Summary
Presentamos un método que combina la purificación y reconstitución de proteínas de membrana en peptidiscs en un solo paso cromatográfico. Los andamios biotinylados se utilizan para la unión directa de la superficie y la medición de interacciones proteína-ligand a través de la interferometría de biocapa.
Abstract
Las proteínas de membrana, incluidos los transportadores, los canales y los receptores, constituyen casi una cuarta parte del proteoma celular y más de la mitad de los objetivos actuales de los fármacos. Sin embargo, una barrera importante para su caracterización y explotación en entornos académicos o industriales es que la mayoría de las estrategias de detección bioquímica, biofísica y de drogas requieren que estas proteínas estén en un estado soluble en agua. Nuestro laboratorio desarrolló recientemente el peptidisc, una membrana mimética que ofrece un enfoque "único para todos" para el problema de la solubilidad de proteínas de membrana. Presentamos aquí un protocolo simplificado que combina la purificación de proteínas y la reconstitución de peptidisc en un solo paso cromatográfico. Este flujo de trabajo, llamado PeptiQuick, permite eludir la diálisis y la incubación con perlas de poliestireno, lo que reduce en gran medida la exposición al detergente, la desnaturalización de proteínas y la pérdida de muestras. Cuando PeptiQuick se realiza con andamios biotinylados, la preparación se puede unir directamente a superficies recubiertas de estreptavidina. No hay necesidad de biotinylate o modificar la diana de la proteína de membrana. PeptiQuick se muestra aquí con el receptor de membrana FhuA y la colicina antimicrobiana M, utilizando interferometría biocapa para determinar la cinética precisa de su interacción. Se concluye que PeptiQuick es una forma conveniente de preparar y analizar las interacciones entre proteínas de membrana en un día en un entorno libre de detergente.
Introduction
Las proteínas de membrana a menudo se excluyen de los programas de investigación de descubrimiento de fármacos o anticuerpos debido a la propensión de las proteínas de membrana a agregarse fuera del entorno de bicapa de lípidos, especialmente en presencia de detergentes1. Por lo tanto, en los últimos años, se han desarrollado varios miméticos de membrana (llamados andamios) para facilitar el aislamiento y el interrogatorio de proteínas de membrana en un entorno completamente libre de detergente (es decir, nanodiscos, SMALPs, anfípolos, etc.) 2,3,4,5,6. Sin embargo, la reconstitución de proteínas de membrana en estos miméticos a menudo requiere una optimización extensa, que es lenta y generalmente acompañada con la pérdida de recuperación de proteínas7,8. Para superar estas limitaciones, nuestro laboratorio recientemente desarrolló una formulación "única para todos" conocida como peptidisc9. El peptidisc se forma cuando varias copias de un péptido biheliático anfípata de 4,5 kDa de diseño se unen a la superficie hidrófoba de una proteína de membrana diana. La reconstitución estable en el peptidisco se produce al eliminar el detergente, atrapando tanto los lípidos endógenos como las proteínas de membrana solubilizadas en partículas solubles en agua. Estas partículas estabilizadas ahora son susceptibles para numerosas aplicaciones posteriores.
El método peptidisc ofrece varias ventajas; por ejemplo, la reconstitución es sencilla, ya que la unión del andamio peptidisc en el objetivo se guía por la propia plantilla de proteína9,10. La estequiometría de péptidos también es autodeterminada, y la adición de lípidos exógenos no es necesaria. La formación de peptidisco se produce mediante una simple dilución de detergente, una ventaja importante sobre la diálisis o la adsorción de perlas de poliestireno, que a menudo dan lugar a un bajo rendimiento proteico debido a la asociación superficial no específica y la agregación11,12 ,13. El conjunto final de peptidisc es altamente termoestable e invariablemente soluble en diferentes tampones o en presencia de cationes divalentes (por ejemplo, Ni2+). La pureza y homogeneidad estructural del andamio también es alta (por ejemplo, libre de endotoxinas), y el péptido se puede personalizar con grupos funcionales colocados en diferentes posiciones.
Presentamos aquí un flujo de trabajo de laboratorio llamado PeptiQuick, también conocido como reconstitución de perlas9. Este protocolo combina la purificación de proteínas de membrana y la reconstitución de peptidisco en un solo paso y en el mismo soporte cromatográfico. Como su nombre indica, PeptiQuick es rápido en comparación con otros métodos de reconstitución, y también reduce seriamente el tiempo de exposición al detergente. Los efectos negativos del detergente, como el desplegado de proteínas y la agregación, a menudo se producen de una manera dependiente del tiempo; por lo tanto, minimizar la exposición al detergente es fundamental para mantener la conformación de proteínas nativas14,15. Esto es crucial para la precisión de los métodos que informan sobre las interacciones proteicas y las afinidades de unión de ligandos.
Durante el desarrollo de este protocolo, presentamos la novedosa versión biotinilada del andamio peptidisc, denominado Bio-Peptidisc. Los grupos funcionales de biotina permiten la unión de la proteína de membrana diana en superficies recubiertas de estreptavidina. Dado que el etiquetado de la biotina se limita al andamio, los sitios de unión en la proteína de membrana objetivo permanecen inalterados. Utilizando Bio-Peptidisc, se determina la cinética de unión del receptor de membrana bacteriana FhuA y la colicina péptido antimicrobiana M (ColM)16. Esta afinidad se mide a través de la interferometría de biocapa (BLI), que analiza las interacciones en tiempo real basadas en patrones de interferencia de luz blanca reflejados desde una punta del sensor.
Mediante el uso de este protocolo, se elimina la necesidad de detergente durante el análisis de BLI, que es un desarrollo importante, ya que los detergentes pueden interrumpir las interacciones. Las afinidades de unión se pueden medir rápidamente con este método, y los resultados son comparables a los reportados anteriormente utilizando nanodiscos y calorimetría de valoración isotérmica (ITC)16. Se muestran y discuten los pasos críticos en el flujo de trabajo de PeptiQuick, como la preparación de proteínas, la dilución de detergentes, la adición de péptidos y la reconstitución, junto con consejos para solucionar los ligandos y la unión de analitos en el ensayo BLI. Usando el flujo de trabajo de PeptiQuick, se encuentra que las proteínas de membrana se pueden capturar en peptidiscs y sus interacciones medidas dentro de un día.
Protocol
1. Preparación y solubilización del receptor de membrana FhuA
- Express His6-tagged FhuA in Escherichia coli strain AW740. Cultivar células durante 18 h a 37oC en soportes M9 (Tabla 1). Para obtener un protocolo de expresión detallado, consulte Mills etal.
- Cosecha las células por centrifugación (5.000 x g, 10 min, 4 oC) y resuspenderlas en 50 ml de tampón de trisal-glicerol (TSG)(Tabla 1). Saltar a las células resuspendidas y añadir feniloquensulfonilfluoruro (PMSF) a una concentración final de 1 mM justo antes de la lisis.
ADVERTENCIA: PMSF es tóxico y corrosivo. - Lise las células usando un microfluidizador (tres pasajes) a 15.000 psi o una prensa francesa (tres pasajes) a 8.000 psi. Reventar las células no lisadas y otro material insoluble mediante centrifugación de baja velocidad (5.000 x g,10 min, 4 oC).
- Ultracentrifure el sobrenadante (200.000 x g, 40 min, 4 oC) para aislar la fracción de membrana bruta. Deseche el sobrenadante, resuspenda el pellet de membrana en una cantidad mínima de tampón TSG y suéltelo con un aparato de douncer de vidrio o metal para garantizar la homogeneidad.
- Realice un ensayo de Bradford para comprobar la concentración proteica de la membrana bruta resuspendida. Diluir la membrana bruta a una concentración final de 3 mg/ml utilizando tampón TSG antes de la solubilización.
- Añadir detergente Triton X-100 a una concentración final del 1% (v/v) para solubilizar selectivamente la membrana interna bacteriana durante 1 h a 4oC con mecedora suave. Pellet el material insoluble (fracción de membrana externa) por ultracentrifugación (200.000 x g,40 min, 4 oC).
- Deseche el sobrenadante que contenga la membrana solubilizada y vuelva a suspender el pellet en TSG a una concentración final de 3 mg/ml. Añadir el óxido de laurildimetilamina (LDAO) a una concentración de 1% (v/v) a la fracción de membrana externa resuspendida y solubilizar durante 1 h a 4oC con un balanceo suave.
- Realizar un paso de centrifugación final para peletizar todo el material insoluble (200.000 x g,40 min, 4 oC).
NOTA: El sobrenadante resultante contiene las proteínas de membrana externa solubilizadas, incluyendo el FhuA etiquetado con su objetivo.
2. Purificación y reconstitución de FhuA utilizando el flujo de trabajo de PeptiQuick
- Pre-equilibrar una columna Ni-NTA preenvasada (volumen de resina de 5 ml) con dos volúmenes de columna de tampón de lavado de cromatografía de afinidad de metal inmovilizado (IMAC)(Tabla 1).
- Diluir la membrana externa solubilizada de 1% LDAO a 0.04% LDAO usando TSG. A continuación, añadir imidazol a una concentración final de 5 mM.
ADVERTENCIA: El imidazol es tóxico y corrosivo. - Cargue las proteínas de membrana externa solubilizadas en la resina Ni-NTA y recoja el flujo. Vuelva a cargar el flujo sobre la resina para aumentar la unión de resina de FhuA y recoger el flujo secundario a través.
NOTA: Mantenga como referencia una alícuota de 20 l de material solubilizado como referencia para el análisis posterior de la electroforesis del gel de dodecilo sulfato de sodio (SDS-PAGE). - Lavar la resina con 250 ml de tampón de lavado IMAC y recoger los primeros 50 ml de eluido. Escurra el tampón de lavado a la altura del volumen del lecho de resina y cierre la caja de seguridad de la columna.
- Añadir 1 ml de solución de péptido bio-peptidisc concentrado de 10 mg/ml(Tabla 1)a la columna. Añadir 50 ml de solución de péptido Bio-Peptidisc diluido de 1 mg/ml en TSG y agitar la resina con una varilla de vidrio para resuspender las perlas en TSG.
- Después de la captura de peptidisco, deje que la resina se asiente y drene el exceso de 1 mg/ml de la solución Bio-Peptidisc a través de la resina.
- Lave las partículas de peptidisco conectadas a Ni-NTA con 50 ml de TSG. Eluye las partículas de peptidisco con 15 ml de búfer de elución IMAC (Tabla 1) que contiene 600 mM de imidazol en TSG. Recoger 1 mL de fracciones de fracciones y añadir inmediatamente 10 ml de 0,5 M EDTA a iones de níquel lixiviados con quelato.
ADVERTENCIA: EDTA es un irritante.
3. Evaluación de la reconstitución de PeptiQuick
- Análisis SDS-PAGE
- Cargue las alícuotas de 10 ol del material de arranque, el flujo, el lavado y las fracciones elutadas de la reconstitución de PeptiQuick en un gel desnaturalizante SDS del 12% y electroforrese durante 30 minutos a una corriente constante de 60 mA.
- Mancha el gel con tinte azul Coomassie, descongela el gel y visualiza en un escáner.
- Cromatografía de exclusión de tamaño (SEC)
- Basándose en el análisis 12% de SDS-PAGE de la reconstitución de PeptiQuick, aísle y atene las fracciones pertinentes, y constelas utilizando un concentrador centrífugo de corte de 30 kDa.
NOTA: En el vídeo adjunto, las fracciones F3–F7 se agrupan y se concentran por debajo de 1 ml (el volumen del bucle de inyección en el instrumento SEC). - Inyectar 1 ml de las fracciones de elución IMAC agrupadas en una columna S200 (300/10) de filtración de gel a un caudal de 0,25 ml/min en el búfer TSG. Recoger 1 mL fracciones y ejecutarlas en un 12% gel SDS para determinar qué fracciones SEC para piscinar y concentrarse.
NOTA: Las fracciones PeptiQuick eluidas pueden agruparse sin concentración, y se puede inyectar una alícuota en la SEC para comprobar la calidad de la reconstitución. Este es un control importante para las proteínas de membrana que son potencialmente sensibles a la agregación durante la concentración centrífuga.
- Basándose en el análisis 12% de SDS-PAGE de la reconstitución de PeptiQuick, aísle y atene las fracciones pertinentes, y constelas utilizando un concentrador centrífugo de corte de 30 kDa.
4. Interferometría de biocapa
- Configuración experimental BLI
- Configure el 96 pozo a mano.
NOTA: Todos los pozos se llenan a un volumen final de 200 l. - En la columna 1, las filas A-E, carguen 200 l de búfer cinético para permitir que las puntas equilibren y formen una señal de línea base.
- Diluir el ligando (FhuA en Bio-Peptidisc) a una concentración de 2,5 g/ml en el tampón cinético(Tabla 1). Cargue 200 ml de esta dilución en las filas A-D de la columna 2.
- Añadir 200 l de tampón cinético sólo a E2 (el sensor de referencia).
- Añadir 200 l de tampón cinético a la columna 3, filas A-E para lavar el exceso de FhuA de la punta.
- En la columna 4, realice dos diluciones seriales del analito (ColM) por la placa de A4 a D4. Comience con 28 nM (8*Kd) en A4 a 3.5 nM (1*Kd) en D4.
- Agregue 28 nM ColM a E4 para medir la unión no específica (la concentración de ColM más alta utilizada).
- Agregue 200 l de búfer cinético a la columna 5, filas A-E.
NOTA: Aquí, el ColM se disociará de la punta, y se medirá la disociación. - Coloque la placa de configuración en el instrumento BLI.
- Coloque la bandeja de puntas del sensor en el instrumento BLI.
- Abra el software de adquisición de datos BLI y seleccione Nuevo experimento de Kinetics en el asistente de software.
- Utilice la pestaña de definición de placa para introducir el diseño de la placa de pozo 96 en el software.
NOTA: Los pozos que contienen el ligando, FhuA se introducen como la "Carga". Los pozos que contienen el búfer solo se introducen como el "Buffer". Los pozos que contienen el analito, ColM, se introducen como la "Muestra". - Utilice la pestaña definición de ensayo para definir la longitud de tiempo y la velocidad de rotación de la placa para cada paso del experimento.
NOTA: Los pasos experimentales se configuran como: 1) línea de base: 60 s; 2) carga: 250 s; 3) línea de base2: 300 s; 4) asociación: 450 s; y 5) disociación: 900 s. Deje la velocidad de agitación por defecto (1.000 rpm). Los pasos anteriores se asignan individualmente a cada columna en la placa de pozo 96 seleccionando el paso deseado y haga clic con el botón derecho en Agregar paso de ensayo en cada columna. - Asigne el primer paso haciendo clic con el botón derecho en la primera columna y seleccione Iniciar nuevo ensayo. Asegúrese de que el paso de línea base se asigna correctamente utilizando la ventana inferior derecha y cambie con el menú desplegable según sea necesario.
- Asigne los pasos siguientes a cada columna haciendo clic con el botón derecho a lo largo de la placa y seleccionando Agregar pasode ensayo . Asigne estos a la columna apropiada, como se establece en el paso 4.1.13.
- Utilice la pestaña de asignación del sensor para asegurarse de que el instrumento de octeto está tomando los pines BLI de la ubicación correcta en la bandeja del sensor.
NOTA: En la pestaña de asignación del sensor, solo se debe resaltar a A1-E1 en azul. Asegúrese de que haya una punta del sensor en estas ubicaciones en la bandeja del sensor y asegúrese de que f1-H1 esté vacío. - Resalte F1-H1 en la pantalla, haga clic con el botón derecho y seleccione Quitar para marcarlos como vacíos. Marcar Reemplazar sensores en la bandeja después de su uso para retener los sensores utilizados.
- En la pestaña de experimento de revisión, que proporciona una visión general final del experimento antes de la ejecución, repase los pasos experimentales para asegurarse de que toda la configuración es correcta.
- En la pestaña Ejecutar experimento, seleccione una ubicación de archivo para guardar los archivos de método.
- Cambie la temperatura de la placa a la temperatura ambiente.
- Seleccione GO para ejecutar el experimento.
- Configure el 96 pozo a mano.
- Análisis de datos BLI
- Abra el software de análisis de datos Octet BLI.
- Utilice la pestaña de selección de datos para localizar el experimento y comprobar el resumen experimental. Importe el archivo de proyecto desde su ubicación de guardado definida durante el paso 4.1.19.
- Introduzca las concentraciones del analito (aquí, ColM) seleccionando la información del sensor para cada experimento.
- Asigne la punta en E1 como la punta de referencia.
- Utilice la pestaña de procesamiento para restar la señal de referencia (E1) de los datos experimentales. Compruebe los datos sin procesar de la sugerencia de referencia para el enlace de analito sin específico. Si no se observa ninguno, proceda.
NOTA: Este es un control negativo importante. Si se observa un enlace inespecífico, esto se contabilizará en el paso 4.2.7. - Alinee el eje Y con el segundo paso de línea base. No marque la conexión entre pasos. Seleccione Filtrado Savitzky-Golay. Seleccione Procesar datos!.
- En la pestaña de análisis, seleccione los datos experimentales en la tabla debajo de la gráfica para ver las curvas de asociación y disociación con la señal del sensor de referencia restado.
- Seleccione el modelo de encuadernación 1:1 y seleccione un ajuste de curva parcial. Seleccione Ajustar curvas!.
- Analice el trazado de vista residual para comprobar el empalme de curva.
- Desplácese por la tabla para ver el Kdcalculado.
- Seleccione Guardar informe... para guardar un documento de hoja de cálculo que detalle la configuración, los trazados de los datos sin procesar y analizados y las constantes de disociación calculadas.
Representative Results
El receptor de membrana FhuA se expresa en una cepa de laboratorio De. coli. La fracción de membrana externa se cosecha por centrifugación, y las proteínas se solubilizan mediante una extracción de detergente de dos pasos. Las proteínas de membrana solubilizadas se cargan en cuentas de agarosa Ni-NTA embaladas en una columna de plástico, seguidas del flujo de trabajo de PeptiQuick como se presenta en el protocolo. Después de un control de calidad mediante cromatografía de exclusión de tamaño, las partículas Bio-Peptidisc se inmovilizan en pasadores recubiertos con estreptavidina. El análisis BLI se lleva a cabo para medir la cinética de las interacciones entre FhuA y ColM. La descripción general esquemática de este experimento se presenta en la Figura 1.
Se ejecuta un gel SDS para determinar la calidad de la reconstitución después de la elución de partículas FhuA Bio-Peptidisc de la columna IMAC(Figura 2). Las alícuotas de las fracciones correspondientes a inicio, flowthrough, lavados y fracciones de elución se cargan en el SDS-gel para evaluar el éxito del método PeptiQuick. El agotamiento de FhuA en la fracción de flujo a través se correlaciona con un enriquecimiento en las fracciones de elución, lo que indica que la purificación de la proteína ha sido eficaz. En las fracciones elatadas se observan bandas de proteínas contaminantes menores. El análisis de gel SDS se utiliza para determinar qué fracciones deben agruparse antes del análisis seG. También se ejecuta un gel nativo de las partículas elucidas FhuA Bio-Peptidisc para confirmar la solubilidad de la FhuA(Figura Suplementaria 1). La migración de la proteína reconstituida al gel nativo indica solubilidad proteica en un entorno libre de detergente.
El análisis de la SEC se realiza para evaluar la solubilidad de las partículas de peptidisco. El cromatograma presentado en la Figura 3A muestra un solo pico simétrico que se eluye a unos 14 ml (6 ml más allá del volumen vacío de 8,0 ml en la columna S200 10/300 de filtración de gel). La posición de este pico, más allá del volumen vacío, confirma la solubilidad de las partículas FhuA Bio-Peptidisc. Como referencia, la Figura 3B ilustra una preparación teórica de peptidisco subóptimo. En este caso, el cromatograma muestra un pico de proteína más grande eludiendo en el volumen vacío, lo que indica la presencia de agregados proteicos. El pico más pequeño que eluyó justo después del pico principal de peptidisc corresponde al exceso de péptidos de peptidisc.
La interacción de FhuA con el analito ColM se determina después de la fijación de los peptidiscs a los sensores recubiertos de estreptavidina. Las puntas del sensor se equilibran primero en el búfer cinético, luego se transfieren al tampón que contiene los FhuA Bio-Peptidiscs. La concentración de los Bio-Peptidiscs FhuA y el tiempo durante el cual se incuban con la punta se optimiza antes de este experimento(Figura Suplementaria 1). Siguiendo los pasos de carga y lavado, el paso de asociación mide las interacciones entre las puntas cargadas y cuatro concentraciones diferentes de colicina M. El movimiento posterior de las puntas de nuevo en el tampón da como resultado una disociación, que se mide por el desplazamiento de longitud de onda de la luz blanca que se refleja en la punta.
La Figura 4A muestra la salida del sensorgrama de datos sin procesar de este experimento. Todos los seguimientos aparecen uniformes en los pasos de carga y línea base, aparte del seguimiento de referencia en amarillo. La punta de referencia no tiene ligando cargado, pero se expone al analito para el ensayo para la unión inespecífica, que es un control negativo importante. Para un análisis más detallado de los resultados, la señal de la punta de referencia se resta de las trazas para que las puntas experimentales tenga en cuenta el enlace inespecífico. Los datos se alinean con el inicio del paso de asociación para permitir una comparación visual directa, como se muestra en la Figura 4B. Esta comparación muestra un aumento en el cambio de longitud de onda para aumentar las concentraciones de colicina M. La curva se ajusta a los datos y exhibe un modelo de encuadernación clásico 1:1.
La gráfica de vista residual(Figura 4B,inferior), que describe las diferencias entre los datos de conexión y los datos experimentales, muestra que el ajuste para la concentración más alta de ColM (28 nM) es deficiente en comparación con las tres concentraciones inferiores. El perfil de la curva en sí carece de la meseta de la curva de unión, que es característica de la saturación del sitio de unión en un experimento de encuadernación típico. La falta de meseta sugiere unión heterogénea, que es probablemente un artefacto de la alta concentración de ColM. Por lo tanto, esta concentración más alta de ColM se descuenta del análisis y las otras tres concentraciones se utilizan para determinar la constante de disociación(Figura 4C,D). La prueba tde un estudiante de dos colas, a un nivel de confianza del 95%, encontró que la constante de disociación observada de este experimento no es significativamente diferente de los valores obtenidos utilizando diferentes técnicas(Figura 4E)16.
Figura 1: Visión general del flujo de trabajo de PeptiQuick mediante Bio-Peptidiscs y análisis BLI. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Análisis de gel SDS (12%) de las fracciones de inicio, flujo, lavado y elución recogidas a través del flujo de trabajo de PeptiQuick. Alrededor de 10 l de muestra se cargaron en cada carril y se ejecutaron durante 30 minutos a una corriente constante de 60 mA. El gel se tiñó con Azul Coomassie, se destituyó y se visualizó en un escáner de gel. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Perfiles SEC experimentales y teóricos que representan reconstituciones óptimas y subóptimas, respectivamente. (A) Perfil EXPERIMENTAL SEC de PeptiQuick reconstituido FhuA (82 kDa) en Bio-Peptidiscs. Las fracciones de elución IMAC F3-F7 se agruparon y concentraron utilizando un concentrador centrífugo de corte de 30 kDa a 1 ml. Esta muestra concentrada se inyectó a 0,25 ml/min en una columna de filtración de gel S200 (10/300) en tampón TSG. (B) Perfil SEC teórico de una reconstitución PeptiQuick subóptima. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Investigación de las interacciones de ColM con FhuA reconstituida en Bio-Peptidiscs. (A) Sensor de datos sin procesar con traza de sensor de referencia en amarillo. (B,C) Parte superior: pasos de asociación y disociación con ajuste parcial de la curva de unión 1:1. Inferior: vistas residuales que representan la diferencia entre los datos experimentales y el ajuste computacional. (C) Replotting de (B) con exclusión de la mayor concentración de ColM. (D) Tasas de asociación y disociación observadas (kon y koff, respectivamente) y las constantes de disociación (Kd). (E) Comparación de las constantes de disociación FhuA-ColM obtenidas por peptidisc y BLI (en este experimento), peptidisc y termoforesis a microescala (Saville, datos no publicados), y nanodisco y calorimetría de valoración isotérmica16. Las barras de error representan un SD de incertidumbre, mientras que n.s. no denota ninguna diferencia significativa en el nivel de confianza del 95%. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Medios M9 (por litro) |
| 200 ml de sal M9 |
| 800 mL dH2O |
| 10 mL 40% Glucosa |
| 80 l 1 M CaCl2 |
| 2,5 mL 1 M MgSO4 |
| 300 l 15 mg/ml tiamina |
| TSG Buffer |
| 50 mM Tris-HCl, pH 7,8 |
| 50 mM NaCl |
| 10% Glicerol |
| Búfer de lavado IMAC |
| 50 mM Tris-HCl, pH 7,8 |
| 50 mM NaCl |
| 10% glicerol |
| 0.04% LDAO |
| 5 mM de imidazol |
| Solución Bio-Peptidisc |
| Disolver el Bio-Peptidisc listo para usar (>95% pureza) en dH2O estéril. La concentración y el volumen de la solución de péptido depende del paso en el proceso de reconstitución. |
| 50 mM Tris-HCl, pH 7,8 |
| 50 mM NaCl |
| NOTA: Este stock de péptidos Bio-Peptidisc es estable a 4oC durante más de un mes. |
| Búfer de elución IMAC |
| 50 mM Tris-HCl, pH 7,8 |
| 50 mM NaCl |
| 10% Glicerol |
| 600 mM Imidazol |
| Búfer de cinética |
| 50 mM Tris-HCl, pH 7,8 |
| 50 mM NaCl |
| 0.002% Tween-20 |
| 0.1% BSA |
Tabla 1: Recetas para la preparación de medios y soluciones.
Figura suplementaria 1: 4%–16% análisis de gel nativo claro de las fracciones de elución recogidas del flujo de trabajo de PeptiQuick. Alrededor de 10 l de muestra se cargaron en cada carril y se ejecutaron durante 40 minutos a una corriente constante de 30 mA. El gel fue teñido con Azul Coomassie, destirlo y visualizarse en un escáner. Haga clic aquí para descargar esta figura.
Figura suplementaria 2: Optimización de la concentración de ligando sin un solo pin. (A) Las seis concentraciones diferentes de FhuA en Bio-Peptidisc probaron la unión a un solo pasador recubierto de estreptavidina. Esto se estableció en una placa de 96 pocillos con tampón en los pozos entre las concentraciones de ligando (consulte Archivo suplementario 1 para el protocolo de configuración). (B) Sensor de datos sin procesar para el experimento de optimización de ligandos. El pasador da la respuesta más grande y además alcanza la saturación en el número de concentración 4 (o 2,5 g/ml). Haga clic aquí para descargar esta figura.
Archivo Suplementario 1. Haga clic aquí para ver este archivo (haga clic con el botón derecho para descargar).
Discussion
Si bien los detergentes siguen siendo el método más sencillo para extraer y purificar proteínas de membrana, estos tensioactivos pueden tener muchos efectos no deseados sobre la estabilidad, función y análisis posteriores a las proteínas1,2,3, 4,5,6,7,8,9. Estas dificultades han motivado el desarrollo de miméticos de membrana, que se esfuerzan por minimizar la presencia de detergentes y replicar el entorno de membrana nativa tanto como sea posible2,3,4 ,5,6. La mayoría de los métodos de reconstitución, sin embargo, requieren una optimización significativa de las condiciones de reconstitución y a menudo requieren pasos de purificación adicionales, que disminuyen el rendimiento final7,8. El peptidisc se adapta espontáneamente a la proteína de membrana objetivo y comparativamente, requiere poca optimización y purificación aguas abajo9,10. En este protocolo, PeptiQuick se presenta como un medio simple para agilizar el protocolo de reconstitución para el análisis de interacción proteína-proteína aguas abajo.
Aunque son sencillos, hay varias advertencias experimentales que pueden conducir a una reconstitución sin éxito. Entre ellos, el más común se debe a la agregación de proteínas. Por lo tanto, es fundamental realizar cromatografía de exclusión de tamaño para monitorear el proceso de reconstitución. Por ejemplo, un pico de exclusión de tamaño que elude en el volumen vacío es indicativo de agregados proteicos(Figura 3B)17,18. Los agregados de proteína sómis se forman típicamente al exponerse prolongadamente a condiciones de detergente subóptimas antes de la reconstitución. En particular, se ha encontrado que las proteínas de membrana en detergente tienden a formar agregados cuando se concentran por ultrafiltración en dispositivos centrífugos. En este caso, las proteínas de membrana sensibles pueden concentrarse utilizando ultrafiltración al vacío, un método de concentración más suave y homogéneo, ya que la adsorción de proteínas al filtro disminuye.
En general, para evitar la concentración de proteínas, las fracciones IMAC eluted deben agruparse, y se debe inyectar una alícuota en una columna de exclusión de tamaño para comprobar su calidad de reconstitución. Cabe señalar que elutes péptido libre no incorporado justo después del pico principal de peptidisco(Figura 3B). El andamio libre no necesariamente impide los experimentos aguas abajo. Sin embargo, si es necesario, este exceso se puede eliminar mediante la cromatografía de exclusión de tamaño. Alternativamente, aumentar el volumen de lavado durante la reconstitución, y antes de la elución de la resina IMAC, es suficiente para eliminar eficazmente la mayor parte del péptido peptidisc libre. Por lo tanto, la cromatografía de exclusión de tamaño se recomienda como un medio rápido y simple para comprobar la calidad de la reconstitución.
El experimento BLI requiere una optimización cuidadosa de las concentraciones de ligando y analito. La unión de ligando debe ser suficiente para obtener una señal clara, pero la sobrecarga causará saturación de la señal, lo que resulta en artefactos de datos del hacinamiento y el obstáculo esterico en la superficie de la punta. Por lo tanto, tanto la concentración del ligando como el tiempo que la punta pasa en la solución de ligando debe optimizarse para cada muestra de proteína(Figura suplementaria 2). También debe optimizarse la concentración de analito. Si se conoce la constante de disociación, este paso se vuelve más fácil, ya que el rango de concentración se puede aproximar. Un buen punto de partida para este análisis es el uso de concentraciones de proteínas entre 0,1 y 20 veces el Kd19esperado.
Después de la adquisición de datos BLI, se debe realizar un análisis cuidadoso de los datos para evitar una interpretación errónea. El cálculo de la constante de disociación depende del ajuste de una curva de unión. A menos que ya se conozca la estequiometría de unión, se debe utilizar un modelo clásico de interacción bimolecular 1:1 para el ajuste inicial. Cabe señalar que una curva de unión heterogénea es a menudo el resultado de artefactos y comportamientos no ideales causados por una alta concentración de analitos, que pueden ser malinterpretados como un modelo de unión complejo. Por lo tanto, reducir la concentración de analito hasta que el perfil del sensorgrama muestre estequiometría de unión 1:1 puede ayudar a diferenciar la unión heterogénea de las interacciones más complejas. A continuación, se descuentan los datos de enlace heterogéneos residuales, como se muestra en la figura 420.
En este informe, se mide una constante de disociación de 2,28 a 0,74 nM para la interacción FhuA-ColM. Este valor es coherente con la constante de disociación previamente determinada en nuestro grupo con nanodisco o peptidisc utilizando ITC o MST, respectivamente(Figura 4E)16. Esta consistencia proporciona confianza sobre la reconstitución de peptidisc y el análisis BLI como un medio para determinar la cinética de interacción. Es importante señalar que las proteínas generalmente se inmovilizan en biosensores de estreptavidina, ya sea a través de la reticulación química de la biotina o la adición específica del sitio utilizando la ligadaa de biotina De E. coli BirA21. Evidentemente, biotinylating the peptidisc scaffold, en lugar de la proteína de membrana objetivo, tiene muchas ventajas. La biotinylación con andamios ahorra tiempo y minimiza el potencial de interrumpir sitios importantes de unión a proteínas. También hemos encontrado que PeptiQuick es aplicable a una amplia gama de clases de diana sóteca, incluyendo receptores acoplados a proteínas G (GPCRs), canales iónicos y proteínas de membrana de barriles. En general, cabe señalar que el extracto inicial de detergente de proteínas de membrana en un estado libre de agregados es crítico, y que la reconstitución inmediata en peptidisc disminuye los problemas de agregación aguas abajo. Dada la simplicidad, se prevé que PeptiQuick se extienda a otros ensayos de unión basados en estreptavidina, como resonancia de plasmón superficial (SPR), ensayos ELISA y extracciones de afinidad utilizando cuentas de estreptavidina.
Disclosures
FD es fundador de Peptidisc Biotech para distribuir péptidos de peptidisc a la comunidad académica. Peptidisc Biotech también se asocia con empresas farmacéuticas y biotecnológicas industriales para implementar peptidisc en sus flujos de trabajo de descubrimiento. La publicación Open Access de este artículo fue patrocinada por FortéBio.
Acknowledgments
Agradecemos al Consejo de Investigación en Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá. JS tiene una beca CGS-M CIHR. LT fue apoyado por la Asociación de Formación doctoral de Biotecnología y Ciencias Biológicas financiada por el Consejo de Biotecnología y Ciencias Biológicas [referencia de becas de formación BB/M009122/1]. FD es un Presidente de Investigación de Nivel II en Canadá.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30 kDa cut-off centrifugal concentrator | Millipore Sigma | C7715 | - |
| Ampicillin | BioShop | 69-52-3 | Sodium Salt |
| Bio-Peptidisc Peptide | Peptidisc Biotech | https://peptidisc.com | - |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | 9048-46-8 | Lyophilized powder |
| CaCl2 | Fisher Chemical | 10035-04-8 | Certified ACS |
| EDTA | BioShop | 6381-92-6 | Biotechnology Grade |
| Ettan LC (AKTA) | Amersham Pharmacia Biotech | 18-1145-58 | - |
| Glucose | BioShop | 50-99-7 | Anhydrous, Reagent Grade |
| Glycerol | Fisher Chemical | 56-81-5 | Certified ACS |
| Imidazole | BioShop | 288-32-4 | Biotechnology Grade |
| Lauryldimethylamine oxide (LDAO) | Sigma | 101822204 | ~30% in H2O |
| MgSO4 | Fisher Chemical | 10034-99-8 | Certified ACS |
| Microfluidizer | Microfluidics | M-110L | Fit with F20Y 75µ diruption chamber |
| Ni-NTA Resin | Gold Biotechnology | H-320-50 | - |
| Non-binding 96well BLI Plate | Greiner Bio-one | 655076 | Microplate, PS, 96 well, F-Bottom (chimney well), Black, Fluotrac, Med. Binding |
| Octet Red96 | FortéBio | OCTET RED96E-GxP | Octet RED96e instrument, Octet CFR software, desktop computer, LC monitor, accessory kit, IQ/OQ kit, PQ Kits and one-year warranty |
| Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) | Sigma | P-7626 | - |
| Protein Assay Dye - Reagent Concentrate | Bio-Rad | 5000006 | Used in the bradford assay to determine protein concentration - 5x concentration |
| Sodium Chloride (NaCl) | BioShop | 7647-14-5 | Biotechnology Grade |
| Streptavidin (SA) Biosensors | ForteBio | 18-5019 | One tray of 96 biosensors coated with streptavidin for quantitation, screening, or kinetic applications. |
| Superdex S200 (300/10) | Amersham Pharmacia Biotech | 175175-01 | - |
| Thiamine | Merck | 69271 | - |
| Tris-HCl | BioShop | 77-86-1 | Reagent Grade |
| Triton X-100 | BioShop | 900998-1 | Biotechnology Grade |
| Tween-20 | BioShop | 56-40-6 | Reagent Grade |
| Ultra centrifuge | Beckman Coulter | 365668 | - |
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