우리는 막 단백질 정제 및 재구성을 단일 크로마토그래피 단계에서 펩티디스크로 결합하는 방법을 제시합니다. 생체 측량 스캐폴드는 생체층 간섭측정을 통해 단백질-리간드 상호 작용의 직접 표면 부착 및 측정에 사용됩니다.
수송기, 채널 및 수용체를 포함하여 막 단백질은, 세포 단백질의 거의 1/4및 현재 약 표적의 반 이상을 구성합니다. 그러나, 학문적 또는 산업 적 환경에서 그들의 특성화 그리고 착취에 중요한 장벽은 대부분의 생화학적, 생물물리학적 및 약물 스크리닝 전략이 수용성 상태에 있는 이 단백질을 요구한다는 것입니다. 우리의 실험실은 최근에 막 단백질 용해도의 문제에 “일크기에 맞는” 접근을 제안하는 막 모방인 펩티디스크를 개발했습니다. 우리는 여기에서 단 하나 크로마토그래피 단계에서 단백질 정화 및 펩티디스크 재구성을 결합하는 능률적인 프로토콜을 제시합니다. PeptiQuick이라고 불리는 이 워크플로우는 폴리스티렌 구슬로 투석 및 배양을 우회하여 세제, 단백질 변성 및 시료 손실에 대한 노출을 크게 줄입니다. PeptiQuick이 생체 용 스캐폴드로 수행 될 때, 준비는 스트렙 타비딘 코팅 표면에 직접 부착 될 수있다. 막 단백질 표적을 biotinylate 하거나 수정할 필요가 없습니다. PeptiQuick은 생체층 간섭측정을 사용하여 상호 작용의 정확한 역학을 결정하는 막 수용체 FhuA 및 항균 리간드 복리신 M과 함께 여기에 전시됩니다. PeptiQuick은 세제없는 환경에서 하루 이내에 막 단백질 리간드 상호 작용을 준비하고 분석 할 수있는 편리한 방법입니다.
막 단백질은 종종 약물 또는 항체 발견 연구 프로그램에서 배제되기 때문에 막 단백질이 지질 이중층 환경 의 외부로 응집되는 성향, 특히 세제의 존재1. 따라서, 최근에는, 몇몇 막 모방 (불리된 스캐폴드)는 완전히 세제없는 환경에서 막 단백질의 분리 및 심문을 용이하게하기 위해 개발되었습니다 (즉, 나노 디스크, SMALPs, amphipols, 등). 2,3,4,5,6. 그러나, 이러한 모방에서 막 단백질의 재구성은 종종 광범위한 최적화가 필요하며, 이는 시간이 많이 걸리고 일반적으로 단백질 회수의 손실을동반하는 7,8. 이러한 한계를 극복하기 위해 당사의 실험실은 최근 펩티디스크9로알려진 “일형-적합” 제형을 개발했습니다. 펩티디스크는 설계자 4.5 kDa 양파성 바이헬릭 펩티드의 다중 카피를 표적 막 단백질의 소수성 표면에 결합할 때 형성된다. 펩티디스크의 안정적인 재구성은 세제를 제거할 때 발생하며, 내인성 지질과 용해성 막 단백질을 수용성 입자에 포획합니다. 이러한 안정화된 입자는 이제 수많은 다운스트림 애플리케이션에 적합합니다.
펩티디스크 방법은 몇 가지 장점을 제공합니다. 예를 들어, 펩티디스크 스캐폴드를 표적에 결합하기 때문에 재구성은 간단하며, 단백질 템플릿 자체에 의해 유도되는9,10. 펩티드 족치량계는 또한 자가 결정되며 외인성 지질을 첨가할 필요가 없다. 펩티디스크 형성은 단순한 세제 희석에 의해 발생하며, 폴리스티렌 비드에 투석 또는 흡착에 비해 중요한 이점으로, 비특이적 표면 결집 및 응집으로 인한 단백질 수율이 낮아지는 경우가 많다11,12 ,13. 최종 펩티디스크 어셈블리는 매우 열안정적이며 상이한 완충제 또는 이완 양이온(예를 들어, Ni2+)의 존재 하에 항상 용해된다. 스캐폴드의 순도 및 구조적 균질성은 또한 높다(예를 들어, 내독소-무), 펩티드는 상이한 위치에 배치된 작용기로 맞춤화될 수 있다.
우리는 여기에 PeptiQuick라는 실험실 워크플로우를 제시, 또한 온 – 비드 재구성으로 알려진9. 이 프로토콜은 막 단백질 정제 및 펩티디스크 재구성을 단일 단계와 동일한 크로마토그래피 지지체로 결합합니다. 이름에서 볼 수 있듯이, PeptiQuick은 다른 재구성 방법에 비해 빠르며 세제노출 시간도 심각하게 줄여줍니다. 단백질 전개 및 응집과 같은 부정적인 세제 효과는 종종 시간에 의존하는 방식으로 발생합니다. 따라서, 세제 노출을 최소화하는 것은 네이티브 단백질 형태14,15를유지하는 데 중요합니다. 이것은 단백질 상호 작용 및 리간드 결합 친화성에 보고하는 방법의 정확성을 위해 중요합니다.
이 프로토콜을 개발하는 동안, 우리는 펩티디스크 스캐폴드의 새로운 생체 동화 버전을 제시, 바이오 펩티디스크라고. 비오틴 작용기는 스트렙타비딘 코팅 표면에 표적 막 단백질을 부착할 수 있게 한다. 비오틴 라벨링은 스캐폴드로 제한되기 때문에, 표적 막 단백질의 결합 부위는 변하지 않은 채로 남아 있다. 바이오 펩티디스크를 사용하여, 세균막 수용체 FhuA 및 항균 펩티드 코카인 M(ColM)의 결합 역학이16결정된다. 이 친화성은 센서 팁에서 반사되는 백색광 간섭 패턴을 기반으로 실시간으로 상호 작용을 분석하는 생체층 간섭측정(BLI)을 통해 측정됩니다.
이 프로토콜을 사용하면 BLI 분석 중에 세제의 필요성이 제거되고, 이는 세제가 상호 작용을 방해할 수 있기 때문에 중요한 개발입니다. 결합 친화도는 이 방법으로 빠르게 측정될 수 있으며, 결과는 나노디스크 및 등온적 적정 열량계(ITC)16을사용하여 이전에 보고된 것과 비교할 수 있다. PeptiQuick 워크플로우의 중요한 단계는 단백질 제제, 세제 희석, 펩타이드 첨가 및 재구성과 같은 BLI 분석에서 리간드 및 분석물 결합문제를 해결하는 팁과 같은 설명및 논의됩니다. PeptiQuick 워크플로우를 사용하여, 막 단백질은 펩티디스크와 그 상호 작용에서 하루 안에 측정될 수 있다는 것을 발견되었습니다.
세제는 막 단백질을 추출하고 정화하는 가장 간단한 방법으로 남아 있지만, 이러한 계면활성제는 단백질 안정성, 기능 및 다운스트림 분석1,2,3에많은 원치 않는 영향을 미칠 수있습니다. 4,5,6,7,8,9. 이러한 어려움은 세제의 존재를 최소화하고 가능한 한 네이티브 멤브레인 환경을 복제하기 위해 노력하는 멤브레인 모방제의 개발에 동기를부여했습니다2,3,4 ,5,6. 그러나 대부분의 재구성 방법은 재구성 조건의 상당한 최적화가 필요하며 종종 최종 수율7,8을감소시키는 추가 적인 정제 단계가 필요합니다. 펩티디스크는 자발적으로 표적막 단백질에 적응하고 비교적, 최적화 및 하류정제가거의 필요하지 않으며9,10. 이 프로토콜에서 PeptiQuick은 다운스트림 단백질 상호 작용 분석을 위한 재구성 프로토콜을 간소화하는 간단한 수단으로 제시됩니다.
간단하지만, 실패한 재구성으로 이어질 수있는 몇 가지 실험주의 사항이 있습니다. 이들 중가장 일반적인 것은 단백질 응집 때문입니다. 따라서 재구성 프로세스를 모니터링하기 위해 크기 배제 크로마토그래피를 수행하는 것이 중요합니다. 예를 들어, 보이드 부피에서용해되는 크기 배제 피크는 단백질 응집체를나타낸다(도 3B)17,18. 막 단백질 응집체는 일반적으로 재구성하기 전에 최적 이하 세제 조건에 장기간 노출될 때 형성됩니다. 특히, 세제내 막 단백질은 원심장치에 초여과하여 농축될 때 응집체를 형성하는 경향이 있는 것으로 밝혀졌다. 이 경우, 민감한 막 단백질은 필터에 단백질의 흡착이 감소되기 때문에 진공 초여과, 보다 부드럽고 보다 균일한 농도 방법을 사용하여 농축될 수 있다.
일반적으로, 단백질 농도를 피하기 위해, 용출 된 IMAC 분획을 풀아야하며, 그 재구성 품질을 확인하기 위해 크기 배제 컬럼에 주입 된 aliquot. 주요 펩티디스크 피크 직후에 통합되지 않은 자유 펩티드용적(도 3B)에유의해야 한다. 자유 스캐폴드가 반드시 다운스트림 실험을 방해하지는 않습니다. 그러나, 필요한 경우, 이 과잉은 크기 배제 크로마토그래피에 의해 제거될 수 있다. 대안적으로, 재구성 시 세척 부피를 증가시키고, IMAC 수지로부터용출되기 전에, 대부분의 자유 펩티디스크 펩티드 펩티드를 효과적으로 제거하기에 충분하다. 따라서 크기 배제 크로마토그래피는 재구성 품질을 확인하는 빠르고 간단한 방법으로 권장됩니다.
BLI 실험은 리간드 및 해석문자 농도를 신중하게 최적화해야 합니다. 리간드 결합은 명확한 신호를 얻기에 충분해야 하지만 과부하로 인해 신호 포화가 발생하여 과밀화로 인한 데이터 아티팩트와 팁 표면의 스테릭 장애가 발생합니다. 따라서, 리간드의 농도와 팁이 리간드 용액에서 소비하는 시간의 길이 는 각각의 단백질 샘플에 대해 최적화되어야한다(보충도 2). 또한 해석액 농도도 최적화되어야 합니다. 해리 상수가 알려진 경우, 농도 범위가 근사화 될 수 있기 때문에,이 단계는 쉽게된다. 이 분석을 위한 좋은 출발점은 예상된 Kd19의0.1-20배 사이 단백질 농도를 이용하는 것입니다.
BLI 데이터 수집 후 잘못된 해석을 방지하기 위해 신중한 데이터 분석을 수행해야 합니다. 해리 상수의 계산은 바인딩 곡선의 적합에 따라 달라집니다. 결합 성 포이치오metry가 이미 알려져 있는 경우가 아니면, 초기 피팅에 고전 1:1 이중 분자 상호작용 모델을 사용해야 합니다. 이기종 결합 곡선은 종종 복잡한 결합 모델로 잘못 해석 될 수있는 높은 해석물 농도로 인한 유물 및 비 이상적인 행동의 결과입니다. 따라서 센서그램 프로파일이 1:1 결합 을 표시할 때까지 분석체 농도를 낮추면 보다 복잡한 상호 작용과 이기종 결합을 구별하는 데 도움이 될 수 있습니다. 모든 잔류 이질 바인딩 데이터는 그림 420에나타낸 대로 할인됩니다.
이 보고서에서, FhuA-ColM 상호작용에 대한 2.28±0.74 nM의 해리 상수가 측정된다. 이러한 값은 각각 ITC 또는 MST를 사용하여 나노디스크 또는 펩티디스크를 이용한 우리 그룹에서 이전에 결정된 해리상수와 일치한다(도4E)16. 이러한 일관성은 상호 작용 역학을 결정하는 수단으로 펩티디스크 재구성 및 BLI 분석에 대한 자신감을 제공한다. 중요한 것은, 단백질은 일반적으로 대장균 비오틴 리가제 BirA21을사용하여 비오틴 화학 적 가교 또는 부위 별 첨가를 통해 스트렙타비딘 바이오 센서에 고정된다는 점에 유의해야 한다. 분명히, 펩티디스크 스캐폴드를 표적 막 단백질 대신에 생체면역화하는 것은 많은 장점이 있다. 스캐폴드 바이오티닐화는 시간을 절약하고 중요한 단백질 결합 부위를 방해할 가능성을 최소화합니다. 우리는 또한 PeptiQuick이 G 단백질 결합 수용체 (GPCRs), 이온 채널 및 β 배럴 막 단백질을 포함하여 광범위한 단백질 표적 클래스에 적용 가능하다는 것을 발견했습니다. 일반적으로, 막 단백질의 초기 세제 추출물이 골재가 없는 상태로 들어가는 것이 중요하며 펩티디스크의 즉각적인 재구성은 하류 응집 문제를 감소시킵니다. 단순성을 감안할 때, PeptiQuick은 표면 플라스몬 공명 (SPR), ELISA assays 및 스트렙타비딘 구슬을 사용하여 친화도 풀다운과 같은 다른 스트렙타비딘 기반 결합 성 어설슬로 확장 될 것으로 구상됩니다.
The authors have nothing to disclose.
우리는 캐나다의 자연 과학 및 공학 연구 위원회에 감사드립니다. JS는 CGS-M CIHR 장학금을 보유하고 있습니다. LT는 생명 공학 및 생물 과학 연구 위원회 자금 사우스 웨스트 생명 과학 박사 교육 파트너십 [교육 보조금 참조 BB / M009122/1]에 의해 지원되었다. FD는 계층 II 캐나다 연구 의자입니다.
30 kDa cut-off centrifugal concentrator | Millipore Sigma | C7715 | – |
Ampicillin | BioShop | 69-52-3 | Sodium Salt |
Bio-Peptidisc Peptide | Peptidisc Biotech | https://peptidisc.com | – |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | 9048-46-8 | Lyophilized powder |
CaCl2 | Fisher Chemical | 10035-04-8 | Certified ACS |
EDTA | BioShop | 6381-92-6 | Biotechnology Grade |
Ettan LC (AKTA) | Amersham Pharmacia Biotech | 18-1145-58 | – |
Glucose | BioShop | 50-99-7 | Anhydrous, Reagent Grade |
Glycerol | Fisher Chemical | 56-81-5 | Certified ACS |
Imidazole | BioShop | 288-32-4 | Biotechnology Grade |
Lauryldimethylamine oxide (LDAO) | Sigma | 101822204 | ~30% in H2O |
MgSO4 | Fisher Chemical | 10034-99-8 | Certified ACS |
Microfluidizer | Microfluidics | M-110L | Fit with F20Y 75µ diruption chamber |
Ni-NTA Resin | Gold Biotechnology | H-320-50 | – |
Non-binding 96well BLI Plate | Greiner Bio-one | 655076 | Microplate, PS, 96 well, F-Bottom (chimney well), Black, Fluotrac, Med. Binding |
Octet Red96 | FortéBio | OCTET RED96E-GxP | Octet RED96e instrument, Octet CFR software, desktop computer, LC monitor, accessory kit, IQ/OQ kit, PQ Kits and one-year warranty |
Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) | Sigma | P-7626 | – |
Protein Assay Dye – Reagent Concentrate | Bio-Rad | 5000006 | Used in the bradford assay to determine protein concentration – 5x concentration |
Sodium Chloride (NaCl) | BioShop | 7647-14-5 | Biotechnology Grade |
Streptavidin (SA) Biosensors | ForteBio | 18-5019 | One tray of 96 biosensors coated with streptavidin for quantitation, screening, or kinetic applications. |
Superdex S200 (300/10) | Amersham Pharmacia Biotech | 175175-01 | – |
Thiamine | Merck | 69271 | – |
Tris-HCl | BioShop | 77-86-1 | Reagent Grade |
Triton X-100 | BioShop | 900998-1 | Biotechnology Grade |
Tween-20 | BioShop | 56-40-6 | Reagent Grade |
Ultra centrifuge | Beckman Coulter | 365668 | – |