Summary
我们提出了一种方法，结合膜蛋白纯化和重组到消化片在一个单一的色谱步骤。生物素氨酸脚手架用于通过生物层干涉测量直接表面附着和蛋白质-配体相互作用的测量。
Abstract
膜蛋白，包括传输器、通道和受体，占细胞蛋白酶的近四分之一，占当前药物靶点的一半以上。然而，在学术或工业环境中，它们的特征和利用的一个主要障碍是，大多数生物化学、生物物理和药物筛选策略要求这些蛋白质处于水溶性状态。我们的实验室最近开发了peptidisc，一种膜仿制，为膜蛋白溶解性问题提供了"一刀切"的方法。我们在这里提出了一个简化的协议，结合蛋白质纯化和消化剂重组在一个单一的色谱步骤。这种工作流程称为PeptiQuick，允许绕过透析和培养聚苯乙烯珠，从而大大减少接触洗涤剂，蛋白质变性和样品损失。当使用生物小化脚手架执行 PeptiQuick 时，可直接将制备物连接到链球蛋白涂层表面。无需生物酸化或修改膜蛋白靶点。PeptiQuick在这里展示了膜受体FhuA和抗菌配体绞痛M，使用生物层干涉测量来确定其相互作用的精确动力学。结果表明，PeptiQuick是在无洗涤剂环境中在一天内制备和分析膜蛋白-配体相互作用的便捷方法。
Introduction
膜蛋白通常被排除在药物或抗体发现研究项目之外，因为膜蛋白倾向于在脂质双层环境之外聚集，特别是在洗涤剂1的存在下。因此，近年来，已经开发出几种膜模子（称为支架），以方便在完全无洗涤剂的环境中分离和询问膜蛋白（即纳米光盘、SMALPs、两栖器等）。2，3，4，5，6.然而，在这些仿生中重组膜蛋白往往需要广泛的优化，这非常耗时，通常伴随着蛋白质恢复损失7，8。为了克服这些限制，我们的实验室最近开发了一种"一刀切"的配方，称为"peptidisc9"。当一个设计师4.5 kDa两栖肽的多个副本结合到靶膜蛋白的疏水表面时，形成肽。在去除洗涤剂后，在消化不良中进行稳定的重组，将内源脂质和溶解膜蛋白插入水溶性颗粒中。这些稳定颗粒现在适用于许多下游应用。
peptidisc 方法具有以下几个优点：例如，重组是直接的，因为将peptidisc支架绑定到目标是由蛋白质模板本身9，10指导。肽质测定也是自定，不需要添加外源脂质。肽形成通过简单的洗涤剂稀释发生，这是比透析或聚苯乙烯珠子吸附的重要优势，这往往导致低蛋白产量由于非特异性表面关联和聚集11，12 ， 13.最终的 peptidisc 组件具有高热稳定性，始终可溶于不同的缓冲液或存在二价阳离子（例如，Ni2+）。支架的纯度和结构均匀性也很高（例如，无内毒素），肽可以根据放置在不同位置的功能组进行定制。
我们在这里提出了一个实验室工作流程称为PeptiQuick，也被称为在珠上重组9。该协议将膜蛋白纯化和肽膜重组合并到一个步骤和相同的色谱支持。顾名思名，PeptiQuick 与其他重组方法相比是快速的，并且还严重减少了接触洗涤剂的时间。负面的洗涤剂效应，如蛋白质展开和聚集，通常以时间相关的方式发生;因此，尽量减少洗涤剂的暴露对于维持本地蛋白质的构象至关重要。这对报告蛋白质相互作用和配体结合亲和力的方法的准确性至关重要。
在开发此协议时，我们演示了称为"生物-Peptidisc"的新型仿生式支架版本。生物锡功能组允许将目标膜蛋白附着在链球菌蛋白涂层表面。由于生物锡标签仅限于支架，目标膜蛋白上的结合位点保持不变。使用Bio-Peptidisc，确定细菌膜受体FhuA和抗菌肽绞酸（ColM）的结合动力学。这种亲和力是通过生物层干涉测量（BLI）测量的，它根据传感器尖端反射的白光干扰模式实时分析相互作用。
通过使用该协议，在BLI分析期间对洗涤剂的需求被消除，这是一个重要的发展，因为洗涤剂可以破坏相互作用。结合亲和力可以用这种方法快速测量，结果与之前使用纳米盘和等温滴热量测定（ITC）16报告的结果相当。显示并讨论了 PeptiQuick 工作流程中的关键步骤，如蛋白质制备、洗涤剂稀释、肽添加和重组，以及解决 BLI 测定中的配体和分析剂结合的提示。使用PeptiQuick工作流程，可以发现膜蛋白可以在一天内被捕获到肽片及其相互作用中。
Protocol
1. 膜受体FhuA的制备和溶解
- 表达他的6标签FhuA在大肠杆菌菌株AW740。在M9介质中在37°C下生长细胞18小时（表1）。有关详细的表达协议，请参阅 Mills 等人16。
- 通过离心（5，000 x g，10分钟，4°C）收获细胞，并将其重新悬浮在50 mL的三盐-甘油（TSG）缓冲液中（表1）。在裂解前，将悬浮细胞加入苯甲烷硫磷酸二酯（PMSF）至1 mM的最终浓度。
注意：PMSF 具有毒性和腐蚀性。 - 在15，000 psi处使用微流体化器（三个通道）或以8，000 psi的法式压榨机（三段）对细胞进行酶。通过低速离心（5，000 x g，10分钟，4°C）将未解压的细胞和其他不溶性物质颗粒。
- 超离心上清液（200，000 x g，40分钟，4°C）分离粗膜分数。丢弃上清液，将膜颗粒重新悬浮在最小量的TSG缓冲液中，并使用玻璃或金属钳子装置进行弹跳，以确保均匀性。
- 执行布拉德福德测定，检查悬浮粗膜的蛋白质浓度。在溶解前，使用TSG缓冲液将粗膜稀释至3mg/mL的最终浓度。
- 将洗涤剂Triton X-100添加到1%（v/v）的最终浓度中，在4°C下选择性地溶解细菌内膜1小时，轻轻摇动。通过超离心（200，000 x g，40分钟，4°C）将不溶性物质（外膜部分）颗粒。
- 丢弃含有溶解膜的上清液，并将TSG中的颗粒重新悬浮至3mg/mL的最终浓度。将月桂二甲基胺氧化物（LDAO）加入1%（v/v）的浓度，加入重新悬浮的外膜部分，在4°C下溶解1小时，轻轻摇动。
- 执行最后的离心步骤，以颗粒所有不溶性物质（200，000 x g，40分钟，4°C）。
注：由此产生的上清液含有溶解的外膜蛋白，包括目标，他标记的FhuA。
2. 使用 PeptiQuick 工作流程对 FhuA 进行净化和重组
- 预装的 Ni-NTA 柱（5 mL 树脂体积），两列体积的固定金属亲和色谱 （IMAC） 洗涤缓冲液（表 1）。
- 使用 TSG 将溶解外膜从 1% LDAO 稀释至 0.04% LDAO。然后，将伊米达索添加到5 mM的最终浓度中。
注意：伊米达索是有毒和腐蚀性的。 - 将溶解的外膜蛋白加载到 Ni-NTA 树脂上并收集流过。将流水重新加载到树脂上，以增加 FhuA 的树脂结合并收集次级流。
注：保留20μL的溶解材料等分，作为以后硫酸盐聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析的参考。 - 用 250 mL 的 IMAC 洗涤缓冲液清洗树脂，并收集前 50 mL 的洗液。将洗涤缓冲液排空至树脂床体积的高度，并关闭柱子上的止动孔。
- 将1mL的浓缩10mg/mL生物肽溶液（表1）加入柱中。在TSG中加入50 mL的稀释1mg/mL生物-肽肽溶液，用玻璃棒搅拌树脂，将珠子重新悬浮在TSG中。
- 在消化吸收后，允许树脂通过树脂沉淀和排空超过 1 mg/mL 生物-Peptidisc 溶液。
- 用 50 mL 的 TSG 清洗 Ni-NTA 附着的肽颗粒。用15 mL的IMAC洗脱缓冲液（表1）来洗取含有600 mM imidazole的TSG颗粒。收集1 mL分数，并立即加入10 μL的0.5M EDTA，以切出浸出的镍离子。
注意：EDTA是一个刺激物。
3. 对PeptiQuick重建的评价
- SDS-PAGE 分析
- 在 60 mA 的恒定电流下，将 PeptiQuick 重组中的起始材料、流通、洗涤和洗脱馏分的 10 μL 等分物加载到 12% SDS 变性凝胶和电液上 30 分钟。
- 用 Coomassie 蓝色染料染色凝胶，使凝胶脱色，并在扫描仪上可视化。
- 尺寸排除色谱 （SEC）
- 基于 PeptiQuick 重组的 12% SDS-PAGE 分析，分离并汇集相关馏分，并使用 30 kDa 截止离心集中器将其集中。
注： 在随附的视频中，分数 F3+F7 被汇集在一起，并集中在 1 mL 以下（SEC 仪器上的喷射环路体积）。 - 在 TSG 缓冲液中以 0.25 mL/min 的流速将汇集的 IMAC 洗脱分数注入凝胶过滤 S200 （300/10） 柱上。收集 1 mL 分数，并在 12% SDS 凝胶上运行，以确定要汇集和集中的 SEC 分数。
注： 洗脱的 PeptiQuick 分数可以不集中地汇集在一起，并且可以向 SEC 注入等分，以检查重组的质量。这是对离心浓度期间对聚集有潜在敏感性的膜蛋白的重要控制。
- 基于 PeptiQuick 重组的 12% SDS-PAGE 分析，分离并汇集相关馏分，并使用 30 kDa 截止离心集中器将其集中。
4. 生物层干涉测量
- BLI 实验设置
- 手动设置 96 孔板。
注：所有井的填充量为200 μL。 - 在第 1 列 A+E 行中，加载 200 μL 的动力学缓冲器，以允许提示平衡并形成基线信号。
- 将配体（生物-肽中的FhuA）稀释至动力学缓冲液中浓度为2.5微克/mL（表1）。将 200 μL 的这种稀释量加载到第 2 列中的行 A_D 中。
- 仅向 E2（参考传感器）添加 200 μL 动力学缓冲液。
- 将 200 μL 的动力学缓冲液添加到列 3，行 A+E，以从尖端洗涤多余的 FhuA。
- 在列 4 中，从 A4 到 D4 对板下进行双向连续稀释。从 28 nM （8°Kd） 在 A4 到 3.5 nM （1+Kd） D4 中开始。
- 将 28 nM ColM 添加到 E4 中，以测量非特定结合（使用的最高 ColM 浓度）。
- 将 200 μL 的动力学缓冲区添加到第 5 列 A+E 行。
注：此处，ColM 将脱离尖端，并测量分离。 - 将设置板放在 BLI 仪器中。
- 将传感器尖端托盘放入 BLI 仪器中。
- 打开 BLI 数据采集软件，并在软件向导上选择"新动力学实验"。
- 使用板定义选项卡将 96 孔板的布局输入到软件中。
注：含有配体FhuA的井被输入为"负载"。仅输入包含缓冲区的井作为"缓冲区"。含有麻醉剂ColM的孔被输入为"样本"。 - 使用测定定义选项卡定义实验中每个步骤的时间长度和板旋转速度。
注：实验步骤设置为：1）基线：60 s;2） 装载： 250 s;3） 基线2：300 s;4） 关联： 450 s;5） 解离：900 s. 将摇动速度保留为默认值（1，000 rpm）。通过选择所需的步骤，并右键单击每列上的"添加"步骤，分别将上述步骤分配给 96 井板中的每个列。 - 通过右键单击第一列并选择"开始新"进行分配第一步。确保使用右下角窗口正确分配基线步骤，并根据需要使用下拉菜单进行更改。
- 通过右键单击板并选择"添加"执行步骤，将后续步骤分配给每列。将它们分配给相应的列，如步骤 4.1.13 中设置的那样。
- 使用传感器分配选项卡确保八位听器从传感器托盘中的正确位置取取 BLI 引脚。
注：在传感器分配选项卡中，只有 A1+E1 应以蓝色突出显示。确保传感器托盘中的这些位置存在传感器尖端，并确保 F1_H1 为空。 - 在屏幕上高亮显示 F1_H1，然后右键单击并选择"删除"以将其标记为空。使用后，勾选更换托盘中的传感器以保留用过的传感器。
- 在"审阅实验"选项卡中，在审核实验选项卡中，它提供了执行前实验的最终概述，请复习实验步骤以确保整个设置正确无误。
- 在"运行实验"选项卡中，选择一个文件位置以保存方法文件。
- 将板温度更改为室温。
- 选择GO以运行实验。
- 手动设置 96 孔板。
- BLI 数据分析
- 打开八角布利数据分析软件。
- 使用数据选择选项卡查找实验并检查实验摘要。从步骤 4.1.19 中定义的保存位置导入项目文件。
- 通过选择每个实验的传感器信息输入Anlyate的浓度（此处，ColM）。
- 将 E1 中的提示指定为参考提示。
- 使用处理选项卡从实验数据中减去参考信号 （E1）。检查参考提示中的原始数据，了解非特异性解毒物绑定。如果未观察到任何情况，请继续。
注：这是一个重要的负控制。如果观察到非特定绑定，将在步骤 4.2.7 中说明这一点。 - 将 y 轴与第二个基线步骤对齐。不要勾选跨步连接。选择萨维茨基-戈莱过滤。选择"处理数据"！.
- 在分析选项卡中，选择绘图下方表中的实验数据，以查看与参考传感器中减去信号的关联和解离曲线。
- 选择 1：1 绑定模型并选择部分曲线拟合。选择拟合曲线！ .
- 分析残差视图图以检查曲线拟合。
- 滚动表格以查看计算出的 Kd。
- 选择"保存报表..."可保存电子表格文档，详细说明设置、原始数据和分析数据的绘图以及计算出的解向常量。
Representative Results
膜受体FhuA在实验室大肠杆菌菌株中表达。外膜部分通过离心进行收割，蛋白质通过两步洗涤剂提取进行溶解。溶解膜蛋白被加载到尼-NTA抗胶珠体包装在塑料柱中，然后是方案中提出的PeptiQuick工作流程。使用尺寸排除色谱进行质量控制后，Bio-Peptidisc 颗粒被固定到链球蛋白涂层销上。进行 BLI 分析以测量 FhuA 和 ColM 之间相互作用的动力学。图1给出了本实验的原理图概述。
运行 SDS 凝胶以确定从 IMAC 列中洗脱 FhuA Bio-Peptidisc 颗粒后重建的质量（图 2）。与启动、流通、洗液和洗脱分数相对分的等分被加载到SDS凝胶上，以评估PeptiQuick方法的成功。流通分数中的FhuA消耗与洗脱分数的富集相关，表明蛋白质的纯化是有效的。在洗脱的馏分中观察到轻微的污染物蛋白带。SDS 凝胶分析用于确定在 SEC 分析之前应汇集哪些分数。还运行一种洗脱 FhuA 生物-Peptidisc 颗粒的原生凝胶，以确认 FhuA 的溶解性（补充图 1）。重组后的蛋白质迁移到原生凝胶中表明，在无洗涤剂的环境中，蛋白质溶解性。
执行 SEC 分析以评估肽颗粒的溶解度。图3A所示的色谱图显示，在约14 mL（6 mL超过凝胶过滤S200 10/300柱上的8.0 mL空隙体积）的单个对称峰值渗漏。此峰值的位置超过空隙体积，证实了 FhuA 生物-Peptidisc 颗粒的溶解度。作为参考，图 3B说明了一个理论不理想的方案处理。在这种情况下，色谱图显示在空隙体积处出现较大的蛋白质峰值，表明存在蛋白质聚集体。刚刚超过主肽峰的较小峰与多余的肽肽相对应。
FhuA 与麻醉剂 ColM 的相互作用是在将肽片连接到链球蛋白涂层传感器后确定的。传感器尖端首先在动力学缓冲液中平衡，然后转移到包含FhuA Bio-Peptidisc的缓冲液中。FhuA Bio-Peptidisc的浓度及其用尖端孵育的时间长度在本实验之前进行了优化（补充图1）。在加载和洗涤步骤后，关联步骤测量加载的尖端和四种不同浓度的绞痛体 M 之间的相互作用。随后将尖端移回缓冲液会导致解离，其测量点由从尖端反射的白光的波长偏移来测量。
图 4A显示了此实验的原始数据传感器图输出。除了以黄色表示的参考跟踪外，所有跟踪在加载和基线步骤中都显得均匀。参考尖端没有装配体，但暴露于非特异性结合的解毒物中，这是一个重要的负控制。为了对结果进行更详细的分析，从实验提示的曲线中减去参考尖端的信号，以考虑非特异性绑定。数据与关联步骤的开始对齐，以便进行直接的可视化比较，如图4B所示。此比较显示，随着绞痛M浓度的增加，波长偏移增加。曲线适合数据，并表现出经典的 1：1 绑定模型。
描述拟合和实验数据之间的差异的残余视图图（图 4B，下图）显示，与三个较低浓度相比，ColM（28 nM）最高浓度的拟合较差。曲线本身的轮廓缺乏绑定曲线高原，这是典型的绑定实验中结合位点饱和的特征。缺乏高原表明异质结合，这可能是高ColM浓度的一个伪影。因此，这种最高的ColM浓度从分析中打折扣，其他三个浓度用于确定解离常数（图4C，D）。一个双尾学生的t-测试，在95%的置信水平，发现观察到的解离常数从这个实验没有显著差异，使用不同的技术获得的值（图4E）16。
图 1：使用生物-Peptidisc 和 BLI 分析的 PeptiQuick 工作流概述。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：SDS凝胶分析（12%）通过 PeptiQuick 工作流收集的起始、流流、洗涤和洗脱分数。约10μL的样品被加载到每个通道，并在60 mA的恒定电流下运行30分钟。凝胶被沾染了Coomassie蓝色，去污，并在凝胶扫描仪上可视化。请点击此处查看此图的较大版本。
图3：分别代表最佳和次优重组的实验和理论 SEC 配置文件。（A） 在生物-Peptidisc 中，PeptiQuick 重组 FhuA （+82 kDa） 的实验 SEC 配置文件。IMAC 洗脱分数 F3_F7 采用 30 kDa 截止离心集中器进行集中和浓缩，以 ±1 mL。该浓缩样品以0.25 mL/min注入TSG缓冲液中的凝胶过滤S200（10/300）柱。（B） 不优的 PeptiQuick 重组的理论 SEC 配置文件。请点击此处查看此图的较大版本。
图4：在生物-皮盘中重组的ColM与FhuA的相互作用。（A） 带参考传感器跟踪为黄色的原始数据传感器图。（B，C）顶部：关联和解散步骤，部分 1：1 绑定曲线拟合。底部：描述实验数据和计算拟合之间的差异的残差视图。（C） 重新绘制 （B） 与排除最高浓度的 ColM .（d） 观察到的关联和解离率（k开和 k 分别关闭）和解离常数 （Kd）。（E） 通过肽和 BLI（在本实验中）、肽和微尺度热泳（Saville，未发表的数据）和纳米圆度和等温滴焦度16获得的FhuA-ColM解散常数的比较。误差柱表示一个不确定 SD，n.s. 表示在 95% 置信水平处没有显著差异。请点击此处查看此图的较大版本。
| M9 介质（每升） |
| 200 mL M9 盐 |
| 800 mL dH2O |
| 10 mL 40% 葡萄糖 |
| 80 μL 1 M CaCl2 |
| 2.5 mL 1 M MgSO4 |
| 300 μL 15毫克/mL 二胺 |
| TSG 缓冲器 |
| 50 mM Tris-HCl，pH 7.8 |
| 50 mM 纳Cl |
| 10% 甘油 |
| IMAC 洗涤缓冲器 |
| 50 mM Tris-HCl，pH 7.8 |
| 50 mM 纳Cl |
| 10%甘油 |
| 0.04% LDAO |
| 5 mM 伊米达佐尔 |
| 生物消化解决方案 |
| 将即用型生物皮盘（纯度>95%）溶解在无菌 dH2O 中。肽溶液的浓度和体积取决于重建过程中的步骤。 |
| 50 mM Tris-HCl，pH 7.8 |
| 50 mM 纳Cl |
| 注：此生物肽肽库存稳定在4°C以上一个多月。 |
| IMAC 洗脱缓冲器 |
| 50 mM Tris-HCl，pH 7.8 |
| 50 mM 纳Cl |
| 10% 甘油 |
| 600 mM 伊米达佐尔 |
| 动力学缓冲区 |
| 50 mM Tris-HCl，pH 7.8 |
| 50 mM 纳Cl |
| 0.002% 补间-20 |
| 0.1% BSA |
表1：培养介质和解决方案的食谱。
补充图1：从PeptiQuick工作流程收集的洗脱分数的4%-16%的透明原生凝胶分析。约10μL的样品被加载到每个通道，并在30 mA的恒定电流下运行40分钟。凝胶被沾染了Coomassie蓝色，去污，并在扫描仪上可视化。请点击此处下载此图。
补充图2：使用单针优化配体浓度。（A） 生物-Peptidisc 中的六种不同浓度的 FhuA 测试与单个链球蛋白涂层引脚结合。这是设置在96孔板与缓冲在配体浓度之间的井（参见补充文件1的设置协议）。（B） 配体优化实验的原始数据传感器图.引脚提供最大的响应，并在浓度4（或2.5 μg/mL）时达到饱和度。请点击此处下载此图。
补充文件 1.请点击此处查看此文件（右键单击下载）。
Discussion
虽然洗涤剂仍然是提取和纯化膜蛋白的最简单方法，但这些表面活性剂对蛋白质的稳定性、功能和下游分析有许多不希望的影响1、2、3、4，5，6，7，8，9 。这些困难促使膜仿生学的发展，它努力尽量减少洗涤剂的存在，并尽可能复制原生膜环境2，3，4，5，6.然而，大多数的重组方法需要对重建条件进行重大优化，并且经常需要额外的纯化步骤，从而降低最终产量7，8。peptidisc自发地适应目标膜蛋白，相对而言，只需很少的优化和下游纯化9、10。在此协议中，PeptiQuick 作为简化下游蛋白质-蛋白质相互作用分析的重组方案的简单方法。
虽然简单明了，但有几个实验性的警告可能导致重建不成功。其中，最常见的是由于蛋白质聚集。因此，执行尺寸排除色谱以监测重组过程至关重要。例如，在空隙体积处吹除大小峰值表示蛋白质聚集（图3B）17、18。膜蛋白聚集体通常在长期暴露于次优洗涤剂条件下后形成，在重组之前。特别是，人们发现，洗涤剂中的膜蛋白在离心装置上通过超滤浓缩时，往往会形成聚合体。在这种情况下，敏感膜蛋白可能使用真空超滤进行浓缩，这是一种更温和、更均匀的浓缩方法，因为蛋白质对过滤器的吸附减少。
一般来说，为了避免蛋白质浓度，应将洗脱的IMAC馏分集中，并将等分注入大小排除列以检查其重组质量。需要注意的是，未结合的游脱肽在主肽峰（图3B）之后就已脱。自由支架不一定妨碍下游实验。但是，如果需要，可以通过尺寸排除色谱法去除这种多余的量。或者，在重组期间和从IMAC树脂洗脱之前增加洗涤体积，足以有效去除大多数游离肽。因此，尺寸排除色谱被推荐作为检查重组质量的快速和简单的方法。
BLI实验需要仔细优化配体和和分析剂浓度。条带绑定必须足以获得清晰的信号，但过载将导致信号饱和，从而导致数据伪影因过度拥挤和尖端表面的停滞而产生。因此，必须针对每个蛋白质样本优化配体浓度和尖端在配体溶液中花费的时间长度（补充图2）。分析剂浓度也必须优化。如果解散常数是已知的，此步骤就变得更容易了，因为浓度范围可以近似。这种分析的一个好起点是使用蛋白质浓度在0.1至20倍的预期Kd19之间。
在 BLI 数据采集后，必须执行仔细的数据分析以避免误解。解向常数的计算取决于绑定曲线的拟合。除非束缚化学计量学是已知的，否则应该使用经典的1：1双分子相互作用模型进行初始拟合。应当指出，异构结合曲线通常是高反素浓度引起的人工制品和非理想行为的结果，这种作用可能被误解为复杂的结合模型。因此，在传感器图配置文件显示 1：1 结合测结仪之前，降低分析物浓度有助于区分异构结合和更复杂的相互作用。然后，任何残余异构绑定数据都打折扣，如图420所示。
在本报告中，测量了FhuA-ColM相互作用的解散常数为2.28 ± 0.74 nM。此值与以前使用 ITC 或 MST 使用纳米光盘或 peptidisc 的组中确定的解散常数一致（图 4E）16。这种一致性提供了对 peptidisc 重组和 BLI 分析的信心，作为确定相互作用动力学的方法。重要的是，应该指出，蛋白质通常固定在链球菌蛋白生物传感器上，无论是通过生物链球菌化学交联或使用大肠杆菌生物链酶BirA21进行现场特异性添加。显然，生物小化的肽脚手架，而不是目标膜蛋白，有许多优点。支架生物异化可节省时间，并尽可能减少破坏重要蛋白质结合位点的可能性。我们还发现，PeptiQuick适用于广泛的蛋白质靶类，包括G-蛋白耦合受体（GPCRs）、电团道和β-桶膜蛋白。一般来说，应该注意的是，膜蛋白的初始洗涤剂提取物进入无聚合状态至关重要，并且立即在 peptidisc 中重组可减少下游聚集问题。鉴于其简单性，PeptiQuick 将扩展到其他基于链球蛋白的结合测定，如表面质子共振 （SPR）、ELISA 测定和使用链球蛋白珠的亲和性下拉下。
Disclosures
FD 是 Peptidisc 生物技术公司的创始人，负责向学术界分发肽。Peptidisc 生物技术公司还与工业生物技术和制药公司合作，在其发现工作流中实施 peptidisc。本文的开放访问出版物由 FortéBio 赞助。
Acknowledgments
我们感谢加拿大自然科学和工程研究理事会。JS 拥有 CGS-M CIHR 奖学金。LT得到了生物技术和生物科学研究理事会资助的西南生物科学博士培训伙伴关系的支持[培训补助金参考BB/M009122/1]。FD 是二级加拿大研究主席。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30 kDa cut-off centrifugal concentrator | Millipore Sigma | C7715 | - |
| Ampicillin | BioShop | 69-52-3 | Sodium Salt |
| Bio-Peptidisc Peptide | Peptidisc Biotech | https://peptidisc.com | - |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | 9048-46-8 | Lyophilized powder |
| CaCl2 | Fisher Chemical | 10035-04-8 | Certified ACS |
| EDTA | BioShop | 6381-92-6 | Biotechnology Grade |
| Ettan LC (AKTA) | Amersham Pharmacia Biotech | 18-1145-58 | - |
| Glucose | BioShop | 50-99-7 | Anhydrous, Reagent Grade |
| Glycerol | Fisher Chemical | 56-81-5 | Certified ACS |
| Imidazole | BioShop | 288-32-4 | Biotechnology Grade |
| Lauryldimethylamine oxide (LDAO) | Sigma | 101822204 | ~30% in H2O |
| MgSO4 | Fisher Chemical | 10034-99-8 | Certified ACS |
| Microfluidizer | Microfluidics | M-110L | Fit with F20Y 75µ diruption chamber |
| Ni-NTA Resin | Gold Biotechnology | H-320-50 | - |
| Non-binding 96well BLI Plate | Greiner Bio-one | 655076 | Microplate, PS, 96 well, F-Bottom (chimney well), Black, Fluotrac, Med. Binding |
| Octet Red96 | FortéBio | OCTET RED96E-GxP | Octet RED96e instrument, Octet CFR software, desktop computer, LC monitor, accessory kit, IQ/OQ kit, PQ Kits and one-year warranty |
| Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) | Sigma | P-7626 | - |
| Protein Assay Dye - Reagent Concentrate | Bio-Rad | 5000006 | Used in the bradford assay to determine protein concentration - 5x concentration |
| Sodium Chloride (NaCl) | BioShop | 7647-14-5 | Biotechnology Grade |
| Streptavidin (SA) Biosensors | ForteBio | 18-5019 | One tray of 96 biosensors coated with streptavidin for quantitation, screening, or kinetic applications. |
| Superdex S200 (300/10) | Amersham Pharmacia Biotech | 175175-01 | - |
| Thiamine | Merck | 69271 | - |
| Tris-HCl | BioShop | 77-86-1 | Reagent Grade |
| Triton X-100 | BioShop | 900998-1 | Biotechnology Grade |
| Tween-20 | BioShop | 56-40-6 | Reagent Grade |
| Ultra centrifuge | Beckman Coulter | 365668 | - |
References
- Rawlings, A. E. Membrane proteins: always an insoluble problem. Biochemical Society Transactions. 44 (3), 790-795 (2016).
- Popot, J. L. Amphipols, Nanodiscs, and Fluorinated Surfactants: Three Non Conventional Approaches to Studying Membrane Proteins in Aqueous Solutions. Annual Review of Biochemistry. 79, 737-775 (2010).
- Lee, S. C., et al. A Method for Detergent-Free Isolation of Membrane Proteins in their Local Lipid Environment. Nature Protocols. 11, 1149-1162 (2016).
- Frauenfeld, J., et al. A Saposin-Lipoprotein Nanoparticle System for Membrane Proteins. Nature Methods. 13, 345-351 (2016).
- Bayburt, T. H., Grinkova, Y. V., Sligar, S. G. Assembly of Single Bacteriorhodopsin Trimers in Bilayer Nanodiscs. Archives of Biochemistry and Biophysics. 450, 215-222 (2006).
- Denisov, I. G., Grinkova, Y. V., Lazarides, A. A., Sligar, S. G. Directed Self-Assembly of Monodisperse Phospholipid Bilayer Nanodiscs with Controlled Size. Journal of the American Chemical Society. 126, 3477-3487 (2004).
- Denisov, I. G., Sligar, S. G. Nanodiscs for Structural and Functional Studies of Membrane Proteins. Nature Structural, Molecular Biology. 23, 481-486 (2016).
- Hagn, F., Etzkorn, M., Raschle, T., Wagner, G. Optimized Phospholipid Bilayer Nanodiscs Facilitate High-Resolution Structure Determination of Membrane Proteins. Journal of the American Chemical Society. 135, 1919-1925 (2013).
- Carlson, M. L., et al. The Peptidisc, A Simple Method for Stabilizing Membrane Proteins in Detergent-Free Solution. eLife. 7, 34085 (2018).
- Carlson, M. L., et al. Profiling the E. coli Membrane Interactome Captured in Peptidisc Libraries. eLife. 8, 46615 (2019).
- Serdakowski, A., et al. A novel method to determine residual detergent in biological samples post endotoxin reduction treatment and evaluation of strategies for subsequent detergent removal. International Immunopharmacology. 37, 16-22 (2016).
- Smith, S. M. Strategies for the Purification of Membrane Proteins. Protein Chromatography. 681, 485-496 (2011).
- Lin, S. H., Guidotti, G. Purification of Membrane Proteins. Methods in Enzymology. 463, 619-629 (2009).
- Wolfe, A. J., Gugel, J. F., Chen, M., Movileanu, L. Kinetics of Membrane Protein-Detergent Interactions Depend on Protein Electrostatics. Journal of Physical Chemistry B. 122 (41), 9471-9481 (2018).
- Montigny, C., et al. Slow Phospholipid Exchange between a Detergent-Solubilized Membrane Protein and Lipid-Detergent Mixed Micelles: Brominated Phospholipids as Tools to Follow Its Kinetics. PLoS ONE. 12 (1), 0170481 (2017).
- Mills, A. T., Le H, T., Coulton, J. W., Duong, F. FhuA Interactions in a Detergent-Free Nanodisc Environment. Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1838 (1), 364-371 (2014).
- Hong, P., Koza, S., Bouvier, E. S. P. Size-Exclusion Chromatography for the Analysis of Protein Biotherapeutics and their Aggregates. Journal of Liquid Chromatography Related Technologies. 35 (20), 2923-2950 (2012).
- Mahler, H. C., Friess, W., Grauschopf, U., Kiese, S. Protein aggregation: Pathways, induction factors and analysis. Journal of Pharmaceutical Sciences. 98 (9), 2909-2934 (2009).
- FortéBio. Octet System Data Acquisition User Guide, Release 7.1. . , Available from: http://www.biophysics.bioc.cam.ac.uk/wp-content/uploads/2014/01/Data-Acquisition-Octet.pdf (2014).
- FortéBio. Octet System Data Analysis User Guide, Release 7.1. . , Available from: http://www.biophysics.bioc.cam.ac.uk/wp-content/uploads/2011/02/Data-Analysis-Octet.pdf (2011).
- Trinkle-Mulcahy, L. Recent advances in proximity-based labeling methods for interactome mapping. F1000Research. 8, 135 (2019).
