Summary
Et grunnleggende aspekt ved å vurdere dyrenes velferd i fangenskap er å spørre om dyrene har det de vil ha. Her presenterer vi en protokoll for å bestemme boligpreferanse i sebrafisken (Danio rerio) med hensyn til tilstedeværelse / fravær av miljøberikelse og tilgang til vannstrømmende.
Abstract
Dyrevelferdsvurderingsteknikker prøver å ta hensyn til de spesifikke behovene og ønsker av dyret i spørsmålet. Å gi berikelse (tillegg av fysiske gjenstander eller conspecifics i boligmiljøet) er ofte en måte å gi fangede dyr muligheten til å velge hvem eller hva de samhandler med og hvordan de tilbringer sin tid. En grunnleggende komponent i akvatiske miljøet som ofte overses i fangenskap, er imidlertid evnen for dyret til å velge å engasjere seg i fysisk trening. For mange dyr, inkludert fisk, er trening et viktig aspekt av deres livshistorie, og er kjent for å ha mange helsemessige fordeler, inkludert positive endringer i hjernen og atferd. Her presenterer vi en metode for å vurdere habitatpreferanser hos fangede dyr. Protokollen kan lett tilpasses for å se på en rekke miljøfaktorer (f.eks. grus versus sand som substrat, plastplanter versus levende planter, lav strøm versus høy vannstrøm) i forskjellige akvatiske arter, eller for bruk med terrestriske arter. Statistisk vurdering av preferanse utføres ved hjelp av Jakobs preferanseindeks, som rangerer habitatene fra -1 (unngåelse) til +1 (mest foretrukket). Med denne informasjonen kan det bestemmes hva dyret ønsker fra et velferdsperspektiv, inkludert deres foretrukne plassering.
Introduction
Forskriften om hvordan laboratoriedyr skal være plassert i fangenskap er eksplisitt og veldefinert. Foreningen for vurdering og akkreditering av laboratoriedyrepleie (AAALAC) International fører tilsyn med og forvalter alle organisasjoner og institusjoner som arbeider med forskningsdyr og har spesifikke retningslinjer for artstilpasset husdyrhold og boliger. For eksempel, AAALAC veiledning om bolig og omsorg for sebrafisk, Danio Rerio1 "sterkt oppfordrer" bruk av berikelse (tillegg av fysiske gjenstander eller conspecifics i boligmiljøet) når bolig sebrafisk i fangenskap. Guiden fortsetter med å si: "Å gi kunstige planter eller strukturer som etterligner sebrafiskhabitatet, gjør at dyr et valg i deres miljø."
Bevis tyder på at berikelse kan stimulere veksten av nye nevroner (nevrogenese) i områder av hjernen som er involvert i behandling av romlig informasjon2,og det antas at disse nevrale endringene er forbundet med forbedret læringsevne3. Effekten av berikelse på nevrogenese og læring har blitt mye studert på tvers av ulike taxa, inkludert fisk4,5, fugler6, reptiler7, og pattedyr8. Selv om disse typer studier er viktige for å forstå effekten av berikelse på hjernen og atferd, tar de ikke hensyn til de spesielle valgene eller preferansene til dyr for et bestemt miljø over et annet.
Et grunnleggende spørsmål å stille når man vurderer velferden til fangede dyr er om dyrene har det de vil ha9. En måte å undersøke dette spørsmålet som gir konkrete bevis er å gi dyr valg som tillater oss å forstå deres subjektive preferanser. For eksempel har to studier undersøkt om sebrafisk foretrekker tilgang til enten et beriket eller et vanlig miljø, med begge studiene som indikerer en preferanse for områder som inneholder berikelse10,11. Det har imidlertid også blitt foreslått at sebrafisk virker likegyldig ei miljøberikelse12, så svaret på spørsmålet er åpenbart ikke klart. En annen anvendelse av preferansetesting forbundet med dyrevelferd strekker seg til å prøve å forstå hvordan ulike aspekter ved et beriket miljø spiller en rolle i valgene et enkelt dyr gjør. Hos fisk alene har ulike typer berikelse differensialeffekter på hjernen og atferden, og dette forholdet er ytterligere komplisert av individuelle forskjeller i personlighetstrekk13. Videre kan preferansetesting være nyttig for komparative studier av miljøberikelse. Selv på tvers av ulike fiskearter har berikelse vist seg å ha en effekt på mange forskjellige typer atferd, inkludert aggresjon14, dristighet15,bevegelse16og risikotaking atferd17.
Jakobs preferanseindeks er en statistisk test som brukes ofte for å kvantifisere boligpreferanser18. Jakobs preferanseindeks tildeler en verdi til hvert annet habitat basert på antall dyr som finnes i hver habitattype på forskjellige tidspunkter, hvor preferansevarierer fra -1 (unngåelse) til +1 (mest foretrukket). Her beskriver vi en metode for å bruke Jakobs preferanseindeks til å undersøke boligpreferanser i fisk og bruke eksempelet på å vurdere to viktige egenskaper i vannmiljøet: 1) tilstedeværelse eller fravær av berikelse; og 2) strømmen av vann19. Protokollen kan imidlertid lett tilpasses for å se på en rekke miljøfaktorer (f.eks. grus versus sand som substrat, plastplanter versus levende planter, lav versus høy vannstrøm) på tvers av ulike arter og landskap (f.eks. vann og terrestrisk).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Den nåværende studien har godkjenning og er i samsvar med alle krav til dyrepleie og bruk protokoller fra Pennsylvania State University; IACUC nr.
1. Oppsett av preferanseapparat
- Oppnå godkjenning fra instituttets Animal Care Committee (eller tilsvarende organisasjon) for alle eksperimentelle og husdyrhold prosedyrer som involverer levende dyr før begynne eksperimentet.
- Bruk en eksperimentell tank laget av ugjennomsiktig hvit plast. Veggene mellom sonene er laget av grå akryl som er festet på plass med silisiumtetningsmasse.
MERK: Størrelsen på den eksperimentelle tanken er avhengig av størrelsen på arten av interesse og antall personer som brukes (f.eks. for 8 voksen sebrafisk anbefales en tank på 76 cm L x 76 cm W x 30 cm H). - Del den eksperimentelle tanken i fire soner som varierer i samsvar med de spesifikke habitatparametrene som skal testes. Eksempler på ulike typer berikelse å undersøke inkluderer sandy vs steinete substrat, kunstige planter vs. tilfluktsrom, eller flyt av vann vs. tilstedeværelse av kunstige planter (Figur 1).
- Hvis du bruker vannstrømmen som en parameter av interesse, bruk små pumper til å levere vannstråler (se Materialtabell). Sett pumpene i en valgt hastighet slik at de gir en konstant og rettet vannstrøm. Velg ønsket hastighet basert på arten av interessens økologi og livshistorie (f.eks. 14 cm/s for sebrafisk).
- Midt i den eksperimentelle tanken, ha en sentral arena hvor maten leveres (Figur 1). Tilgang til den sentrale arenaen fra hver sone er gjennom en liten åpning i skilleveggene. Åpningen er stor nok til at arten av interesse kan bevege seg mellom soner uhindret, men liten nok til å redusere visuelle signaler fisken kan oppleve fra andre soner.
- Plasser et biofilter og en varmeovn i hvert hjørne av tanken, men utenfor det eksperimentelle området for ikke å forstyrre vannstrømmen og for å sikre en konstant vanntemperatur over alle soner.
- Sett opp flere eksperimentelle tanker som plass tilsier. Roter de forskjellige sonene i hver eksperimentelle tank for å begrense eventuelle sekvensielle skjevheter. Sørg for at alle replikeringstanker har ensartede forhold (samme lysnivåer, vanntemperatur osv.)
- Plasser kameraer (se Materialtabell) på stativer rett over hver eksperimentelle tank, slik at alle soner er synlige. Unngå vidvinkellinser og sørg for at minnekortene har nok plass til opptak.
- Sett rombelysningen på en gradvis (f.eks. 1/2 t) 12 L: 12 D syklus for å simulere soloppgang og solnedgang. Opprettholde vanntemperaturen ved 25 ± 1 °C.
2. Fangst, akklimatisering og prosedyre
- Hold fisk i hjemmetanker når de ikke blir testet. Netto alle test fisk fra sine hjemmetanker og plasser i sentrum arena av eksperimentelltank (Dag 1). Minimer fangsttider for å redusere stress (f.eks. mindre enn 30 s).
MERK: En alternativ prosedyre for overføring av fisk fra hjemmetanken til den eksperimentelle tanken som kan minimere stress, er å transportere fisken i et beger av tankvann. - Hold mengden og kjønnet til fisken i hver eksperimentelltank konstant på tvers av replikeringstanker og velg basert på artens størrelse og økologi.
- På dag 1-4 bruker fisk tid på å akklimatisere og utforske de ulike sonene. Ikke samle inn data på disse dager.
MERK: Utvid eller reduser antall dager for akklimatisering avhengig av den bestemte eksperimentelle protokollen. Akklimatiseringsperioden bør imidlertid være tilstrekkelig til å minimere effekten av håndtering, samt å få fisken vant til fôring i apparatet. - Under akklimaringsperioden overvåker du vannkvaliteten nøye ved å utføre regelmessige vannkvalitetstester (f.eks. pH, nitrat eller nitritt) og skift ut vannet hvis det oppdages problemer (se Materialtabell).
- Mate fisk flak mat (se Table of Materials) i den sentrale arenaen ved hjelp av en flytende matring (se Table of Materials) festet til veggen av den sentrale arenaen på vannoverflaten. En matring sikrer at matpartikler holder seg innenfor den sentrale arenaen og ikke presenterer en skjevhet for soner på grunn av matdrifting.
- Gi fisken 0,5 h å mate annonse libitum før du fjerner rester mat fra eksperimentell tank med et dip nett. Mate fisken en gang om morgenen og en gang om ettermiddagen.
- Vurder atferd på dag 5–7. Slå på kameraer og ta opp fiskeatferd i 2 timer etter hver planlagt morgen- og ettermiddagsfôring. På dag 8 fjerne all fisk fra eksperimentelle tanker med et dip nett og plassere dem tilbake i sine hjemmetanker.
- Avhengig av hvor mye sump vann er tilgjengelig, erstatte minst en 1/3 av vannet i eksperimentell tank med friskt sump vann for å redusere eventuelle effekter av stresshormoner på fisk i følgende replikerer.
- Sett opp de eksperimentelle tankene i samsvar med sonerotasjonsplanen for den uken. Rotering av sonene reduserer sjansen for atferdsbias som oppstår som følge av plassering av en sone i forhold til hverandre. Deretter begynner du testprosessen igjen med en ny gruppe fisk.
3. Målinger og dataanalyse
- Last ned videoene til en datamaskin på slutten av hver opptaksdag. Dette sikrer at det er plass på minnekortet før hver bruk.
- Bruk videoprogramvare (se Materialtabell) til å kvantifisere sonepreferanser. Telle antall fisk manuelt i hver sone med 5 min intervaller i hver 2 h opptaksperiode (inkluderer den sentrale arenaen i disse tellingene). Definer fiskens kjønn under analyse hvis differensiering mellom menn og kvinner er mulig fra videoopptakene.
- For å analysere habitatpreferanse, beregn gjennomsnittlig antall fisk per sone for hver replikaberingstank (dvs. gjennomsnitt alle data i løpet av de 3 dagene). For å oppnå en preferansescore for strukturbruk, beregn jacobs preferanseindeks15 som
J = (rx − p)/[(rx + p)– 2 *rx*p]
der x er sonen av interesse, rx er forholdet mellom fisk i sone x til det totale antall fisk i alle soner, og p er den tilgjengelige andelen av alle soner i eksperimentell tank. Indeksen varierer mellom +1 for maksimal preferanse, og −1 for maksimal unngåelse. - For å avgjøre om det er noen endringer i hastigheten som fisk bytter mellom soner i en observasjonsperiode, beregner bryterhastigheten, rsr, i første og siste 5 min i hver observasjonsperiode, hvor rsr er antall ganger en fisk kommer inn i hver sone fra den sentrale arenaen, delt på det totale antall fisk.
- Vurder en fisk å ha gått inn i en sone når fiskens hele kroppen krysser gjennom åpningen som skiller sonene. Beregn en start og en etterbehandling gjennomsnittlig bryterhastighet for hver replikeringtank. Utfør alle atferdsobservasjoner av samme eksperimenterer for å redusere eventuelle eksperimenterer observasjon bias.
- Bruk av statistisk programvare (se Materialtabell),gjennomfør relevante statistiske analyser. Foreslåtte analyser inkluderer en enveis ANOVA, med preferanseindeks som avhengig variabel og sone som prediktorvariabel, og en paret t-test på start- og etterbehandling gjennomsnittlig bryterhastighet for hver tank.
- Bruk Tukeys flere sammenligningstest etter hoc-test for å undersøke sonesammenligninger ytterligere, der hver sone sammenlignes med hverandre. Mer kompleks statistisk analyse inkluderer blandede modeller som vurderer tidseffekter, arenaeffekter, kjønnseffekter eller til og med individuelle forskjeller i atferd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi brukte preferansetesten til å undersøke boligpreferanser i sebrafisk gitt et valg mellom varierende berikelse, inkludert 1) plastplanter og sandsubstrat; og 2) vannstrøm. Disse ble delt inn i fire soner: (i) Beriket bare; (ii) Bare flyt; (iii) Beriket og flow; (iv) Vanlig; og en sentral arena hvor maten ble levert19. Sebrafisk viste den høyeste preferansen for enriched and Flow-sonen, som var vesentlig forskjellig fra alle andre soner (Beriket bare, Flow Only, Plain og Central Arena; p < 0.01). Fisk unngikk både Flow Only og Plain soner, tilbringe mer tid i Central Arena19 (Figur 2A). I tillegg flyttet sebrafisk mellom ulike habitatsoner oftere ved starten av observasjonsperioden enn på slutten (figur 2B).
Figur 1: Eksempler på ulike eksperimentelle design for å teste for habitatpreferanser. (A) Oppsett av en eksperimentell tank for å teste preferansen til en sand versus et steinete substrat. (B) Oppsett av en eksperimentell tank for å teste preferansen for berikelse (plastplanter) versus et ly. (C) Oppsett av en eksperimentell tank for å teste preferansen for berikelse (plastplanter) versus en strøm av vann. I alle figurpaneler var de fire hjørnerommene ikke tilgjengelige for fisken og inneholdt bare varmeovner og filtre. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Representative data som viser resultatene av en habitatpreferansetest på sebrafisk. (A) Jacobs preferanse indeks for hver sone: (i) Beriket bare; (ii) Beriket og Flow; (iii) Kun flyt; -Jeg har ikke noe å si. og en nøytral Central Arena. Positive og negative verdier indikerer henholdsvis preferanse og unngåelse. Boksene indikerer 25 ± 75th persentilområdet og inneholder medianlinjen; barer representerer 10th og 90th persentil verdier; åpne prikker representerer punkter utenfor disse verdiene. a = signifikant forskjell fra alle soner(p < 0,05); b = vesentlig forskjellig fra beriket og flow, beriket bare, og Central Arena(p < 0,05); og (B) boksplott som viser bryterhastigheten i begynnelsen og slutten av observasjonsperioden (boksene indikerer 25 ± 75th persentilområdet og inneholder medianlinjen; stolpersenrepresenterer 10th og 90th persentilverdier). Figur 2A er endret fra DePasquale et al.19. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her presenterer vi en eksperimentell design som gjør at vi kan undersøke preferansene til fisk for ulike typer habitater. Noen kritiske tiltak som er viktige i preferansetesting inkluderer: 1) sikre at ensartede forhold opprettholdes på tvers av ulike replikaer (f.eks. eksterne lyder eller bevegelse, eksperimenterer, vannkjemi, lysnivåer); 2) sikre at sonene roteres mellom replikerer og en betydelig mengde vann erstattes med friskt sump vann mellom tester for å redusere skjevheter; (3) sikre at en passende utvalgsstørrelse brukes til å oppdage betydelige resultater, både når det gjelder antall individer i hver gruppe og antall replikatanker; og 4) hvis forsøk er tatt opp, optimalisere og sikre riktig videoopptak og filoverføring.
Endringer i gjeldende protokoll inkluderer å utsette fisk for en rekke andre habitattyper, for eksempel forskjellige berikelsesartikler, forskjellige substrater eller til og med forskjellige strømningshastigheter. I tillegg kan det være mulig å bruke dyresporingsprogramvare for å forstå hvordan fisken bruker plassen i hver sone (f.eks. bruker fisken tid på å svømme mot vannstrømmen i strømningssonene, eller unngår de den delen av habitatet helt). Veggene i den eksperimentelle tanken må imidlertid kanskje endres for å imøtekomme denne typen sporingsprogramvare. Til slutt kan preferansetesten som er beskrevet her tilpasses enhver fiskeart, eller potensielt enhver akvatisk organisme som eksperimentereren ønsker å undersøke.
En begrensning av den nåværende protokollen er at preferansetesting er begrenset av ressursene som presenteres for dyrene. Derfor kan dyret ikke velge et foretrukket valg, men den minst ubehagelige av depresentert20. Det kan imidlertid være at det å ha et valg i første omgang er bedre for velferd enn bare å få begrensede alternativer (dvs. tilgang til det mest foretrukne habitatet bare). Det har også blitt foreslått at sebrafisk finner lysbakgrunn aversive23, og dermed kan en alternativ tankfarge (f.eks. svart) være mer egnet. Videre er preferansetesting ofte begrenset til observasjoner gjort i et lite tidsvindu, hvor det aktuelle dyret kan handle på umiddelbare signaler i stedet for fremtidige behov21,22. I tillegg er kjønn, gruppestørrelse og sosial kontekst faktorer som påvirker gruppedynamikk og dermed potensielt habitatpreferanser i fisk, så det er viktig å prøve å holde disse faktorene konsekvente på tvers av replikasjoner.
Med våre representative resultater viste vi at sebrafisk fortrinnsvis velger både berikede og flow og berikede bare soner og unngår Flow Only og Plain Zones. I sum ble sonen Beriket og Flyt foretrukket over alle andre soner. En preferanse for berikede miljøer, og spesielt enriched and Flow Zone, kan være et resultat av et økt behov for sensorisk stimulering (utforskning) eller det kan være behovet for å finne steder å skjule (redusert konkurranse fra conspecifics). Interessant nok var det en liten preferanse for Central Arena over Flow Only- og Plain-sonene, noe som tyder på at potensialet for mat som ble levert var en høyere motivasjonsfaktor enn svømming. Når det gjelder bevegelse mellom sonene, var det mer veksling mellom soner i begynnelsen av observasjonsperioden enn på slutten. Økningen i bevegelse i begynnelsen av observasjonsperioden kan tilsvare tidspunktet for fôring (fisk ble matet en halv time før opptaket startet), og dermed kan de ha vært mer motivert til å bevege seg og se etter ekstra mat. Oppsummert er protokollen som er beskrevet i den nåværende studien et effektivt verktøy for å se på habitatpreferanser hos fisk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av et forskningssamarbeid og Huck Institute ved The Pennsylvania State University, samt USDA AES 4558. Forskningen overholdt alle krav til dyrepleie og bruk protokoller fra Pennsylvania State University; IACUC nr.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Artificial Aquarium Plants | Smarlin | B07PDZQ5M5 | |
| Artificial Seaweed Water Plants for Aquarium | MyLifeUNIT | PT16L212 | |
| Experimental tanks | United State Plastic Corporation | 6106 | |
| Floating food ring | SunGrow | B07M6VWH9V | |
| Flow meter | YSI | BA1100 | |
| Jager Aquarium Thermostat Heater | Ehiem | 3619090 | |
| Master Water Quality Test Kit | API | 34 | |
| SPSS Statistics for Macintosh | IBM | Version 25.0 | |
| Submersible Pump, SL- | Songlong | SL-381 | |
| TetraMin Tropical Flakes | Tetra | 16106 | |
| Triple Flow Corner Biofilter | Lee's | 13405 | |
| Video camera | Coleman | TrekHD CVW16HD | |
| Windows Media Player (video software) | Microsoft | Windows Media Player 12 |
References
- Reed, B., Jennings, M. Guidance on the housing and care of zebrafish, Danio rerio. AAALAC International. , 36 (2010).
- van Praag, H., Kempermann, G., Gage, F. H. Neural consequences of environmental enrichment. Nature Reviews Neuroscience. 1, 191-198 (2000).
- Oomen, C. A., Berkinschtein, P., Kent, B. A., Sakisda, L. M., Bussey, T. J. Adult hippocampal neurogenesis and its role in cognition. Wiley Interdisciplinary Reviews - Cognitive Science. 5 (5), 573-587 (2014).
- DePasquale, C., Neuberger, T., Hirrlinger, A. M., Braithwaite, V. A. The influence of complex and threatening environments in early life on brain size and behaviour. Proceeedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 283 (1823), 1-8 (2016).
- Salvanes, A. G. V., et al. Environmental enrichment promotes neural plasticity and cognitive ability in fish. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 280, 1-7 (2013).
- Barnea, A., Pravosudov, V. V. Birds as a model to study adult neurogenesis: bridging evolutionary, comparative and neuroethological approaches. European Journal of Neuroscience. 34 (6), 884-907 (2011).
- LaDage, L. D., et al. Interaction between territoriality, spatial environment, and hippocampal neurogenesis in male side-blotched lizards. Behavioral Neuroscience. 127 (4), 555-565 (2013).
- Kempermann, G. Why New Neurons? Possible Functions for Adult Hippocampal Neurogenesis. Journal of Neuroscience. 22 (3), 635-638 (2002).
- Dawkins, M. S. Using behaviour to assess animal welfare. Animal Welfare. 13, 3-7 (2004).
- Kistler, C., Hegglin, D., Würbel, H., König, B. Preference for structured environment in zebrafish (Danio rerio) and checker barbs (Puntius oligolepis). Applied Animal Behaviour Science. 135, 318-327 (2011).
- Schroeder, P., Jones, S., Young, I. S., Sneddon, L. U. What do zebrafish want? Impact of social grouping, dominance and gender on preference for enrichment. Laboratory Animals. 48 (4), 328-337 (2014).
- Matthews, M., Trevarrow, B., Matthews, J. A virtual guide for zebrafish users. Lab Animal. 31 (3), 34-40 (2002).
- Näslund, J., Johnsson, J. I. Environmental enrichment for fish in captive environments: Effects of physical structures and substrates. Fish and Fisheries. 17 (1), 1-30 (2016).
- Oliveira, K. V., Barreto, R. E. Environmental enrichment reduces aggression of pearl cichlid, Geophagus brasiliensis, during resident-intruder interactions. Neotropical Ichthyology. 8 (2), 329-332 (2010).
- Brydges, N. M., Braithwaite, V. A. Does environmental enrichment affect the behaviour of fish commonly used in laboratory work. Animal Behaviour Science. 118, 137-143 (2009).
- Ahlbeck Bergendahl, I., Miller, S., Depasquale, C., Giralico, L., Braithwaite, V. A. Becoming a better swimmer: structural complexity enhances agility in a captive-reared fish. Journal of Fish Biology. 90 (3), 1112-1117 (2017).
- Roberts, L. J., Taylor, J., de Leaniz, C. G. Environmental enrichment reduces maladaptive risk-taking behavior in salmon reared for conservation. Biological Conservation. 144 (7), 1972-1979 (2011).
- Jacobs, J. Quantitative measurement of food selection. Oecologia. 14, 413-417 (1974).
- DePasquale, C., Fettrow, S., Sturgill, J., Braithwaite, V. A. The impact of flow and physical enrichment on preferences in zebrafish. Applied Animal Behaviour Science. 215, 77-81 (2019).
- Bekoff, M. Encyclopedia of Animal Rights and Animal Welfare, 2nd edition. , Greenwood Press. Santa Barbara, CA. 53 (2009).
- Fraser, D., Nicol, C. J. Preference and motivation research. Animal Welfare. , 183-199 (2011).
- Franks, B. What do animals want. Animal Welfare. 28, 1-10 (2019).
- Blaser, R. E., Rosemberg, D. B. Measures of anxiety in zebrafish (Danio rerio): dissociation of black/white preference and novel tank test. PLoS One. 7 (5), 1-8 (2012).
