Presentiamo un metodo che combina la purificazione delle proteine della membrana e la ricostituzione in peptidi in un’unica fase cromatografica. Gli scaffold biotinylati vengono utilizzati per l’attaccamento diretto della superficie e la misurazione delle interazioni proteina-ligando tramite interferometria biostrato.
Le proteine della membrana, inclusi trasportatori, canali e recettori, costituiscono quasi un quarto del proteoma cellulare e oltre la metà degli attuali bersagli farmacologici. Tuttavia, un ostacolo importante alla loro caratterizzazione e sfruttamento in ambienti accademici o industriali è che la maggior parte delle strategie di screening biochimico, biofisico e farmacologico richiedono che queste proteine siano in uno stato solubile in acqua. Il nostro laboratorio ha recentemente sviluppato il peptidisc, un mimetico a membrana che offre un approccio “uniforme” al problema della solubilità delle proteine della membrana. Vi presentiamo qui un protocollo semplificato che combina la purificazione delle proteine e la ricostituzione del peptidisco in un’unica fase cromatografica. Questo flusso di lavoro, chiamato PeptiQuick, consente di bypassare la dialisi e l’incubazione con perline di polistirolo, riducendo notevolmente l’esposizione al detersivo, la denaturazione delle proteine e la perdita del campione. Quando PeptiQuick viene eseguito con scaffold biotinylati, la preparazione può essere collegata direttamente alle superfici rivestite di streptavidina. Non c’è bisogno di biotinyare o modificare il bersaglio della proteina della membrana. PeptiQuick è mostrato qui con il recettore della membrana FhuA e la colica liganda antimicrobica M, utilizzando l’interferometria biostrato per determinare la cinetica precisa della loro interazione. Si conclude che PeptiQuick è un modo conveniente per preparare e analizzare le interazioni proteina-ligando della membrana entro un giorno in un ambiente privo di detersivo.
Le proteine della membrana sono spesso escluse dai programmi di ricerca sulla scoperta di farmaci o anticorpi a causa della propensione delle proteine della membrana ad aggregarsi al di fuori dell’ambiente bistrato lipidico, soprattutto in presenza di detergenti1. Pertanto, negli ultimi anni, sono stati sviluppati diversi mimetici a membrana (definite scaffold) per facilitare l’isolamento e l’interrogatorio delle proteine della membrana in un ambiente completamente privo di detergenti (ad esempio, nanodischi, SMALP, anfipoli, ecc.) 2,3,4,5,6. Tuttavia, la ricostituzione delle proteine della membrana in questi mimetici spesso richiede un’ampia ottimizzazione, che richiede tempo e generalmente accompagnata da perdita di recupero proteico7,8. Per superare queste limitazioni, il nostro laboratorio ha recentemente sviluppato una formulazione “one-size-fits-all” nota come peptidisc9. Il peptidisco si forma quando più copie di un designer 4.5 kDa peptide bihelical anfipatico si legano alla superficie idrofobica di una proteina membrana bersaglio. La ricostituzione stabile nel peptidisco avviene dopo la rimozione del detergente, intrappolando sia i lipidi endogeni che le proteine della membrana soluttiva in particelle solubili in acqua. Queste particelle stabilizzate sono ora suscettibili di numerose applicazioni a valle.
Il metodo peptidisc offre diversi vantaggi; per esempio, la ricostituzione è semplice, poiché il legame dell’impalcatura del peptidisco sul bersaglio è guidato dal modello proteico stesso9,10. La stoichiometria del peptide è anche autodeterminata e l’aggiunta di lipidi esogeni non è necessaria. La formazione di peptidi di peptidi provochi per semplice diluizione detergente, un importante vantaggio rispetto alla dialisi o all’adsorptioni su perline di polistirolo, che spesso si traducono in una bassa resa proteica a causa dell’associazione di superficie non specifica e dell’aggregazione11,12 ,13. L’assemblaggio finale del peptidisco è altamente termostabile e invariabilmente solubile in diversi cuscinetti o in presenza di cation divalenti (ad es., Ni2 .). Anche la purezza e l’omogeneità strutturale dell’impalcatura sono elevate (ad esempio, endotossina-free), e il peptide può essere personalizzato con gruppi funzionali posizionati in posizioni diverse.
Vi presentiamo qui un flusso di lavoro di laboratorio chiamato PeptiQuick, noto anche come on-perline ricostituzione9. Questo protocollo combina la purificazione delle proteine della membrana e la ricostituzione del peptidisco in un unico passaggio e sullo stesso supporto cromatografico. Come indica il nome, PeptiQuick è rapido rispetto ad altri metodi di ricostituzione, e riduce anche seriamente il tempo di esposizione al detersivo. Gli effetti negativi del detersivo, come lo sviluppo e l’aggregazione delle proteine, si verificano spesso in modo dipendente dal tempo; pertanto, ridurre al minimo l’esposizione al detersivo è fondamentale per mantenere la conformazione proteica nativa14,15. Questo è fondamentale per l’accuratezza dei metodi che riportano sulle interazioni proteiche e sulle affinità leganti.
Durante lo sviluppo di questo protocollo, presentiamo la nuova versione biotinylata dello scaffold peptidisce, chiamato Bio-Peptidisc. I gruppi funzionali della biotina consentono l’attaccamento della proteina della membrana bersaglio su superfici rivestite di streptavidina. Poiché l’etichettatura della biotina è limitata allo scaffold, i siti di legame sulla proteina della membrana bersaglio rimangono inalterati. Utilizzando il biopeptidisc, la cinetica legante del recettore della membrana batterica FhuA e la colicina peptide antimicrobica M (ColM) sono determinati16. Questa affinità viene misurata tramite l’interferometria del biostrato (BLI), che analizza le interazioni in tempo reale in base ai modelli di interferenza della luce bianca riflessi da una punta del sensore.
Utilizzando questo protocollo, viene eliminata la necessità di detersivo durante l’analisi BLI, che è uno sviluppo importante, poiché i detergenti possono interrompere le interazioni. Le affinità di legame possono essere misurate rapidamente con questo metodo e i risultati sono paragonabili a quelli riportati in precedenza utilizzando nanodischi e calorimetria di titola isotermica (ITC)16. I passaggi critici del flusso di lavoro PeptiQuick sono mostrati e discussi, come la preparazione delle proteine, la diluizione del detersivo, l’aggiunta di peptidi e la ricostituzione, insieme a suggerimenti per risolvere i problemi di ligando e analita nel saggio BLI. Utilizzando il flusso di lavoro PeptiQuick, si scopre che le proteine della membrana possono essere catturate in peptidiscs e le loro interazioni misurate in un giorno.
Mentre i detergenti rimangono il metodo più semplice per estrarre e purificare le proteine della membrana, questi surfactants possono avere molti effetti indesiderati sulla stabilità delle proteine, sulla funzione e sulle analisi a valle1,2,3, 4,5,6,7,8,9. Queste difficoltà hanno motivato lo sviluppo di mimetiche a membrana, che si sforzano di ridurre al minimo la presenza di detergenti e replicare l’ambiente nativo della membrana il più possibile2,3,4 ,5,6. La maggior parte dei metodi di ricostituzione, tuttavia, richiede un’ottimizzazione significativa delle condizioni di ricostituzione e spesso richiedono ulteriori fasi di purificazione, che riducono il rendimento finale7,8. Il peptidisc si adatta spontaneamente alla proteina della membrana bersaglio e relativamente, richiede poca ottimizzazione e purificazione a valle9,10. In questo protocollo, PeptiQuick è presentato come un semplice mezzo per semplificare il protocollo di ricostituzione per l’analisi a valle dell’interazione proteina-proteina.
Anche se semplici, ci sono diversi avvertimenti sperimentali che possono portare a una ricostituzione senza successo. Tra questi, il più comune è dovuto all’aggregazione delle proteine. È quindi fondamentale eseguire la cromatografia di esclusione delle dimensioni per monitorare il processo di ricostituzione. Ad esempio, un picco di esclusione di dimensioni che si eluisce al volume vuoto è indicativo di aggregati proteici (Figura 3B)17,18. Gli aggregati proteici di membrana si formano in genere in base all’esposizione prolungata a condizioni detergenti non ottimali prima della ricostituzione. In particolare, è stato scoperto che le proteine della membrana nel detersivo tendono a formare aggregati quando concentrate dall’ultrafiltrazione su dispositivi centrifughi. In questo caso, le proteine sensibili della membrana possono essere concentrate utilizzando l’ultra-filtrazione del vuoto, un metodo di concentrazione più delicato e più omogeneo poiché l’assorbimento delle proteine al filtro è diminuito.
In generale, per evitare la concentrazione di proteine, le frazioni eluite di IMAC dovrebbero essere raggruppate e una colonna di esclusione di dimensioni iniettata in una colonna di esclusione delle dimensioni per verificarne la qualità di ricostituzione. Va notato che non incorporato eluito peptide libero subito dopo il picco principale peptidisc (Figura 3B). L’impalcatura libera non ostacola necessariamente gli esperimenti a valle. Tuttavia, se necessario, questo eccesso può essere rimosso dalla cromatografia di esclusione di dimensioni. In alternativa, aumentare il volume di lavaggio durante la ricostituzione e prima dell’eluizione dalla resina IMAC è sufficiente per rimuovere efficacemente la maggior parte del peptidio peptidisco libero. Pertanto, la cromatografia di esclusione delle dimensioni è raccomandata come mezzo rapido e semplice per controllare la qualità della ricostituzione.
L’esperimento BLI richiede un’attenta ottimizzazione delle concentrazioni di ligando e analita. L’associazione del ligando deve essere sufficiente per ottenere un segnale chiaro, ma il sovraccarico causerà la saturazione del segnale, che si traduce in artefatti di dati provenienti dal sovraffollamento e ostacoli sterici sulla superficie della punta. Pertanto, sia la concentrazione del ligando che la durata del tempo che la mancia trascorre nella soluzione di ligando devono essere ottimizzate per ogni campione di proteine (Figura supplementare 2). Anche la concentrazione di analita deve essere ottimizzata. Se la costante di dissociazione è nota, questo passaggio diventa più facile, poiché l’intervallo di concentrazione può essere approssimato. Un buon punto di partenza per questa analisi è l’utilizzo di concentrazioni proteiche comprese tra 0,1 e 20 volte il Kd19previsto.
Dopo l’acquisizione dei dati BLI, è necessario eseguire un’attenta analisi dei dati per evitare interpretazioni errate. Il calcolo della costante di dissociazione dipende dall’adattamento di una curva di rilegatura. A meno che la stoichiometria di legame non sia già nota, per il montaggio iniziale deve essere utilizzato un modello di interazione bimolecolare 1:1 classico. Va notato che una curva di rilegatura eterogenea è spesso il risultato di artefatti e comportamenti non ideali causati da un’elevata concentrazione di analiti, che può essere erroneamente interpretata come un modello di legame complesso. Pertanto, abbassare la concentrazione di analita fino a quando il profilo del sensorgramma non visualizza la stoichiometria di rilegatura 1:1 può aiutare a differenziare l’associazione eterogenea dalle interazioni più complesse. Tutti i dati di associazione eterogenei residui vengono quindi scontati come illustrato nella figura 420.
In questo rapporto, viene misurata una costante di dissociazione di 2,28 x 0,74 nM per l’interazione FhuA-ColM. Questo valore è coerente con la costante di dissociazione precedentemente determinata nel nostro gruppo con nanodisco o peptidisc utilizzando ITC o MST, rispettivamente (Figura 4E)16. Questa consistenza fornisce fiducia sulla ricostituzione del peptidisco e l’analisi BLI come mezzo per determinare la cinetica di interazione. È importante sottolineare che le proteine sono solitamente immobilizzate su biosensori di streptavidina sia attraverso il cross-linking chimico della biotina che l’aggiunta site-specific utilizzando l’E. coli biotinli BirA21. Evidentemente, biotinyalare lo scaffold peptidisce, invece della proteina della membrana bersaglio, ha molti vantaggi. La biotinylazione degli scaffold consente di risparmiare tempo e riduce al minimo la possibilità di interrompere importanti siti di legame proteico. Abbiamo anche scoperto che PeptiQuick è applicabile a un’ampia gamma di classi di target proteiche, tra cui i recettori accoppiati con proteina G (GRACR), i canali ionici e le proteine della membrana delle botti z. In generale, va notato che l’estratto iniziale di detergenti delle proteine della membrana in uno stato privo di aggregati è critico e che la ricostituzione immediata nel peptidisco diminuisce i problemi di aggregazione a valle. Data la semplicità, si prevede che PeptiQuick sarà esteso ad altri saggi di legame a base di streptavidin, come la risonanza del plasmone superficiale (SPR), i saggi ELISA e i pull-down di affinità utilizzando perline streptavidin.
The authors have nothing to disclose.
Ringraziamo il Natural Sciences and Engineering Research Council del Canada. JS detiene una borsa di studio CGS-M CIHR. LT è stato sostenuto dalla Biotechnology and Biological Sciences Research Council, finanziata dalla South West Biosciences Doctoral Training Partnership ,20m, finanziata dalla Biotechnology and Biological Sciences Research Partnership [forma di riferimento per la formazione BB/M009122/1]. FD è una cattedra di ricerca di livello II Canada.
30 kDa cut-off centrifugal concentrator | Millipore Sigma | C7715 | – |
Ampicillin | BioShop | 69-52-3 | Sodium Salt |
Bio-Peptidisc Peptide | Peptidisc Biotech | https://peptidisc.com | – |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | 9048-46-8 | Lyophilized powder |
CaCl2 | Fisher Chemical | 10035-04-8 | Certified ACS |
EDTA | BioShop | 6381-92-6 | Biotechnology Grade |
Ettan LC (AKTA) | Amersham Pharmacia Biotech | 18-1145-58 | – |
Glucose | BioShop | 50-99-7 | Anhydrous, Reagent Grade |
Glycerol | Fisher Chemical | 56-81-5 | Certified ACS |
Imidazole | BioShop | 288-32-4 | Biotechnology Grade |
Lauryldimethylamine oxide (LDAO) | Sigma | 101822204 | ~30% in H2O |
MgSO4 | Fisher Chemical | 10034-99-8 | Certified ACS |
Microfluidizer | Microfluidics | M-110L | Fit with F20Y 75µ diruption chamber |
Ni-NTA Resin | Gold Biotechnology | H-320-50 | – |
Non-binding 96well BLI Plate | Greiner Bio-one | 655076 | Microplate, PS, 96 well, F-Bottom (chimney well), Black, Fluotrac, Med. Binding |
Octet Red96 | FortéBio | OCTET RED96E-GxP | Octet RED96e instrument, Octet CFR software, desktop computer, LC monitor, accessory kit, IQ/OQ kit, PQ Kits and one-year warranty |
Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) | Sigma | P-7626 | – |
Protein Assay Dye – Reagent Concentrate | Bio-Rad | 5000006 | Used in the bradford assay to determine protein concentration – 5x concentration |
Sodium Chloride (NaCl) | BioShop | 7647-14-5 | Biotechnology Grade |
Streptavidin (SA) Biosensors | ForteBio | 18-5019 | One tray of 96 biosensors coated with streptavidin for quantitation, screening, or kinetic applications. |
Superdex S200 (300/10) | Amersham Pharmacia Biotech | 175175-01 | – |
Thiamine | Merck | 69271 | – |
Tris-HCl | BioShop | 77-86-1 | Reagent Grade |
Triton X-100 | BioShop | 900998-1 | Biotechnology Grade |
Tween-20 | BioShop | 56-40-6 | Reagent Grade |
Ultra centrifuge | Beckman Coulter | 365668 | – |