Summary
Et grundlæggende aspekt af vurderingen af dyrs velfærd i fangenskab er at spørge, om dyrene har, hvad de ønsker. Her præsenterer vi en protokol til bestemmelse af boligpræference i zebrafisken (Danio rerio) med hensyn til tilstedeværelsen/fraværet af miljøberigelse og adgang til vandstrømmene.
Abstract
Teknikker til vurdering af dyrevelfærd forsøger at tage hensyn til det pågældende dyrs særlige behov og ønsker. Berigelse (tilsætning af fysiske genstande eller konspecificeringer i boligmiljøet) er ofte en måde at give dyr i fangenskab mulighed for at vælge, hvem eller hvad de interagerer med, og hvordan de bruger deres tid. En grundlæggende del af vandmiljøet, der ofte overses i fangenskab, er imidlertid dyrets evne til at vælge at deltage i motion. For mange dyr, herunder fisk, motion er et vigtigt aspekt af deres livshistorie, og er kendt for at have mange sundhedsmæssige fordele, herunder positive ændringer i hjernen og adfærd. Her præsenterer vi en metode til vurdering af habitatpræferencer hos dyr i fangenskab. Protokollen kunne let tilpasses for at se på en række miljømæssige faktorer (f.eks. grus versus sand som substrat, plastplanter versus levende planter, lav strøm i forhold til høj vandstrøm) i forskellige akvatiske arter eller til brug med terrestriske arter. Statistisk vurdering af præference udføres ved hjælp af Jacobs præferenceindeks, som rangerer levestederne fra -1 (undgåelse) til +1 (mest foretrukne). Med disse oplysninger, kan det bestemmes, hvad dyret ønsker fra et velfærdsperspektiv, herunder deres foretrukne placering.
Introduction
Reglerne for, hvordan laboratoriedyr skal anbringes i fangenskab, er eksplicitte og veldefinerede. Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC) International fører tilsyn med og forvalter alle organisationer og institutioner, der arbejder med forskningsdyr og har specifikke retningslinjer for arters passende opdræt og boliger. For eksempel, AAALAC's vejledning om boliger og pleje af zebrafisk, Danio Rerio1 "kraftigt tilskynder" brugen af berigelse (tilsætning af fysiske genstande eller konspecificeringer i boligmiljøet), når der huser zebrafisk i fangenskab. Guiden fortsætter med at angive, "Forudsat kunstige planter eller strukturer, der efterligner zebrafisk habitat tillader dyr et valg i deres miljø."
Tyder på, at berigelse kan stimulere væksten af nye neuroner (neurogenese) i områder af hjernen er involveret i behandling af rumlige oplysninger2,og det menes, at disse neurale ændringer er forbundet med øget indlæringsevne3. Virkningerne af berigelse på neurogenese og læring er blevet bredt undersøgt på tværsaf forskellige taxa, herunder fisk4,5,fugle6,krybdyr 7 , og pattedyr8. Selv om disse typer af undersøgelser er vigtige for at forstå virkningerne af berigelse på hjernen og adfærd, de ikke tager hensyn til de særlige valg eller præferencer dyr til et bestemt miljø frem for en anden.
Et grundlæggende spørgsmål, der skal stilles ved vurderingen af de dyrs velfærd i fangenskab, er, om dyrene hardet,de ønsker 9 . En måde at undersøge dette spørgsmål, der giver håndgribelige beviser er at give dyr med valg, der giver os mulighed for at forstå deres subjektive præferencer. F.eks. har to undersøgelser undersøgt, om zebrafisk foretrækker adgang til enten et beriget eller et almindeligt miljø, idet begge undersøgelser viser, at der er præference for områder, der indeholder berigelse10,11. Det er imidlertid også blevet antydet, at zebrafisk synes ligeglad med miljøberigelse12, så svaret på spørgsmålet er naturligvis ikke klart. En anden anvendelse af præferencetest i forbindelse med dyrevelfærd omfatter også forsøg på at forstå, hvordan forskellige aspekter af et beriget miljø spiller en rolle i de valg, et enkelt dyr træffer. I fisk alene, forskellige typer af berigelse har forskellige virkninger på hjernen og adfærd, og dette forhold kompliceres yderligere af individuelle forskelle i personlighedstræk13. Desuden kan præferencetest være nyttig til sammenlignende undersøgelser af miljøberigelse. Selv på tværs af forskellige fiskearter, berigelse har vist sig at have en effekt på mange forskellige typer af adfærd, herunder aggression14, dristighed15,bevægelse16,og risikovillighed adfærd17.
Jacobs præferenceindeks er en statistisk test, der bruges hyppigt til at kvantificere boligpræferencer18. Jacobs præferenceindeks tildeler hver enkelt levested en værdi baseret på antallet af dyr, der findes i hver naturtype på forskellige tidspunkter, hvor præferencevarierer fra -1 (undgåelse) til +1 (mest foretrukket). Her beskriver vi en metode til at bruge Jacobs præferenceindeks til at undersøge boligpræferencer i fisk og bruge eksemplet med at vurdere to vigtige karakteristika ved vandmiljøet: 1) tilstedeværelsen eller fraværet af tilsætning; og 2) strømmen af vand19. Protokollen kan dog let tilpasses for at se på en række miljømæssige faktorer (f.eks. grus versus sand som substrat, plastplanter versus levende planter, lav mod høj vandgennemstrømning) på tværs af forskellige arter og landskaber (f.eks. vandog terrestrisk).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Den nuværende undersøgelse har godkendelse og opfylder alle krav i dyrepleje og brug protokoller pennsylvania State University; IACUC nr.
1. Opsætning af præferenceapparat
- Opnå godkendelse fra instituttets Animal Care Committee (eller tilsvarende organisation) for alle forsøgs- og opdrætsprocedurer, der involverer levende dyr, før forsøget indledes.
- Brug en eksperimentel tank lavet af uigennemsigtig hvid plast. Væggene mellem zonerne er lavet af grå akryl, der er fastgjort på plads med silicium fugemasse.
BEMÆRK: Forsøgstankens størrelse afhænger af størrelsen af de anvendte arter, og antallet af personer, der anvendes (f.eks. for 8 voksne zebrafisk, anbefales en tank på 76 cm L x 76 cm W x 30 cm H). - Opdel forsøgstanken i fire zoner, der varierer i overensstemmelse med de specifikke habitatparametre, der skal testes. Eksempler på forskellige typer af berigelse til at undersøge omfatter sandet vs stenet substrat, kunstige planter vs krisecentre, eller strøm af vand vs tilstedeværelsen af kunstige planter (Figur 1).
- Hvis du bruger strøm af vand som en parameter af interesse, skal du bruge små pumper til at levere vandstråler (se Materialetabel). Indstil pumperne med en valgt hastighed, så de giver en konstant og styret strøm af vand. Vælg den ønskede hastighed baseret på artsafinteresseens økologi og livshistorie (f.eks. 14 cm/s for zebrafisk).
- I midten af forsøgstanken har du en central arena, hvor der leveres mad (figur 1). Adgang til den centrale arena fra hver zone er gennem en lille åbning i de adskilte vægge. Åbningen er stor nok til, at de arter af interesse kan bevæge sig uhindret mellem zonerne, men lille nok til at reducere eventuelle visuelle signaler, som fiskene kan opleve fra andre zoner.
- Placer et biofilter og et varmeanlæg i hvert hjørne af tanken, men uden for forsøgsområdet for ikke at forstyrre vandstrømmen og sikre en konstant vandtemperatur på tværs af alle zoner.
- Opsæt yderligere eksperimentelle tanke, som rummet dikterer. Roter de forskellige zoner i hver forsøgstank for at begrænse enhver sekventiel bias. Sørg for, at alle replikattanke har ensartede forhold (samme lysniveau, vandtemperatur osv.)
- Placer kameraer (se Tabel over materialer)på stativer direkte over hver forsøgstank, så alle zoner er synlige. Undgå vidvinkelobjektiver, og sørg for, at hukommelseskortene har tilstrækkelig plads til optagelse.
- Indstil rumbelysningen på en gradvis (f.eks. 1/2 h) 12 L: 12 D-cyklus for at simulere solopgang og solnedgang. Vandtemperaturen holdes ved 25 ± 1 °C.
2. Opsamling, akklimatisering og procedure
- Hold fisk i hjem tanke, når de ikke bliver testet. Net alle test fisk fra deres hjem tanke og sted i midten arena af den eksperimentelle tank (Dag 1). Minimer optagetider for at reducere stress (f.eks. mindre end 30 s).
BEMÆRK: En alternativ procedure til overførsel af fisk fra deres hjem tank til forsøgstanken, der kan minimere stress er at transportere fisken i et bægerglas af tank vand. - Hold antallet og kønnet på fisken i hver forsøgstank konstant på tværs af replikattanke og vælg baseret på artens størrelse og økologi.
- På dag 1-4 bruger fisk tid på at akklimatisere og udforske de forskellige zoner. Du må ikke indsamle data på disse dage.
BEMÆRK: Forlænge eller reducere antallet af dage for akklimatisering afhængigt af den pågældende forsøgsprotokol. Akklimatiseringsperioden bør dog være tilstrækkelig til at minimere virkningerne af håndtering en og til at få fisken vant til at fodre i apparatet. - I akklimatiseringsperioden skal vandkvaliteten overvåges nøje ved at gennemføre regelmæssige vandkvalitetstest (f.eks. pH-, nitrat- eller nitritniveauer) og erstatte vandet, hvis der opdages problemer (se Materialetabel).
- Fodre fiskeflage mad (se Tabel over materialer)i den centrale arena ved hjælp af en flydende mad ring (se Tabel over materialer)fastgjort til væggen i den centrale arena på vandets overflade. En fødevarering sikrer, at madpartikler forbliver i den centrale arena og ikke udgør en bias for zoner på grund af fødedrift.
- Giv fisken 0,5 timer til at fodre ad libitum, før du fjerner rester mad fra den eksperimentelle tank med en dip net. Fodre fiskene en gang om morgenen og en gang om eftermiddagen.
- Vurder adfærd på dag 5-7. Tænd kameraer på og registrere fisk adfærd i 2 timer efter hver planlagt morgen og eftermiddag fodring. På dag 8 fjerne alle fisk fra de eksperimentelle tanke med en dip net og læg dem tilbage i deres hjem tanke.
- Afhængigt af hvor meget sump vand er til rådighed, erstatte mindst en 1 / 3 af vandet i forsøgstanken med frisk sump vand for at reducere eventuelle virkninger af stresshormoner på fisk i følgende replikater.
- Opstil forsøgstankene i overensstemmelse med zonerotationsplanen for den pågældende uge. Rotation af zoner ne mindsker risikoen for, at der opstår adfærdsbias som følge af placeringen af en zone i forhold til hinanden. Derefter begynde testprocessen igen med et nyt parti af fisk.
3. Målinger og dataanalyse
- Download videoerne til en computer i slutningen af hver optagedag. Dette sikrer, at der er plads på hukommelseskortet før hver brug.
- Brug videosoftware (se Materialetabel)til at kvantificere zonepræferencen. Manuelt tælle antallet af fisk i hver zone med 5 min mellemrum i hver 2 h optagelse periode (omfatter den centrale arena i disse tæller). Definer fiskenes køn under analysen, hvis det er muligt at skelne mellem mænd og kvinder fra videooptagelserne.
- Hvis du vil analysere habitatpræferencen, skal du beregne det gennemsnitlige antal fisk pr. zone for hver replikattank (dvs. gennemsnit alle data på tværs af de 3 dage). For at opnå en præferencescore for strukturbrug skal du beregne Jacobs' præferenceindeks15 som
J = (rx − p)/[(rx + p) – 2*rx*p]
hvor x er den interessezone, er rx forholdet mellem fisk i zone x og det samlede antal fisk i alle zoner, og p er den tilgængelige andel af alle zoner i forsøgstanken. Indekset varierer mellem +1 for maksimal præference og −1 for maksimal undgåelse. - For at afgøre, om der er ændringer i den hastighed, hvormed fisk skifter mellem zoner i en observationsperiode, skal du beregne switch-hastigheden, rsr, i den første og sidste 5 min i hver observationsperiode, hvor derer tale om det antal gange, en fisk kommer ind i hver zone fra den centrale arena, divideret med det samlede antal fisk.
- Overvej en fisk at have indgået i en zone, når fiskens hele kroppen krydser gennem åbningen adskiller zonerne. Beregn en start- og efterbehandlingstaetswitchrate for hver replikattank. Udfør alle adfærdsmæssige observationer af den samme eksperimentator for at reducere enhver eksperimentator observation bias.
- Brug af statistisk software (se Materialetabel),foretage relevante statistiske analyser. Foreslåede analyser omfatter en envejs ANOVA med præferenceindeks som den afhængige variabel og zone som prædiktorvariabel og en parret t-test på start- og efterbehandlingsmiddelswitchen for hver tank.
- Anvende Tukey's mange sammenligning efter hoc-test for yderligere at undersøge zonesammenligninger, hvor hver zone sammenlignes med hinanden. Mere kompleks statistisk analyse omfatter blandede modeller, der vurderer tidseffekter, arena effekter, sex effekter, eller endda individuelle forskelle i adfærd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi brugte præferencetesten til at undersøge boligpræferencer i zebrafisk givet et valg mellem varierende berigelse, herunder 1) plastplanter og sandet substrat; og 2) vandgennemstrømning. Disse blev opdelt i fire zoner: i) Beriget Kun; ii) Kun flow iii) Beriget og flow iv) Almindelig og en central arena, hvor maden blev leveret19. Zebrafisk viste den højeste præference for enriched and Flow zone, som var væsentligt anderledes end alle andre zoner (Beriget Kun, Flow Only, Plain, og Central Arena; p < 0,01). Fisk undgået både Flow Only og Plain zoner, tilbringe mere tid i Central Arena19 (Figur 2A). Desuden flyttede zebrafisk oftere mellem forskellige habitatzoner ved observationsperiodens begyndelse end ved udgangen (figur 2B).
Figur 1: Eksempler på forskellige eksperimentelle design, der skal testes for habitatpræferencer. (A) Opsætning af en eksperimentel tank til at teste præferencen for en sandet versus en stenet substrat. (B) Opsætning af en forsøgstank til at teste præferencen for tilsætning (plastplanter) i forhold til et krisecenter. C) Opsætning af en forsøgstank for at teste præferencen for tilsætning (plastplanter) i forhold til en vandstrøm. I alle figurpaneler var de fire hjørnerum ikke tilgængelige for fisken og indeholdt kun varmestoffer og filtre. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Repræsentative data, der viser resultaterne af en habitatpræferencetest på zebrafisk. A) Jacobs' præferenceindeks for hver zone:i) Beriget ii) Beriget og flow iii) Kun flow iv) Almindelig og en neutral Central Arena. Positive og negative værdier angiver henholdsvis præference og undgåelse. Kasserne angiver det 25 ± 75. barer repræsenterer de tiende og 90. åbne prikker repræsenterer punkter uden for disse værdier. a = signifikant forskel fra alle zoner (p < 0,05) b = væsentligt forskellig fra Beriget og Flow, Beriget Only, og Central Arena(p < 0,05); ogb) kasseparder, der viser switch-hastigheden ved observationsperiodens begyndelse og slutning (kasser ne angiver det 25 ± 75. percentilområde og indeholder midterlinjen; stængerne repræsenterer de tiende og 90. percentilværdier). Figur 2A er blevet ændret fra DePasquale et al.19. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her præsenterer vi et eksperimentelt design, der giver os mulighed for at undersøge præferencer fisk til forskellige typer af levesteder. Nogle kritiske skridt, der er vigtige i præferencetest, omfatter: 1) at sikre, at ensartede forhold opretholdes på tværs af forskellige replikater (f.eks. eksterne lyde eller bevægelser, eksperimentator, vandkemi, lysniveauer); 2) at sikre, at zonerne roteres mellem replikater, og at en betydelig mængde vand erstattes med frisk sumpvand mellem test for at reducere skævheder 3) at sikre, at der anvendes en passende stikprøvestørrelse til at påvise væsentlige resultater, både med hensyn til antallet af personer i hver gruppe og antallet af replikattanke og 4) hvis forsøg optages, optimere og sikre korrekt videooptagelse og filoverførsel.
Ændringer af den nuværende protokol omfatter at udsætte fisk for en række andre naturtyper, såsom forskellige berigningselementer, forskellige substrater eller endda forskellige strømningshastigheder. Desuden kan det være muligt at bruge animalsk tracking software til yderligere at forstå, hvordan fiskene bruger rummet i hver zone (f.eks gøre fiskene bruger tid på at svømme mod strømmen af vand i strømmen zoner, eller gør de undgå den del af levestedet helt). Det kan dog være nødvendigt at ændre væggene i forsøgstanken for at imødekomme denne type sporingssoftware. Endelig kan den præferencetest, der er beskrevet her, tilpasses alle fiskearter eller potentielt enhver vandorganisme, som eksperimentatoren ønsker at undersøge.
En begrænsning af den nuværende protokol er, at præferencetest begrænses af de ressourcer, der præsenteres for dyrene. Derfor kan dyret ikke vælge et foretrukket valg, men den mindst ubehagelige af dem, der præsenteres20. Det kan dog være, at det at have et valg i første omgang er bedre for velfærdend kun at få begrænsede muligheder (dvs. adgang til de mest foretrukne levesteder alene). Det er også blevet foreslået, at zebrafisk finde lys baggrunde aversive23, og dermed en alternativ tank farve (f.eks sort) kan være mere egnet. Desuden er præferencetest ofte begrænset til observationer foretaget i et lille tidsrum, hvor det pågældende dyr kan handle på umiddelbare signaler i stedet for fremtidige behov21,22. Desuden er køn, gruppestørrelse og social kontekst faktorer, der påvirker gruppens dynamik og derfor potentielt habitatpræferencer hos fisk, så det er vigtigt at forsøge at holde disse faktorer ensartede på tværs af replikater.
Med vores repræsentative resultater viste vi, at zebrafisk fortrinsvis vælger både Beriget og Flow og Berigede Kun zoner og undgår Flow Only og Plain Zones. Alt i alt blev berignings- og strømningszonen foretrukket i alle andre zoner. En præference for berigede miljøer, navnlig den berigede zone og flowzonen, kan være resultatet af et øget behov for sensorisk stimulation (udforskning), eller det kan være nødvendigt at finde steder at skjule (reduceret konkurrence fra konspecificer). Interessant, der var en lille præference for Central Arena over Flow Only og Plain zoner, hvilket tyder på, at potentialet i fødevarer, der leveres var en højere motiverende faktor end svømning. Med hensyn til bevægelse mellem zonerne var der mere skift mellem zonerne i begyndelsen af observationsperioden end ved udgangen. Stigningen i bevægelse i begyndelsen af observationsperioden kan svare til tidspunktet for fodring (fisk blev fodret en halv time før optagelsen startede), således at de kan have været mere motiverede til at flytte og lede efter yderligere fødevarer. Sammenfattende er den protokol, der er beskrevet i den aktuelle undersøgelse, et effektivt redskab til at se på habitatpræferencer hos fisk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af en Research Collaboration Fellowship og Huck Institute på The Pennsylvania State University, samt USDA AES 4558. Forskningen opfyldte alle krav i dyrepleje og brug protokoller pennsylvania State University; IACUC nr.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Artificial Aquarium Plants | Smarlin | B07PDZQ5M5 | |
| Artificial Seaweed Water Plants for Aquarium | MyLifeUNIT | PT16L212 | |
| Experimental tanks | United State Plastic Corporation | 6106 | |
| Floating food ring | SunGrow | B07M6VWH9V | |
| Flow meter | YSI | BA1100 | |
| Jager Aquarium Thermostat Heater | Ehiem | 3619090 | |
| Master Water Quality Test Kit | API | 34 | |
| SPSS Statistics for Macintosh | IBM | Version 25.0 | |
| Submersible Pump, SL- | Songlong | SL-381 | |
| TetraMin Tropical Flakes | Tetra | 16106 | |
| Triple Flow Corner Biofilter | Lee's | 13405 | |
| Video camera | Coleman | TrekHD CVW16HD | |
| Windows Media Player (video software) | Microsoft | Windows Media Player 12 |
References
- Reed, B., Jennings, M. Guidance on the housing and care of zebrafish, Danio rerio. AAALAC International. , 36 (2010).
- van Praag, H., Kempermann, G., Gage, F. H. Neural consequences of environmental enrichment. Nature Reviews Neuroscience. 1, 191-198 (2000).
- Oomen, C. A., Berkinschtein, P., Kent, B. A., Sakisda, L. M., Bussey, T. J. Adult hippocampal neurogenesis and its role in cognition. Wiley Interdisciplinary Reviews - Cognitive Science. 5 (5), 573-587 (2014).
- DePasquale, C., Neuberger, T., Hirrlinger, A. M., Braithwaite, V. A. The influence of complex and threatening environments in early life on brain size and behaviour. Proceeedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 283 (1823), 1-8 (2016).
- Salvanes, A. G. V., et al. Environmental enrichment promotes neural plasticity and cognitive ability in fish. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 280, 1-7 (2013).
- Barnea, A., Pravosudov, V. V. Birds as a model to study adult neurogenesis: bridging evolutionary, comparative and neuroethological approaches. European Journal of Neuroscience. 34 (6), 884-907 (2011).
- LaDage, L. D., et al. Interaction between territoriality, spatial environment, and hippocampal neurogenesis in male side-blotched lizards. Behavioral Neuroscience. 127 (4), 555-565 (2013).
- Kempermann, G. Why New Neurons? Possible Functions for Adult Hippocampal Neurogenesis. Journal of Neuroscience. 22 (3), 635-638 (2002).
- Dawkins, M. S. Using behaviour to assess animal welfare. Animal Welfare. 13, 3-7 (2004).
- Kistler, C., Hegglin, D., Würbel, H., König, B. Preference for structured environment in zebrafish (Danio rerio) and checker barbs (Puntius oligolepis). Applied Animal Behaviour Science. 135, 318-327 (2011).
- Schroeder, P., Jones, S., Young, I. S., Sneddon, L. U. What do zebrafish want? Impact of social grouping, dominance and gender on preference for enrichment. Laboratory Animals. 48 (4), 328-337 (2014).
- Matthews, M., Trevarrow, B., Matthews, J. A virtual guide for zebrafish users. Lab Animal. 31 (3), 34-40 (2002).
- Näslund, J., Johnsson, J. I. Environmental enrichment for fish in captive environments: Effects of physical structures and substrates. Fish and Fisheries. 17 (1), 1-30 (2016).
- Oliveira, K. V., Barreto, R. E. Environmental enrichment reduces aggression of pearl cichlid, Geophagus brasiliensis, during resident-intruder interactions. Neotropical Ichthyology. 8 (2), 329-332 (2010).
- Brydges, N. M., Braithwaite, V. A. Does environmental enrichment affect the behaviour of fish commonly used in laboratory work. Animal Behaviour Science. 118, 137-143 (2009).
- Ahlbeck Bergendahl, I., Miller, S., Depasquale, C., Giralico, L., Braithwaite, V. A. Becoming a better swimmer: structural complexity enhances agility in a captive-reared fish. Journal of Fish Biology. 90 (3), 1112-1117 (2017).
- Roberts, L. J., Taylor, J., de Leaniz, C. G. Environmental enrichment reduces maladaptive risk-taking behavior in salmon reared for conservation. Biological Conservation. 144 (7), 1972-1979 (2011).
- Jacobs, J. Quantitative measurement of food selection. Oecologia. 14, 413-417 (1974).
- DePasquale, C., Fettrow, S., Sturgill, J., Braithwaite, V. A. The impact of flow and physical enrichment on preferences in zebrafish. Applied Animal Behaviour Science. 215, 77-81 (2019).
- Bekoff, M. Encyclopedia of Animal Rights and Animal Welfare, 2nd edition. , Greenwood Press. Santa Barbara, CA. 53 (2009).
- Fraser, D., Nicol, C. J. Preference and motivation research. Animal Welfare. , 183-199 (2011).
- Franks, B. What do animals want. Animal Welfare. 28, 1-10 (2019).
- Blaser, R. E., Rosemberg, D. B. Measures of anxiety in zebrafish (Danio rerio): dissociation of black/white preference and novel tank test. PLoS One. 7 (5), 1-8 (2012).
