Presentamos un método que combina la purificación y reconstitución de proteínas de membrana en peptidiscs en un solo paso cromatográfico. Los andamios biotinylados se utilizan para la unión directa de la superficie y la medición de interacciones proteína-ligand a través de la interferometría de biocapa.
Las proteínas de membrana, incluidos los transportadores, los canales y los receptores, constituyen casi una cuarta parte del proteoma celular y más de la mitad de los objetivos actuales de los fármacos. Sin embargo, una barrera importante para su caracterización y explotación en entornos académicos o industriales es que la mayoría de las estrategias de detección bioquímica, biofísica y de drogas requieren que estas proteínas estén en un estado soluble en agua. Nuestro laboratorio desarrolló recientemente el peptidisc, una membrana mimética que ofrece un enfoque “único para todos” para el problema de la solubilidad de proteínas de membrana. Presentamos aquí un protocolo simplificado que combina la purificación de proteínas y la reconstitución de peptidisc en un solo paso cromatográfico. Este flujo de trabajo, llamado PeptiQuick, permite eludir la diálisis y la incubación con perlas de poliestireno, lo que reduce en gran medida la exposición al detergente, la desnaturalización de proteínas y la pérdida de muestras. Cuando PeptiQuick se realiza con andamios biotinylados, la preparación se puede unir directamente a superficies recubiertas de estreptavidina. No hay necesidad de biotinylate o modificar la diana de la proteína de membrana. PeptiQuick se muestra aquí con el receptor de membrana FhuA y la colicina antimicrobiana M, utilizando interferometría biocapa para determinar la cinética precisa de su interacción. Se concluye que PeptiQuick es una forma conveniente de preparar y analizar las interacciones entre proteínas de membrana en un día en un entorno libre de detergente.
Las proteínas de membrana a menudo se excluyen de los programas de investigación de descubrimiento de fármacos o anticuerpos debido a la propensión de las proteínas de membrana a agregarse fuera del entorno de bicapa de lípidos, especialmente en presencia de detergentes1. Por lo tanto, en los últimos años, se han desarrollado varios miméticos de membrana (llamados andamios) para facilitar el aislamiento y el interrogatorio de proteínas de membrana en un entorno completamente libre de detergente (es decir, nanodiscos, SMALPs, anfípolos, etc.) 2,3,4,5,6. Sin embargo, la reconstitución de proteínas de membrana en estos miméticos a menudo requiere una optimización extensa, que es lenta y generalmente acompañada con la pérdida de recuperación de proteínas7,8. Para superar estas limitaciones, nuestro laboratorio recientemente desarrolló una formulación “única para todos” conocida como peptidisc9. El peptidisc se forma cuando varias copias de un péptido biheliático anfípata de 4,5 kDa de diseño se unen a la superficie hidrófoba de una proteína de membrana diana. La reconstitución estable en el peptidisco se produce al eliminar el detergente, atrapando tanto los lípidos endógenos como las proteínas de membrana solubilizadas en partículas solubles en agua. Estas partículas estabilizadas ahora son susceptibles para numerosas aplicaciones posteriores.
El método peptidisc ofrece varias ventajas; por ejemplo, la reconstitución es sencilla, ya que la unión del andamio peptidisc en el objetivo se guía por la propia plantilla de proteína9,10. La estequiometría de péptidos también es autodeterminada, y la adición de lípidos exógenos no es necesaria. La formación de peptidisco se produce mediante una simple dilución de detergente, una ventaja importante sobre la diálisis o la adsorción de perlas de poliestireno, que a menudo dan lugar a un bajo rendimiento proteico debido a la asociación superficial no específica y la agregación11,12 ,13. El conjunto final de peptidisc es altamente termoestable e invariablemente soluble en diferentes tampones o en presencia de cationes divalentes (por ejemplo, Ni2+). La pureza y homogeneidad estructural del andamio también es alta (por ejemplo, libre de endotoxinas), y el péptido se puede personalizar con grupos funcionales colocados en diferentes posiciones.
Presentamos aquí un flujo de trabajo de laboratorio llamado PeptiQuick, también conocido como reconstitución de perlas9. Este protocolo combina la purificación de proteínas de membrana y la reconstitución de peptidisco en un solo paso y en el mismo soporte cromatográfico. Como su nombre indica, PeptiQuick es rápido en comparación con otros métodos de reconstitución, y también reduce seriamente el tiempo de exposición al detergente. Los efectos negativos del detergente, como el desplegado de proteínas y la agregación, a menudo se producen de una manera dependiente del tiempo; por lo tanto, minimizar la exposición al detergente es fundamental para mantener la conformación de proteínas nativas14,15. Esto es crucial para la precisión de los métodos que informan sobre las interacciones proteicas y las afinidades de unión de ligandos.
Durante el desarrollo de este protocolo, presentamos la novedosa versión biotinilada del andamio peptidisc, denominado Bio-Peptidisc. Los grupos funcionales de biotina permiten la unión de la proteína de membrana diana en superficies recubiertas de estreptavidina. Dado que el etiquetado de la biotina se limita al andamio, los sitios de unión en la proteína de membrana objetivo permanecen inalterados. Utilizando Bio-Peptidisc, se determina la cinética de unión del receptor de membrana bacteriana FhuA y la colicina péptido antimicrobiana M (ColM)16. Esta afinidad se mide a través de la interferometría de biocapa (BLI), que analiza las interacciones en tiempo real basadas en patrones de interferencia de luz blanca reflejados desde una punta del sensor.
Mediante el uso de este protocolo, se elimina la necesidad de detergente durante el análisis de BLI, que es un desarrollo importante, ya que los detergentes pueden interrumpir las interacciones. Las afinidades de unión se pueden medir rápidamente con este método, y los resultados son comparables a los reportados anteriormente utilizando nanodiscos y calorimetría de valoración isotérmica (ITC)16. Se muestran y discuten los pasos críticos en el flujo de trabajo de PeptiQuick, como la preparación de proteínas, la dilución de detergentes, la adición de péptidos y la reconstitución, junto con consejos para solucionar los ligandos y la unión de analitos en el ensayo BLI. Usando el flujo de trabajo de PeptiQuick, se encuentra que las proteínas de membrana se pueden capturar en peptidiscs y sus interacciones medidas dentro de un día.
Si bien los detergentes siguen siendo el método más sencillo para extraer y purificar proteínas de membrana, estos tensioactivos pueden tener muchos efectos no deseados sobre la estabilidad, función y análisis posteriores a las proteínas1,2,3, 4,5,6,7,8,9. Estas dificultades han motivado el desarrollo de miméticos de membrana, que se esfuerzan por minimizar la presencia de detergentes y replicar el entorno de membrana nativa tanto como sea posible2,3,4 ,5,6. La mayoría de los métodos de reconstitución, sin embargo, requieren una optimización significativa de las condiciones de reconstitución y a menudo requieren pasos de purificación adicionales, que disminuyen el rendimiento final7,8. El peptidisc se adapta espontáneamente a la proteína de membrana objetivo y comparativamente, requiere poca optimización y purificación aguas abajo9,10. En este protocolo, PeptiQuick se presenta como un medio simple para agilizar el protocolo de reconstitución para el análisis de interacción proteína-proteína aguas abajo.
Aunque son sencillos, hay varias advertencias experimentales que pueden conducir a una reconstitución sin éxito. Entre ellos, el más común se debe a la agregación de proteínas. Por lo tanto, es fundamental realizar cromatografía de exclusión de tamaño para monitorear el proceso de reconstitución. Por ejemplo, un pico de exclusión de tamaño que elude en el volumen vacío es indicativo de agregados proteicos(Figura 3B)17,18. Los agregados de proteína sómis se forman típicamente al exponerse prolongadamente a condiciones de detergente subóptimas antes de la reconstitución. En particular, se ha encontrado que las proteínas de membrana en detergente tienden a formar agregados cuando se concentran por ultrafiltración en dispositivos centrífugos. En este caso, las proteínas de membrana sensibles pueden concentrarse utilizando ultrafiltración al vacío, un método de concentración más suave y homogéneo, ya que la adsorción de proteínas al filtro disminuye.
En general, para evitar la concentración de proteínas, las fracciones IMAC eluted deben agruparse, y se debe inyectar una alícuota en una columna de exclusión de tamaño para comprobar su calidad de reconstitución. Cabe señalar que elutes péptido libre no incorporado justo después del pico principal de peptidisco(Figura 3B). El andamio libre no necesariamente impide los experimentos aguas abajo. Sin embargo, si es necesario, este exceso se puede eliminar mediante la cromatografía de exclusión de tamaño. Alternativamente, aumentar el volumen de lavado durante la reconstitución, y antes de la elución de la resina IMAC, es suficiente para eliminar eficazmente la mayor parte del péptido peptidisc libre. Por lo tanto, la cromatografía de exclusión de tamaño se recomienda como un medio rápido y simple para comprobar la calidad de la reconstitución.
El experimento BLI requiere una optimización cuidadosa de las concentraciones de ligando y analito. La unión de ligando debe ser suficiente para obtener una señal clara, pero la sobrecarga causará saturación de la señal, lo que resulta en artefactos de datos del hacinamiento y el obstáculo esterico en la superficie de la punta. Por lo tanto, tanto la concentración del ligando como el tiempo que la punta pasa en la solución de ligando debe optimizarse para cada muestra de proteína(Figura suplementaria 2). También debe optimizarse la concentración de analito. Si se conoce la constante de disociación, este paso se vuelve más fácil, ya que el rango de concentración se puede aproximar. Un buen punto de partida para este análisis es el uso de concentraciones de proteínas entre 0,1 y 20 veces el Kd19esperado.
Después de la adquisición de datos BLI, se debe realizar un análisis cuidadoso de los datos para evitar una interpretación errónea. El cálculo de la constante de disociación depende del ajuste de una curva de unión. A menos que ya se conozca la estequiometría de unión, se debe utilizar un modelo clásico de interacción bimolecular 1:1 para el ajuste inicial. Cabe señalar que una curva de unión heterogénea es a menudo el resultado de artefactos y comportamientos no ideales causados por una alta concentración de analitos, que pueden ser malinterpretados como un modelo de unión complejo. Por lo tanto, reducir la concentración de analito hasta que el perfil del sensorgrama muestre estequiometría de unión 1:1 puede ayudar a diferenciar la unión heterogénea de las interacciones más complejas. A continuación, se descuentan los datos de enlace heterogéneos residuales, como se muestra en la figura 420.
En este informe, se mide una constante de disociación de 2,28 a 0,74 nM para la interacción FhuA-ColM. Este valor es coherente con la constante de disociación previamente determinada en nuestro grupo con nanodisco o peptidisc utilizando ITC o MST, respectivamente(Figura 4E)16. Esta consistencia proporciona confianza sobre la reconstitución de peptidisc y el análisis BLI como un medio para determinar la cinética de interacción. Es importante señalar que las proteínas generalmente se inmovilizan en biosensores de estreptavidina, ya sea a través de la reticulación química de la biotina o la adición específica del sitio utilizando la ligadaa de biotina De E. coli BirA21. Evidentemente, biotinylating the peptidisc scaffold, en lugar de la proteína de membrana objetivo, tiene muchas ventajas. La biotinylación con andamios ahorra tiempo y minimiza el potencial de interrumpir sitios importantes de unión a proteínas. También hemos encontrado que PeptiQuick es aplicable a una amplia gama de clases de diana sóteca, incluyendo receptores acoplados a proteínas G (GPCRs), canales iónicos y proteínas de membrana de barriles. En general, cabe señalar que el extracto inicial de detergente de proteínas de membrana en un estado libre de agregados es crítico, y que la reconstitución inmediata en peptidisc disminuye los problemas de agregación aguas abajo. Dada la simplicidad, se prevé que PeptiQuick se extienda a otros ensayos de unión basados en estreptavidina, como resonancia de plasmón superficial (SPR), ensayos ELISA y extracciones de afinidad utilizando cuentas de estreptavidina.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos al Consejo de Investigación en Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá. JS tiene una beca CGS-M CIHR. LT fue apoyado por la Asociación de Formación doctoral de Biotecnología y Ciencias Biológicas financiada por el Consejo de Biotecnología y Ciencias Biológicas [referencia de becas de formación BB/M009122/1]. FD es un Presidente de Investigación de Nivel II en Canadá.
30 kDa cut-off centrifugal concentrator | Millipore Sigma | C7715 | – |
Ampicillin | BioShop | 69-52-3 | Sodium Salt |
Bio-Peptidisc Peptide | Peptidisc Biotech | https://peptidisc.com | – |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | 9048-46-8 | Lyophilized powder |
CaCl2 | Fisher Chemical | 10035-04-8 | Certified ACS |
EDTA | BioShop | 6381-92-6 | Biotechnology Grade |
Ettan LC (AKTA) | Amersham Pharmacia Biotech | 18-1145-58 | – |
Glucose | BioShop | 50-99-7 | Anhydrous, Reagent Grade |
Glycerol | Fisher Chemical | 56-81-5 | Certified ACS |
Imidazole | BioShop | 288-32-4 | Biotechnology Grade |
Lauryldimethylamine oxide (LDAO) | Sigma | 101822204 | ~30% in H2O |
MgSO4 | Fisher Chemical | 10034-99-8 | Certified ACS |
Microfluidizer | Microfluidics | M-110L | Fit with F20Y 75µ diruption chamber |
Ni-NTA Resin | Gold Biotechnology | H-320-50 | – |
Non-binding 96well BLI Plate | Greiner Bio-one | 655076 | Microplate, PS, 96 well, F-Bottom (chimney well), Black, Fluotrac, Med. Binding |
Octet Red96 | FortéBio | OCTET RED96E-GxP | Octet RED96e instrument, Octet CFR software, desktop computer, LC monitor, accessory kit, IQ/OQ kit, PQ Kits and one-year warranty |
Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) | Sigma | P-7626 | – |
Protein Assay Dye – Reagent Concentrate | Bio-Rad | 5000006 | Used in the bradford assay to determine protein concentration – 5x concentration |
Sodium Chloride (NaCl) | BioShop | 7647-14-5 | Biotechnology Grade |
Streptavidin (SA) Biosensors | ForteBio | 18-5019 | One tray of 96 biosensors coated with streptavidin for quantitation, screening, or kinetic applications. |
Superdex S200 (300/10) | Amersham Pharmacia Biotech | 175175-01 | – |
Thiamine | Merck | 69271 | – |
Tris-HCl | BioShop | 77-86-1 | Reagent Grade |
Triton X-100 | BioShop | 900998-1 | Biotechnology Grade |
Tween-20 | BioShop | 56-40-6 | Reagent Grade |
Ultra centrifuge | Beckman Coulter | 365668 | – |