sicher, dass an diesen Stellen im Sensorfach eine Sensorspitze vorhanden ist, und stellen Sie sicher, dass F1-H1 leer ist. - Markieren Sie F1-H1 auf dem Bildschirm, klicken Sie dann mit der rechten Maustaste, und wählen Sie Entfernen aus, um diese als leer zu markieren. Tick Ersetzen Sie Sensoren im Fach nach Gebrauch, um die verwendeten Sensoren zu behalten.
- Gehen Sie auf der Registerkarte Testexperiment, die einen endgültigen Überblick über das Experiment vor der Ausführung bietet, auf die experimentellen Schritte ein, um sicherzustellen, dass das gesamte Setup korrekt ist.
- Wählen Sie auf der Registerkarte "Experiment" einen Dateispeicherort aus, um die Methodendateien zu speichern.
- Ändern Sie die Plattentemperatur auf die Raumtemperatur.
- Wählen Sie GO aus, um das Experiment auszuführen.
- Richten Sie die 96 Well Platte von Hand ein.
- BLI-Datenanalyse
- Öffnen Sie die Octet BLI Datenanalysesoftware.
- Verwenden Sie die Registerkarte Datenauswahl, um das Experiment zu suchen und die experimentelle Zusammenfassung zu überprüfen. Importieren Sie die Projektdatei von ihrem Instand- und Abs. 4.1.19 definierten Speicherort.
- Geben Sie die Konzentrationen des Analyten (hier ColM) ein, indem Sie die Sensorinformationen für jedes Experiment auswählen.
- Weisen Sie die Spitze in E1 als Referenzspitze zu.
- Verwenden Sie die Registerkarte Verarbeitung, um das Referenzsignal (E1) von den experimentellen Daten zu subtrahieren. Überprüfen Sie die Rohdaten aus der Referenzspitze auf unspezifische Analytbindung. Wenn keine beobachtet wird, fahren Sie fort.
HINWEIS: Dies ist eine wichtige negative Kontrolle. Wird eine unspezifische Bindung eingehalten, so wird dies in Schritt 4.2.7 berücksichtigt. - Richten Sie die y-Achse am zweiten Basisschritt aus. Markieren Sie die Zwischenschrittverbindung nicht. Wählen Sie Savitzky-Golay-Filterung aus. Wählen Sie Prozessdaten!.
- Wählen Sie auf der Registerkarte Analyse die experimentellen Daten in der Tabelle unterhalb des Diagramms aus, um die Assoziations- und Dissoziationskurven mit dem vom Referenzsensor subtrahierten Signal anzuzeigen.
- Wählen Sie das 1:1-Bindungsmodell aus, und wählen Sie eine Teilkurvenanpassung aus. Wählen Sie Kurven anpassen!.
- Analysieren Sie das Restansichtsdiagramm, um das Kurvenanpassungsdiagramm zu überprüfen.
- Blättern Sie durch die Tabelle, um das berechnete Kdzu sehen.
- Wählen Sie Bericht speichern... aus, um ein Tabellenkalkulationsdokument zu speichern, in dem die Einrichtung, die Diagramme der rohen und analysierten Daten sowie die berechneten Dissoziationskonstanten beschrieben werden.
Representative Results
Der Membranrezeptor FhuA wird in einem Labor-E. coli-Stamm exprimiert. Die äußere Membranfraktion wird durch Zentrifugation geerntet, und Proteine werden mittels einer zweistufigen Waschmittelextraktion solubilisiert. Die löslichen Membranproteine werden auf Ni-NTA-Agaroseperlen geladen, die in einer Kunststoffsäule verpackt sind, gefolgt vom PeptiQuick-Workflow, wie im Protokoll dargestellt. Nach einer Qualitätskontrolle mittels Größenausschlusschromatographie werden die Bio-Peptidisc-Partikel auf Streptavidin-beschichteten Stiften immobilisiert. Die BLI-Analyse wird durchgeführt, um die Kinetik der Wechselwirkungen zwischen FhuA und ColM zu messen. Die schematische Übersicht dieses Experiments ist in Abbildung 1dargestellt.
Ein SDS-Gel wird ausgeführt, um die Qualität der Rekonstitution nach der Elution von FhuA Bio-Peptidisc-Partikeln aus der IMAC-Säule zu bestimmen (Abbildung 2). Aliquots der Fraktionen, die Start, Flowthrough, Wasch- und Elutionsfraktionen entsprechen, werden auf das SDS-Gel geladen, um den Erfolg der PeptiQuick-Methode zu bewerten. Die Erschöpfung von FhuA in der Durchflussfraktion korreliert mit einer Anreicherung in den Elutionsfraktionen, was darauf hindeutet, dass die Reinigung des Proteins wirksam war. Kleinere kontaminierende Proteinbänder werden in den eluierten Fraktionen beobachtet. Die SDS-Gelanalyse wird verwendet, um zu bestimmen, welche Fraktionen vor der SEC-Analyse gepoolt werden sollen. Ein natives Gel der eluierten FhuA Bio-Peptidisc Partikel wird auch ausgeführt, um die FhuA Löslichkeit zu bestätigen (Ergänzende Abbildung 1). Die Migration des rekonstituierten Proteins in das native Gel zeigt die Proteinlöslichkeit in einer waschmittelfreien Umgebung an.
Die SEC-Analyse wird durchgeführt, um die Löslichkeit der Peptidisc-Partikel zu bewerten. Das in Abbildung 3A dargestellte Chromatogramm zeigt eine einzelne, symmetrische Spitzenelude bei etwa 14 ml (6 ml über das Hohlraumvolumen von 8,0 ml an der Gelfiltrationssäule S200 10/300). Die Position dieses Peaks, vorbei am Leerraumvolumen, bestätigt die Löslichkeit der FhuA Bio-Peptidisc-Partikel. Als Referenz zeigt Abbildung 3B eine theoretische suboptimale Peptidisc-Zubereitung. In diesem Fall zeigt das Chromatogramm eine größere Proteinspitzenelude im Hohlraumvolumen, was auf das Vorhandensein von Proteinaggregaten hinweist. Die kleinere Spitze Eluing knapp hinter der Haupt Peptidisc Spitze entspricht überschüssigen Peptidisc Peptide.
Die Wechselwirkung von FhuA mit dem Analyten ColM wird nach Befestigung der Peptidiscs an streptavidin beschichteten Sensoren bestimmt. Die Sensorspitzen werden zunächst im Kinetikpuffer ausgeglichen und dann in den Puffer mit den FhuA Bio-Peptidiscs übertragen. Die Konzentration der FhuA Bio-Peptidiscs und die Zeitdauer, für die sie mit der Spitze inkubiert werden, werden vor diesem Experiment optimiert (Zusatzabbildung 1). Nach den Be- und Waschschritten misst der Assoziationsschritt die Wechselwirkungen zwischen den geladenen Spitzen und vier verschiedenen Kolikenkonzentrationen M. Die anschließende Bewegung der Spitzen zurück in den Puffer führt zu einer Dissoziation, die durch die Wellenlängenverschiebung des weißen Lichts gemessen wird, die von der Spitze reflektiert wird.
Abbildung 4A zeigt die Ausgabe des Rohdatensensorgramms aus diesem Experiment. Alle Spuren erscheinen in den Lade- und Basissteinenschritten einheitlich, mit Ausnahme der Referenzspur in Gelb. Die Referenzspitze hat keinen Liganden geladen, sondern ist dem Analyten für die unspezifische Bindung ausgesetzt, was eine wichtige negative Kontrolle darstellt. Für eine detailliertere Analyse der Ergebnisse wird das Signal von der Referenzspitze von den Spuren für die experimentellen Spitzen subtrahiert, um eine unspezifische Bindung zu berücksichtigen. Die Daten werden am Anfang des Assoziationsschritts ausgerichtet, um einen direkten visuellen Vergleich zu ermöglichen, wie in Abbildung 4Bdargestellt. Dieser Vergleich zeigt eine Erhöhung der Wellenlängenverschiebung für steigende Konzentrationen von Kolikin M. Die Kurve ist an die Daten anpasse und weist ein klassisches 1:1-Bindungsmodell auf.
Das Restansichtsdiagramm(Abbildung 4B, unten), das die Unterschiede zwischen dem Fitting und den experimentellen Daten beschreibt, zeigt, dass die Anpassung für die höchste Konzentration von ColM (28 nM) im Vergleich zu den drei niedrigeren Konzentrationen schlecht ist. Dem Profil der Kurve selbst fehlt das Bindungskurvenplateau, das in einem typischen Bindungsexperiment charakteristisch für die Bindungs-Standortsättigung ist. Der Mangel an Plateau deutet auf eine heterogene Bindung hin, die wahrscheinlich ein Artefakt der hohen ColM-Konzentration ist. Diese höchste ColM-Konzentration wird daher von der Analyse herabgesprogliedert, und die anderen drei Konzentrationen werden verwendet, um die Dissoziationskonstante zu bestimmen (Abbildung 4C,D). Ein zweischwanziger Schüler-T-Testbei einem Konfidenzniveau von 95 % ergab, dass sich die beobachtete Dissoziationskonstante aus diesem Experiment nicht wesentlich von den werten unterscheidet, die mit verschiedenen Techniken ermittelt wurden (Abbildung 4E)16.
Abbildung 1: Übersicht über den PeptiQuick-Workflow mit Bio-Peptidiscs und BLI-Analyse. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: SDS-Gelanalyse (12%) Start-, Durchfluss-, Wasch- und Elutionsfraktionen, die über den PeptiQuick-Workflow gesammelt werden. In jede Spur wurden ca. 10 l Proben geladen und 30 min bei einem konstanten Strom von 60 mA ausgeführt. Das Gel wurde mit Coomassie blau gefärbt, entzähnt und auf einem Gelscanner visualisiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Experimentelle und theoretische SEC-Profile, die optimale bzw. suboptimale Rekonstitutionen darstellen. (A) Experimentelles SEC-Profil von PeptiQuick rekonstituierte FhuA (ca. 82 kDa) in Bio-Peptidiscs. Die IMAC-Elutionsfraktionen F3-F7 wurden mit einem 30 kDa-Grenzzentrifugalkonzentrator auf 1 ml gepoolt und konzentriert. Diese konzentrierte Probe wurde mit 0,25 ml/min in eine Gelfiltrations-S200 (10/300) Säule im TSG-Puffer injiziert. (B) Theoretisches SEC-Profil einer suboptimalen PeptiQuick-Rekonstitution. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Untersuchung von ColM-Wechselwirkungen mit FhuA, die in Bio-Peptidiscs rekonstituiert wurden. (A) Rohdatensensorgramm mit Referenzsensorspur in Gelb. (B,C) Oben: Assoziations- und Dissoziationsschritte mit teilweiser 1:1-Bindungskurvenanpassung. Unten: Restansichten, die den Unterschied zwischen experimentellen Daten und Berechnungsanpassung darstellen. (C) Replotting von (B) mit Ausnahme der höchsten Konzentration von ColM. (D) Beobachtete Assoziations- und Dissoziationsraten (kon bzw. koff)und die Dissoziationskonstanten (Kd). (E) Vergleich der FhuA-ColM Dissoziationskonstanten, die durch Peptidisc und BLI (in diesem Experiment), Peptidisc- und Mikrothermophorese (Saville, unveröffentlichte Daten) und Nanodiskette und isothermale Titrationskallorimetrie16erhalten wurden. Fehlerbalken stellen eine SD der Unsicherheit dar, während n.s. keinen signifikanten Unterschied auf dem 95%-Konfidenzniveau angibt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| M9 Media (pro Liter) |
| 200 ml M9 Salz |
| 800 mL dH2O |
| 10 ml 40% Glukose |
| 80 l 1 M CaCl2 |
| 2,5 ml 1 M MgSO4 |
| 300 l 15 mg/ml Thiamin |
| TSG-Puffer |
| 50 mM Tris-HCl, pH 7,8 |
| 50 mM NaCl |
| 10% Glycerin |
| IMAC Waschpuffer |
| 50 mM Tris-HCl, pH 7,8 |
| 50 mM NaCl |
| 10% Glycerin |
| 0,04% LDAO |
| 5 mM Imidazol |
| Bio-Peptidisc Lösung |
| Lösen Sie die gebrauchsfertige Bio-Peptidisc (>95% Reinheit) in sterilem dH2O auf. Die Konzentration und das Volumen der Peptidlösung hängen vom Schritt im Rekonstitutionsprozess ab. |
| 50 mM Tris-HCl, pH 7,8 |
| 50 mM NaCl |
| HINWEIS: Dieser Bio-Peptidisc Peptidbestand ist über einen Monat lang stabil bei 4 °C. |
| IMAC Elution Puffer |
| 50 mM Tris-HCl, pH 7,8 |
| 50 mM NaCl |
| 10% Glycerin |
| 600 mM Imidazol |
| Kinetikpuffer |
| 50 mM Tris-HCl, pH 7,8 |
| 50 mM NaCl |
| 0.002% Tween-20 |
| 0,1% BSA |
Tabelle 1: Rezepte für die Vorbereitung von Medien und Lösungen.
Ergänzende Abbildung 1: 4%–16% klare native Gelanalyse der elutionsfraktionen, die aus dem PeptiQuick-Workflow gesammelt wurden. In jede Spur wurden ca. 10 l Proben geladen und 40 min bei einem konstanten Strom von 30 mA ausgeführt. Das Gel wurde mit Coomassie blau gefärbt, entzähnt und auf einem Scanner visualisiert. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 2: Ligand-Konzentrationsoptimierung mit einem einzigen Pin. (A) Die sechs verschiedenen Konzentrationen von FhuA in Bio-Peptidisc wurden auf Bindung an einen einzigen Streptavidin-beschichteten Stift getestet. Diese wurde in einer 96-Wellplatte mit Puffer in den Brunnen zwischen Ligandenkonzentrationen eingerichtet (siehe Ergänzungsdatei 1 für Setup-Protokoll). (B) Rohdatensensorgramm für das Ligandenoptimierungsexperiment. Der Stift gibt das größte Ansprechen und erreicht zusätzlich die Sättigung bei Konzentrationszahl 4 (oder 2,5 g/ml). Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.
Ergänzende Datei 1. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei anzuzeigen (Rechtsklick zum Herunterladen).
Discussion
Während Detergenzien nach wie vor die einfachste Methode zur Extraktion und Reinigung von Membranproteinen sind, können diese Tenside viele unerwünschte Auswirkungen auf die Proteinstabilität, -funktion und die nachgeschalteten Analysen1,2,3, 4,5,6,7,8,9. Diese Schwierigkeiten haben die Entwicklung von Membran-Mimetik motiviert, die darauf abzielen, das Vorhandensein von Detergenzien zu minimieren und die native Membranumgebung so weit wie möglich zu replizieren2,3,4 ,5,6. Die meisten Rekonstitutionsmethoden erfordern jedoch eine signifikante Optimierung der Rekonstitutionsbedingungen und erfordern oft zusätzliche Reinigungsschritte, die den Endertrag7,8verringern. Die Peptidisc passt sich spontan an das Zielmembranprotein an und erfordert vergleichsweise wenig Optimierung und nachgeschaltete Reinigung9,10. In diesem Protokoll wird PeptiQuick als einfaches Mittel zur Rationalisierung des Rekonstitutionsprotokolls für die nachgeschaltete Protein-Protein-Interaktionsanalyse vorgestellt.
Obwohl einfach, gibt es mehrere experimentelle Vorbehalte, die zu einer erfolglosen Rekonstitution führen können. Unter diesen, die häufigste ist durch Protein-Aggregation. Daher ist es wichtig, eine Größenausschlusschromatographie durchzuführen, um den Rekonstitutionsprozess zu überwachen. Beispielsweise ist ein Größenausschluss-Spitzenwert, der am Leerraumvolumen eluiert, ein Hinweis auf Proteinaggregate (Abbildung 3B)17,18. Membranproteinaggregate bilden sich typischerweise bei längerer Exposition gegenüber suboptimalen Waschmittelbedingungen vor der Rekonstitution. Insbesondere wurde festgestellt, dass Membranproteine in Detergenzien dazu neigen, Aggregate zu bilden, wenn sie durch Ultrafiltration auf Zentrifugalvorrichtungen konzentriert werden. In diesem Fall können empfindliche Membranproteine mit Vakuum-Ultrafiltration konzentriert werden, einer schonenderen und homogeneren Konzentrationsmethode, da die Adsorption von Proteinen an den Filter verringert wird.
Im Allgemeinen sollten zur Vermeidung der Proteinkonzentration die eluierten IMAC-Fraktionen gepoolt und ein Aliquot auf eine Größenausschlussspalte injiziert werden, um die Rekonstitutionsqualität zu überprüfen. Es sei darauf hingewiesen, dass frei von der Freien Peptidung kurz nach dem Hauptpeptidisc-Peak(Abbildung 3B) nicht inkorporiert. Das freie Gerüst behindert nicht unbedingt nachgelagerte Experimente. Bei Bedarf kann dieser Überschuss jedoch durch die Größenausschlusschromatographie entfernt werden. Alternativ reicht die Erhöhung des Waschvolumens während der Rekonstitution und vor der Elution aus dem IMAC-Harz aus, um den größten Teil des freien Peptidpeptids effektiv zu entfernen. Daher wird die Größenausschlusschromatographie als schnelles und einfaches Mittel zur Überprüfung der Rekonstitutionsqualität empfohlen.
Das BLI-Experiment erfordert eine sorgfältige Optimierung der Liganden- und Analytkonzentrationen. Ligandbindung muss ausreichen, um ein klares Signal zu erhalten, aber Überlastung führt zu Signalsättigung, was zu Datenartefakten durch Überfüllung und sterische Behinderung auf der Spitzenoberfläche führt. Daher müssen sowohl die Konzentration des Liganden als auch die Zeitdauer, die die Spitze in der Ligandenlösung verbringt, für jede Proteinprobe optimiert werden (Ergänzende Abbildung 2). Auch die Analytkonzentration muss optimiert werden. Wenn die Dissoziationskonstante bekannt ist, wird dieser Schritt einfacher, da der Konzentrationsbereich angenähert werden kann. Ein guter Ausgangspunkt für diese Analyse ist die Verwendung von Proteinkonzentrationen zwischen dem 0,1- und dem 20-fachen des erwarteten Kd19.
Nach der BLI-Datenerfassung muss eine sorgfältige Datenanalyse durchgeführt werden, um Fehlinterpretationen zu vermeiden. Die Berechnung der Dissoziationskonstante hängt von der Passung einer Bindungskurve ab. Sofern die Bindungsstoichiometrie nicht bereits bekannt ist, sollte für die Erstmontage ein klassisches 1:1-Bimolekulare Interaktionsmodell verwendet werden. Es sei darauf hingewiesen, dass eine heterogene Bindungskurve oft das Ergebnis von Artefakten und einem nicht idealen Verhalten ist, das durch eine hohe Analytkonzentration verursacht wird, die als komplexes Bindungsmodell fehlinterpretiert werden kann. Daher kann das Senken der Analytkonzentration, bis das Sensorgrammprofil 1:1-Bindungsstoichiometrie anzeigt, dazu beitragen, heterogene Bindungen von komplexeren Wechselwirkungen zu unterscheiden. Alle verbleibenden heterogenen Bindungsdaten werden dann diskontiert, wie in Abbildung 420dargestellt.
In diesem Bericht wird eine Dissoziationskonstante von 2,28 x 0,74 nM für die FhuA-ColM-Wechselwirkung gemessen. Dieser Wert stimmt mit der zuvor in unserer Gruppe mit Nanodisc oder Peptidisc mit ITC bzw. MST ermittelten Dissoziationskonstante überein (Abbildung 4E)16. Diese Konsistenz gibt Vertrauen in die Peptidisc-Rekonstitution und BLI-Analyse als Mittel zur Bestimmung der Interaktionskinetik. Wichtig ist, dass Proteine in der Regel auf Streptavidin-Biosensoren immobilisiert werden, entweder durch biotinchemische Vernetzung oder ortsspezifische Zugabe mit dem E. coli biotin ligase BirA21. Offensichtlich hat die Biotinylatierung des Peptidisc-Gerüsts anstelle des Zielmembranproteins viele Vorteile. Gerüstbiotinylierung spart Zeit und minimiert das Potenzial, wichtige Proteinbindungsstellen zu stören. Wir haben auch festgestellt, dass PeptiQuick auf eine breite Palette von Protein-Zielklassen anwendbar ist, einschließlich G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs), Ionenkanäle und Membranproteine. Im Allgemeinen ist zu beachten, dass der anfängliche Waschmittelextrakt von Membranproteinen in einen aggregatfreien Zustand kritisch ist und dass die sofortige Rekonstitution bei Peptidisc nachgelagerte Aggregationsprobleme verringert. Angesichts der Einfachheit ist vorgesehen, dass PeptiQuick auf andere Streptavidin-basierte Bindungstests wie Oberflächenplasmonresonanz (SPR), ELISA-Assays und Affinitäts-Pull-Downs mit Streptavidin-Perlen ausgedehnt wird.
Disclosures
FD ist Gründer von Peptidisc Biotech, um Peptidisc-Peptide an die akademische Gemeinschaft zu verteilen. Peptidisc Biotech arbeitet auch mit industriellen Biotech- und Pharmaunternehmen zusammen, um Peptidisc in ihre Entdeckungs-Workflows zu implementieren. Open Access Publikation dieses Artikels wurde von FortéBio gesponsert.
Acknowledgments
Wir danken dem Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada. JS besitzt ein CGS-M CIHR-Stipendium. LT wurde vom Biotechnology and Biological Sciences Research Council unterstützt, der vom South West Biosciences Doctoral Training Partnership [Ausbildungsstipendium Referenz BB/M009122/1] finanziert wurde. FD ist ein Tier II Canada Research Chair.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30 kDa cut-off centrifugal concentrator | Millipore Sigma | C7715 | - |
| Ampicillin | BioShop | 69-52-3 | Sodium Salt |
| Bio-Peptidisc Peptide | Peptidisc Biotech | https://peptidisc.com | - |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | 9048-46-8 | Lyophilized powder |
| CaCl2 | Fisher Chemical | 10035-04-8 | Certified ACS |
| EDTA | BioShop | 6381-92-6 | Biotechnology Grade |
| Ettan LC (AKTA) | Amersham Pharmacia Biotech | 18-1145-58 | - |
| Glucose | BioShop | 50-99-7 | Anhydrous, Reagent Grade |
| Glycerol | Fisher Chemical | 56-81-5 | Certified ACS |
| Imidazole | BioShop | 288-32-4 | Biotechnology Grade |
| Lauryldimethylamine oxide (LDAO) | Sigma | 101822204 | ~30% in H2O |
| MgSO4 | Fisher Chemical | 10034-99-8 | Certified ACS |
| Microfluidizer | Microfluidics | M-110L | Fit with F20Y 75µ diruption chamber |
| Ni-NTA Resin | Gold Biotechnology | H-320-50 | - |
| Non-binding 96well BLI Plate | Greiner Bio-one | 655076 | Microplate, PS, 96 well, F-Bottom (chimney well), Black, Fluotrac, Med. Binding |
| Octet Red96 | FortéBio | OCTET RED96E-GxP | Octet RED96e instrument, Octet CFR software, desktop computer, LC monitor, accessory kit, IQ/OQ kit, PQ Kits and one-year warranty |
| Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) | Sigma | P-7626 | - |
| Protein Assay Dye - Reagent Concentrate | Bio-Rad | 5000006 | Used in the bradford assay to determine protein concentration - 5x concentration |
| Sodium Chloride (NaCl) | BioShop | 7647-14-5 | Biotechnology Grade |
| Streptavidin (SA) Biosensors | ForteBio | 18-5019 | One tray of 96 biosensors coated with streptavidin for quantitation, screening, or kinetic applications. |
| Superdex S200 (300/10) | Amersham Pharmacia Biotech | 175175-01 | - |
| Thiamine | Merck | 69271 | - |
| Tris-HCl | BioShop | 77-86-1 | Reagent Grade |
| Triton X-100 | BioShop | 900998-1 | Biotechnology Grade |
| Tween-20 | BioShop | 56-40-6 | Reagent Grade |
| Ultra centrifuge | Beckman Coulter | 365668 | - |
References
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