We presenteren een methode die membraan eiwit zuivering en reconstitutie in peptidiscs combineert in een enkele chromatografische stap. Biotinyated steigers worden gebruikt voor directe oppervlakte bevestiging en meting van eiwit-ligand interacties via biolayer interferometrie.
Membraan eiwitten, waaronder vervoerders, kanalen en receptoren, vormen bijna een vierde van het cellulaire Proteoom en meer dan de helft van de huidige geneesmiddel doelen. Toch is een belangrijke barrière voor hun karakterisering en uitbuiting in academische of industriële instellingen dat de meeste biochemische, biofysische en drugs screening strategieën vereisen dat deze eiwitten in een in water oplosbare toestand verkeren. Ons laboratorium heeft onlangs de peptidisc ontwikkeld, een membraan mimetische met een “one-size-fits-all” aanpak van het probleem van membraan proteïne oplosbaarheid. We presenteren hier een gestroomlijnd protocol dat eiwit zuivering en peptidisc reconstitutie combineert in een enkele chromatografische stap. Deze workflow, genaamd PeptiQuick, zorgt voor het omzeilen van dialyse en incubatie met polystyreen kralen, waardoor de blootstelling aan detergens, eiwit denaturatie en monsterverlies sterk wordt verminderd. Wanneer peptiquick wordt uitgevoerd met biotinyleerd steigers, kan de bereiding direct worden bevestigd aan streptavidine gecoate oppervlakken. Er is geen behoefte aan biotinylaat of wijzigen van het membraan eiwit doelwit. PeptiQuick wordt hier tentoongesteld met de membraan receptor FhuA en antimicrobiële ligand colicin M, met behulp van biolayer interferometrie om te bepalen van de precieze kinetiek van hun interactie. Geconcludeerd wordt dat PeptiQuick is een handige manier om te bereiden en analyseren van membraan eiwit-ligand interacties binnen één dag in een detergens-vrije omgeving.
Membraan eiwitten zijn vaak uitgesloten van drugs-of antilichaam Discovery onderzoeksprogramma’s vanwege de neiging van membraan eiwitten om te aggregeren buiten de lipide-dubbelgelaagde omgeving, vooral in de aanwezigheid van detergenten1. Daarom zijn in de afgelopen jaren verschillende membraan-mimetica (zogenaamde scaffolds) ontwikkeld om de isolatie en ondervraging van membraan eiwitten in een volledig reinigingsmiddel vrije omgeving (d.w.z. nano schijven, SMALPs, amphipols, enz.) te vergemakkelijken. 2,3,4,5,6. Echter, reconstitutie van membraan eiwitten in deze mimetica vereist vaak uitgebreide optimalisatie, wat tijdrovend is en in het algemeen gepaard gaat met verlies van eiwit terugwinning7,8. Om deze beperkingen te overwinnen, heeft ons laboratorium onlangs een “one-size-fits-all” formulering ontwikkeld die bekend staat als de peptidisc9. De peptidisc wordt gevormd wanneer meerdere exemplaren van een ontwerper 4,5 kDa amphipathisch bihelical peptide binden aan het hydrofobe oppervlak van een doel membraan proteïne. Stabiele reconstitutie in peptidisc treedt op bij het verwijderen van detergens, het verankeren van zowel endogene lipiden als opgeloste membraan eiwitten in in water oplosbare deeltjes. Deze gestabiliseerde deeltjes zijn nu vatbaar voor talrijke downstreamtoepassingen.
De peptidisc methode biedt verschillende voordelen; bijvoorbeeld, reconstitutie is eenvoudig, omdat de binding van de peptidisc-steiger op het doelwit wordt geleid door het eiwit sjabloon zelf9,10. De peptide stoichiometrie is ook zelf bepaald, en toevoeging van exogene lipiden is niet nodig. Peptidisc vorming vindt plaats door eenvoudige reinigingsmiddel verdunning, een belangrijk voordeel ten opzichte van dialyse of adsorptie aan polystyreen kralen, die vaak resulteren in een lage eiwitopbrengst als gevolg van niet-specifieke oppervlakte associatie en aggregatie11,12 ,13. Het laatste peptischijfje is zeer thermostabiel en onveranderlijk oplosbaar in verschillende buffers of in de aanwezigheid van divalente kationen (bijv. ni2 +). De zuiverheid en structurele homogeniteit van de steiger is ook hoog (bijv. endotoxine-vrij), en de peptide kan worden aangepast met functionele groepen geplaatst op verschillende posities.
We presenteren hier een laboratoriumwerk stroom genaamd PeptiQuick, ook bekend als on-Beads reconstitutie9. Dit protocol combineert membraan proteïne zuivering en peptidisc reconstitutie in één stap en op dezelfde chromatografische ondersteuning. Zoals de naam al aangeeft, is PeptiQuick snel in vergelijking met andere reconstitutie methoden, en het vermindert ook de blootstellingstijd tot wasmiddel. Negatieve wasmiddel effecten zoals het ontvouwen van eiwitten en aggregatie treden vaak op een tijdafhankelijke manier op; Daarom is het minimaliseren van de blootstelling aan wasmiddelen essentieel om de inheemse eiwit conformatie14,15te behouden. Dit is van cruciaal belang voor de nauwkeurigheid van methoden die rapporteren over eiwit interacties en ligand bindende verwantschappen.
Bij het ontwikkelen van dit protocol presenteren we de roman biotinyleerd versie van de peptidisc Scaffold, genaamd bio-peptidisc. De functionele groepen van biotine maken het mogelijk om het doel membraan-eiwit op streptavidine gecoate oppervlakken aan te laten. Aangezien Biotine labeling beperkt is tot de steiger, blijven bindende plaatsen op het doel membraan eiwit ongewijzigd. Met behulp van bio-Peptidisc, de bindende kinetiek van de bacteriële membraan receptor FhuA en antimicrobiële peptide colicin M (ColM) worden bepaald16. Deze affiniteit wordt gemeten via biolayer interferometrie (BLI), die interacties in real-time analyseert op basis van witte licht interferentie patronen die worden weerspiegeld door een sensortip.
Door dit protocol te gebruiken, wordt de behoefte aan detergenten tijdens BLI-analyse geëlimineerd, wat een belangrijke ontwikkeling is, omdat detergenten interacties kunnen verstoren. Bindende affiniteiten kunnen snel worden gemeten met deze methode, en de resultaten zijn vergelijkbaar met die eerder gerapporteerd met behulp van nano schijven en isothermische titratie calorimetrie (ITC)16. De kritieke stappen in de PeptiQuick workflow worden getoond en besproken, zoals eiwit voorbereiding, reinigingsmiddel verdunning, peptide toevoeging, en reconstitutie, samen met tips voor het oplossen van de binding van ligand en analyt in de BLI-assay. Met behulp van de PeptiQuick workflow, wordt geconstateerd dat membraan eiwitten kunnen worden gevangen in peptidiscs en hun interacties gemeten binnen een dag.
Terwijl detergenten de eenvoudigste methode blijven om membraan eiwitten te extraheren en te zuiveren, kunnen deze oppervlakteactieve stoffen veel ongewenste effecten hebben op de stabiliteit van eiwitten, de functie en de downstream-analyses1,2,3, 4,5,6,7,8,9. Deze moeilijkheden hebben de ontwikkeling van membraan-mimetica gemotiveerd, die ernaar streven de aanwezigheid van detergenten te minimaliseren en de inheemse membraan omgeving zo veel mogelijk te repliceren2,3,4 ,5,6. Het merendeel van de reconstitutie methoden vereist echter een aanzienlijke optimalisering van de reconstitutie condities en vereist vaak extra zuiveringsstappen, die de uiteindelijke opbrengst van7,8verlagen. De peptidisc past zich spontaan aan het doel membraan eiwit aan en vereist relatief weinig optimalisatie en downstream zuivering9,10. In dit protocol wordt PeptiQuick gepresenteerd als een eenvoudig middel om het reconstitutie protocol voor downstream eiwit-eiwit interactie analyse te stroomlijnen.
Hoewel ongecompliceerd, zijn er verschillende experimentele waarschuwingen die kunnen leiden tot mislukte reconstitutie. Onder deze, de meest voorkomende is te wijten aan eiwit aggregatie. Het is daarom van cruciaal belang om de grootte uitsluitings chromatografie uit te voeren om het reconstitutie proces te bewaken. Bijvoorbeeld, een grootte uitsluiting piek eluering op het lege volume is indicatief voor eiwit aggregaten (Figuur 3b)17,18. Membraan eiwit aggregaten vormen meestal bij langdurige blootstelling aan suboptimale reinigingsmiddelen vóór reconstitutie. In het bijzonder is gebleken dat membraan eiwitten in detergens de neiging hebben om aggregaten te vormen wanneer ze worden geconcentreerd door ultrafiltratie op centrifugale apparaten. In dit geval kunnen gevoelige membraan eiwitten geconcentreerd worden met behulp van vacuüm ultrafiltratie, een zachtere en meer homogene methode van concentratie, omdat de adsorptie van eiwitten aan het filter wordt verminderd.
In het algemeen, om de eiwitconcentratie te vermijden, moeten de geeleerde IMAC-fracties worden samengevoegd en een aliquot worden geïnjecteerd op een uitsluitings kolom voor grootte om de reconstitutie kwaliteit te controleren. Opgemerkt moet worden dat de vrije peptide, net na de belangrijkste peptidisc piek (Figuur 3b). De vrije steiger belemmert niet noodzakelijkerwijs de downstream-experimenten. Echter, indien nodig, kan dit overschot worden verwijderd door de grootte uitsluitings chromatografie. Als alternatief is het verhogen van het wasvolume tijdens de reconstitutie en voorafgaand aan elutie van de IMAC Resin voldoende om het grootste deel van het gratis peptidisc peptide effectief te verwijderen. Daarom wordt de grootte exclusie chromatografie aanbevolen als een snelle en eenvoudige manier om de kwaliteit van de reconstitutie te controleren.
Het BLI-experiment vereist zorgvuldige optimalisering van zowel ligand als analyt concentraties. Ligand binding moet voldoende zijn om een duidelijk signaal te verkrijgen, maar overbelasting zal de signaal verzadiging veroorzaken, wat resulteert in gegevensartefacten van overbevolking en sterische hinder op het punt oppervlak. Daarom moet zowel de concentratie van de ligand als de tijdsduur van de tip in de ligand-oplossing worden geoptimaliseerd voor elk eiwit monster (aanvullend figuur 2). De concentratie van de analyt moet ook worden geoptimaliseerd. Als de dissociatieconstante bekend is, wordt deze stap gemakkelijker, omdat het concentratiebereik kan worden benaderd. Een goed uitgangspunt voor deze analyse is het gebruik van eiwit concentraties tussen 0,1-en 20-voudige van de verwachte KD19.
Na het verzamelen van BLI-gegevens moet zorgvuldige gegevensanalyse worden uitgevoerd om verkeerde interpretatie te voorkomen. De berekening van de dissociatieconstante is afhankelijk van de pasvorm van een bindings curve. Tenzij de binding stoichiometrie al bekend is, moet een klassiek 1:1 bimoleculair interactiemodel worden gebruikt voor de initiële fitting. Opgemerkt moet worden dat een heterogene bindings curve vaak het resultaat is van artefacten en niet-ideaal gedrag veroorzaakt door een hoge analyt concentratie, die verkeerd geïnterpreteerd kan worden als een complex bindend model. Daarom, het verlagen van de analyt concentratie tot het sensorgram profiel geeft 1:1 binding stoichiometrie kan helpen onderscheid heterogene binding van complexere interacties. Alle resterende heterogene bindingsgegevens worden vervolgens verdisconteerd zoals weergegeven in Figuur 420.
In dit rapport wordt een dissociatieconstante van 2,28 ± 0,74 nM voor de interactie met FhuA-ColM gemeten. Deze waarde is consistent met de dissociatieconstante die voorheen in onze groep met nano schijf of peptidisc werd bepaald met behulp van ITC of MST, respectievelijk (figuur 4e)16. Deze consistentie biedt vertrouwen over de reconstitutie van peptidisc en BLI-analyse als middel om interactie kinetiek te bepalen. Belangrijk, opgemerkt moet worden dat eiwitten meestal worden geïmmobiliseerd op streptavidine biosensoren hetzij via Biotine chemische cross-linking of site-specifieke toevoeging met behulp van de E. coli Biotine ligase BirA21. Het is duidelijk dat biotinylating de peptidisc-steiger, in plaats van het doel membraan-eiwit, veel voordelen heeft. Scaffold biotinylation bespaart tijd en minimaliseert het potentieel om belangrijke eiwitbinding sites te verstoren. We hebben ook geconstateerd dat PeptiQuick toepasbaar is op een breed scala aan proteïne-doel klassen, waaronder G-eiwit-gekoppelde receptoren (GPCRs), ionenkanalen en β-vaten membraan eiwitten. In het algemeen moet worden opgemerkt dat het initiële reinigingsmiddel extract van membraan eiwitten in een geaggregeerde vrije toestand essentieel is en dat onmiddellijke reconstitutie in peptidisc de downstream aggregatie problemen vermindert. Gezien de eenvoud, het is voor ogen dat PeptiQuick zal worden uitgebreid naar andere streptavidine gebaseerde bindende assays, zoals oppervlakte Plasmon resonantie (SPR), ELISA assays, en affiniteit pull-downs met behulp van streptavidine kralen.
The authors have nothing to disclose.
We bedanken de Raad voor Natuurwetenschappen en ingenieurs onderzoek van Canada. JS bezit een CGS-M CIHR-beurs. LT werd gesteund door de Onderzoekraad biotechnologie en biologische wetenschappen-gefinancierd South West Biosciences Doctoraatsopleiding Partnership [opleiding subsidie referentie BB/M009122/1]. FD is een Tier II Canada Research Chair.
30 kDa cut-off centrifugal concentrator | Millipore Sigma | C7715 | – |
Ampicillin | BioShop | 69-52-3 | Sodium Salt |
Bio-Peptidisc Peptide | Peptidisc Biotech | https://peptidisc.com | – |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | 9048-46-8 | Lyophilized powder |
CaCl2 | Fisher Chemical | 10035-04-8 | Certified ACS |
EDTA | BioShop | 6381-92-6 | Biotechnology Grade |
Ettan LC (AKTA) | Amersham Pharmacia Biotech | 18-1145-58 | – |
Glucose | BioShop | 50-99-7 | Anhydrous, Reagent Grade |
Glycerol | Fisher Chemical | 56-81-5 | Certified ACS |
Imidazole | BioShop | 288-32-4 | Biotechnology Grade |
Lauryldimethylamine oxide (LDAO) | Sigma | 101822204 | ~30% in H2O |
MgSO4 | Fisher Chemical | 10034-99-8 | Certified ACS |
Microfluidizer | Microfluidics | M-110L | Fit with F20Y 75µ diruption chamber |
Ni-NTA Resin | Gold Biotechnology | H-320-50 | – |
Non-binding 96well BLI Plate | Greiner Bio-one | 655076 | Microplate, PS, 96 well, F-Bottom (chimney well), Black, Fluotrac, Med. Binding |
Octet Red96 | FortéBio | OCTET RED96E-GxP | Octet RED96e instrument, Octet CFR software, desktop computer, LC monitor, accessory kit, IQ/OQ kit, PQ Kits and one-year warranty |
Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) | Sigma | P-7626 | – |
Protein Assay Dye – Reagent Concentrate | Bio-Rad | 5000006 | Used in the bradford assay to determine protein concentration – 5x concentration |
Sodium Chloride (NaCl) | BioShop | 7647-14-5 | Biotechnology Grade |
Streptavidin (SA) Biosensors | ForteBio | 18-5019 | One tray of 96 biosensors coated with streptavidin for quantitation, screening, or kinetic applications. |
Superdex S200 (300/10) | Amersham Pharmacia Biotech | 175175-01 | – |
Thiamine | Merck | 69271 | – |
Tris-HCl | BioShop | 77-86-1 | Reagent Grade |
Triton X-100 | BioShop | 900998-1 | Biotechnology Grade |
Tween-20 | BioShop | 56-40-6 | Reagent Grade |
Ultra centrifuge | Beckman Coulter | 365668 | – |