Summary
포로 생활에서 동물의 복지를 평가하는 근본적인 측면은 동물이 원하는 것을 가지고 있는지 묻는 것입니다. 여기서, 우리는 환경 농축의 존재/부재 및 물의 흐름에 대한 접근에 관하여 제브라피시(Daniorerio)의주거 선호도를 결정하는 프로토콜을 제시한다.
Abstract
동물 복지 평가 기술은 문제의 동물의 특정 요구와 욕구를 고려하려고 합니다. 농축 (주거 환경에서 물리적 개체 또는 conspecificss의 추가)를 제공하는 것은 종종 포로 동물에게 그들이 상호 작용하는 사람 또는 그들이 어떻게 시간을 보낼 지 선택할 수있는 기회를 제공하는 방법입니다. 그러나 포로 생활에서 종종 간과되는 수생 환경의 기본 구성 요소는 동물이 운동을 선택할 수있는 능력입니다. 물고기를 포함한 많은 동물의 경우, 운동은 그들의 삶의 역사의 중요한 측면이며, 뇌와 행동에 긍정적 인 변화를 포함하여 많은 건강 혜택을 가지고 알려져있다. 여기에서 우리는 포로 동물의 서식지 선호도를 평가하는 방법을 제시합니다. 이 프로토콜은 다양한 수생 종에서 다양한 환경 요인(예: 자갈 대 모래, 플라스틱 식물 대 살아있는 식물, 물의 낮은 흐름 대 높은 흐름)을 보거나 육상 종과 함께 사용하기 위해 쉽게 적응할 수 있습니다. 선호도에 대한 통계적 평가는 서식지를 -1(회피)에서 +1(가장 선호)으로 평가하는 Jacob의 선호도 지수를 사용하여 수행됩니다. 이 정보를 통해 동물이 선호하는 위치를 포함하여 복지 관점에서 무엇을 원하는지 결정할 수 있습니다.
Introduction
실험실 동물을 포로로 수용하는 방법을 규제하는 규정은 명시적이고 잘 정의되어 있습니다. 실험실 동물 관리의 평가 및 인증 협회 (AAALAC) 국제 감독 및 연구 동물과 함께 작동 하는 모든 조직 및 기관을 관리 하 고 종 에 적합 한 축산 및 주택에 대 한 특정 지침을 가지고. 예를 들어, AAALAC의 제브라피쉬 하우징 및 케어에 대한 지침, Danio Rerio1은 제브라피시를 포로로 수용할 때 농축(주거 환경에서 물리적 개체 또는 특정성을 추가하는 것)의 사용을 "강력히 권장"합니다. 가이드는 "얼룩말 어류 서식지를 모방한 인공 식물이나 구조물을 제공하면 동물이 환경 내에서 선택할 수 있습니다."
증거는 농축이 공간 정보 처리에 관여하는 뇌 의 영역에서 새로운 뉴런 (neurogenesis)의 성장을 자극 할 수 있음을 시사2,이러한 신경 변화는 향상된 학습 능력과 관련된 것으로 생각된다3. 신경 발생 및 학습에 대한 농축의 효과는 물고기4,5,조류6,파충류7및 포유류8을포함하여 다양한 taxa에 걸쳐 널리 연구되어 왔다. 연구의 이 모형은 두뇌와 행동에 농축의 효력을 이해하는 것이 중요하더라도, 그(것)들은 다른 위에 특정 한 환경에 대한 동물의 특정 선택 또는 환경 설정을 고려하지 않습니다.
포로 동물의 복지를 평가할 때 물어 봐야 할 근본적인 질문은 동물이 원하는 것을 가지고 있는지여부입니다 9. 확실한 증거를 제공하는이 질문을 조사하는 방법은 우리가 주관적 인 환경 설정을 이해할 수있는 선택의 동물을 제공하는 것입니다. 예를 들어, 두 연구는 제브라피쉬가 농축10,11을포함하는 영역에 대한 선호도를 나타내는 두 연구와 함께, 농축 또는 일반 환경 중 하나에 대한 액세스를 선호하는지 여부를 조사했다. 그러나, 제브라피쉬는 환경농축12에무관심해 보이는 것이 제안되었기 때문에, 질문에 대한 답은 분명히 명확하지 않다. 동물 복지와 관련된 선호도 테스트의 또 다른 응용 프로그램은 농축 된 환경의 다른 측면이 개별 동물이 내리는 선택에 어떤 역할을하는지 이해하려고 노력합니다. 물고기 혼자에서, 농축의 다른 모형은 두뇌와 행동에 차등 효력이 있고, 이 관계는 성격 특성에 있는 개별적인 다름에 의해 더 복잡합니다13. 또한, 환경 농축의 비교 연구에 대한 선호도 테스트가 유용 할 수 있습니다. 상이한 어종에 걸쳐서도, 농축은침략14,대담함15,운동16,및 위험 감수 행동17을포함하여 행동의 많은 다른 모형에 영향을 미치는 것으로 나타났습니다.
Jacob의 선호도 지수는 주택 선호도18을정량화하는 데 자주 사용되는 통계 테스트입니다. Jacob의 선호도 지수는 선호도가 -1(회피)에서 +1(가장 선호되는)까지 다양한 시점에서 각 서식지 유형에 존재하는 동물의 수에 따라 각 서식지에 값을 할당합니다. 여기서 우리는 야곱의 선호도 지수를 사용하여 물고기의 주택 선호도를 조사하고 수생 환경의 두 가지 중요한 특성을 평가하는 예를 사용하는 방법을 설명합니다: 1) 농축의 유무; 및 2) 물의 흐름19. 그러나, 프로토콜은 다양한 종과 풍경(예: 수생 및 육상)에 걸쳐 다양한 환경 요인(예: 자갈 대 모래, 플라스틱 식물 대 살아있는 식물, 낮은 물 흐름 대 높은 물 흐름)을 보기 위해 쉽게 조정될 수 있습니다.
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Protocol
현재 연구는 승인이 있고 펜실베니아 주립 대학의 동물 관리 및 사용 프로토콜의 모든 요구 사항을 준수합니다. IACUC 번호 46466.
1. 선호 장치 설치
- 실험을 시작하기 전에 살아있는 동물과 관련된 모든 실험 및 축산 절차에 대한 연구소의 동물 관리 위원회 (또는 동등한 조직)의 승인을 얻습니다.
- 불투명 한 흰색 플라스틱으로 만든 실험 탱크를 사용합니다. 영역 사이의 벽은 실리콘 실란트와 장소에 고정 된 회색 아크릴로 만들어집니다.
참고 : 실험 탱크의 크기는 관심종의 크기와 사용되는 개인의 수에 따라 달라집니다 (예를 들어, 8 성인 얼룩말, 76cm L x 76cm W X 30cm H의 탱크권장). - 실험 탱크를 테스트할 특정 서식지 매개 변수에 따라 달라지는 4개의 영역으로 나눕니다. 조사할 수 있는 다양한 유형의 농축예로는 모래 대 암석 기판, 인공 식물 대 대피소, 또는 인공 식물의 존재 대 물의 흐름이있습니다(그림 1).
- 물의 흐름을 관심 의 매개 변수로 사용하는 경우 작은 펌프를 사용하여 물 제트를 공급하십시오 (재료 표참조). 펌프가 일정한 방향의 물 흐름을 제공하도록 선택한 속도로 펌프를 설정합니다. 관심의 생태와 삶의 역사의 종에 따라 원하는 속도를 선택합니다 (예 : 얼룩말의 경우 14cm / s).
- 실험 탱크의 중간에 음식이 배달되는 중앙 경기장이 있습니다(그림 1). 각 구역에서 중앙 경기장으로 가는 접근은 분리된 벽의 작은 개구부를 통해 서있습니다. 개구부는 관심 있는 종들이 방해받지 않고 구역 사이를 이동할 수 있을 만큼 크지만, 물고기가 다른 지역에서 경험할 수 있는 시각적 신호를 줄이기에 충분히 작습니다.
- 탱크의 각 구석에 바이오 필터와 히터를 배치하지만, 물의 흐름을 방해하지 않도록 실험 영역 외부에 모든 영역에 걸쳐 일정한 수온을 보장합니다.
- 공간 지정에 따라 추가 실험 탱크를 설정합니다. 각 실험 탱크의 다른 영역을 회전하여 순차적 바이어스를 제한합니다. 모든 복제 탱크가 균일한 조건(동일한 조도, 수온 등)을 갖도록 합니다.
- 모든 영역이 보이도록 각 실험 탱크 바로 위에 카메라(재료 표참조)를 놓습니다. 광각 렌즈를 피하고 메모리 카드에 기록할 공간이 충분한지 확인합니다.
- 일출과 일몰을 시뮬레이션하기 위해 점진적(예: 1/2시간) 12L: 12D 주기로 실내 조명을 설정합니다. 수온을 25 ±1 °C로 유지합니다.
2. 캡처, 적응 및 절차
- 그들은 테스트되지 않을 때 홈 탱크에 물고기를 유지합니다. 그물 그들의 가정 탱크에서 모든 테스트 물고기와 실험 탱크의 중앙 경기장에 장소 (1 일). 캡처 시간을 최소화하여 스트레스를 줄입니다(예: 30초 미만).
참고 : 스트레스를 최소화 할 수있는 실험 탱크로 자신의 가정 탱크에서 물고기를 전송하기위한 다른 절차는 탱크 물의 비커에 물고기를 수송하는 것입니다. - 복제 탱크에 걸쳐 각 실험 탱크에서 물고기의 수와 성별을 일정하게 유지하고 종의 크기와 생태에 따라 선택합니다.
- 1-4일에는 물고기가 적응하고 다른 지역을 탐험하는 데 시간을 보냅니다. 이 날에는 데이터를 수집하지 마십시오.
참고: 특정 실험 프로토콜에 따라 적응일 수를 연장하거나 줄입니다. 그러나 적응 기간은 취급의 영향을 최소화하고 물고기가 기기에서 먹이는 데 익숙해지도록 충분해야합니다. - 적응 기간 동안 정기적인 수질 검사(예: pH, 질산염 또는 아질산염 수준)를 수행하여 수질을 면밀히 모니터링하고 문제가 감지되면 물을 교체합니다(재료 표참조).
- 중앙 아레나에서 물 표면의 중앙 아레나 벽에 부착된 부동 식품 링(재료 표참조)을 사용하여 중앙 경기장에서 생선 플레이크 식품(재료 표참조)을 먹이세요. 푸드 링은 음식 입자가 중앙 경기장 내에 머무르도록 보장하고 음식 표류로 인해 영역에 대한 편향을 제공하지 않습니다.
- 실험 탱크에서 남은 음식을 딥 그물로 제거하기 전에 물고기에게 광고 리비텀을 먹이도록 .5 h를 제공합니다. 아침에 한 번, 오후에 한 번 물고기를 먹이.
- 5-7일에 행동을 평가한다. 카메라를 켜고 각 예정된 아침과 오후 수유 후 2 시간 동안 물고기 행동을 기록하십시오. 8일째되는 날에는 실험용 탱크에서 모든 물고기를 딥 그물로 제거하고 홈 탱크에 다시 넣습니다.
- 얼마나 많은 기름통 물을 사용할 수 에 따라, 다음 복제물고기에 스트레스 호르몬의 영향을 줄이기 위해 신선한 기름통 물 실험 탱크에 있는 물의 적어도 1/3을 대체.
- 해당 주의 영역 회전 일정에 따라 실험 탱크를 설정합니다. 영역을 회전하면 서로 를 기준으로 영역을 배치한 결과로 발생하는 동작 바이어스가 발생할 가능성이 줄어듭니다. 그런 다음 새로운 생선 배치로 테스트 프로세스를 다시 시작합니다.
3. 측정 및 데이터 분석
- 각 녹화 일의 끝에 컴퓨터에 비디오를 다운로드합니다. 이렇게 하면 모든 사용 전에 메모리 카드에 공간이 확보됩니다.
- 비디오 소프트웨어(재료 표 참조)를사용하여 영역 기본 설정을 정량화합니다. 각 2시간 기록 기간 동안 5분 간격으로 각 구역의 물고기 수를 수동으로 계산합니다(이 카운트의 중앙 아레나 포함). 비디오 푸티지에서 수컷과 여성의 차별화가 가능한지 분석 하는 동안 물고기의 성별을 정의합니다.
- 서식지 선호도를 분석하려면 각 복제 탱크의 영역당 평균 물고기 수를 계산합니다(즉, 3일 동안의 모든 데이터를 평균). 구조 사용에 대한 기본 설정 점수를 얻으려면 제이콥스의 선호도 지수15를
J =(rx - p)/[(rx + p)– 2*rx*p]
여기서 x는 관심 영역인 경우, rx는 영역 x의 물고기 의 비율과 모든 영역에서 의 총 물고기 수이며, p는 실험 탱크의 모든 영역의 사용 가능한 비율입니다. 인덱스범위는 최대 선호도를 위해 +1과 최대 회피를 위해 -1 사이입니다. - 관찰 기간 동안 물고기가 영역 을 전환하는 속도에 변화가 있는지 확인하려면 모든 관찰 기간의 첫 번째 및 마지막 5 분 동안 스위치 속도, rsr을계산하여 rsr이 중앙 경기장에서 각 영역에 들어오는 횟수를 총 물고기 수로 나눈 값입니다.
- 물고기의 전신이 구역을 분리하는 개구부를 통과할 때 물고기가 구역에 들어간 것을 생각해 보십시오. 각 복제 탱크에 대한 시작 및 마무리 평균 전환 속도를 계산합니다. 동일한 실험자가 모든 행동 관찰을 수행하여 실험자 관찰 편향을 줄입니다.
- 통계 소프트웨어(재료 표 참조)를사용하여 관련 통계 분석을 수행합니다. 제안된 분석에는 선호도 지수를 종속 변수로, 영역을 예측 변수로 지정하고 각 탱크의 시작 및 종료 평균 스위치 속도에 대한 페어링된 t 검정이 포함된 단방향 ANOVA가 포함됩니다.
- Tukey의 다중 비교 후 hoc 테스트를 적용하여 각 영역이 서로 비교되는 영역 비교를 더 자세히 조사합니다. 보다 복잡한 통계 분석에는 시간 효과, 경기장 효과, 성별 효과 또는 행동의 개별 적 차이를 평가하는 혼합 모델이 포함됩니다.
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Representative Results
우리는 1) 플라스틱 식물과 모래 기판을 포함하여 다양한 농축 중에서 선택할 수있는 제브라피시의 주택 선호도를 조사하기 위해 선호도 테스트를 사용했습니다. 및 2) 물 흐름. 이들은 네 개의 영역으로 나뉘어졌다: (i) 농축만; (ii) 흐름 만; (iii) 농축 및 흐름; (iv) 평야; 그리고 음식이 배달 된 중앙 경기장19. Zebrafish는 다른 모든 지역(농축 전용, 흐름 전용, 평원, 중앙 투기장)과 크게 다른 농축 및 흐름 영역에 대한 선호도가 가장 높은 것으로 나타났습니다. p< 0.01). 물고기는 흐름 전용과 일반 영역을 모두 피했고, 중앙 아레나19 (그림 2A)에서더 많은 시간을 보냈습니다. 또한, 제브라피쉬는 관찰 기간이 끝날 때보다 다른 서식지 영역 사이를 더 자주 이동하였다(그림2B).
그림 1: 서식지 선호도를 테스트하기 위한 다양한 실험 설계의 예입니다. (A)바위 기판 대 모래의 선호도를 테스트하기 위해 실험 탱크의 설정. (B)대피소 대 농축 (플라스틱 식물)의 선호도를 테스트하기 위해 실험 탱크의 설치. (C)실험 탱크의 설치는 물의 흐름 대 농축 (플라스틱 식물)의 선호도를 테스트합니다. 모든 그림 패널에서 4개의 코너 컴파트먼트는 물고기에 접근할 수 없었고 히터와 필터만 포함되어 있었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 제브라피시에 대한 서식지 선호도 테스트 결과를 보여주는 대표적인 데이터. (A)각 영역에 대한 제이콥스의 선호도 지수:(i)농축만; (ii)농축 및 흐름; (iii)흐름만; (iv)일반; 그리고 중립적 인 중앙 아레나. 양수 및 음수 값은 각각 기본 설정 및 회피를 나타냅니다. 상자는 25 ±75 번째 백분위수 범위를 나타내고 중앙선을 포함합니다. 막대는 10번째 및 90번째 백분위수 값을 나타냅니다. 열린 점은 이러한 값 외부의 점을 나타냅니다. a = 모든 영역(p < 0.05)에서 유의한 차이); b = 농축 및 흐름, 농축 전용 및 중앙 아레나(p < 0.05)와 크게 다르다; 및(B)관찰 기간의 시작과 끝에서 스위치 속도를 보여주는 상자 플롯(상자는 25±75 번째 백분위수 범위를 나타내고 중앙선 포함; 막대는 10번째 및 90번째 백분위수 값을 나타낸다). 그림 2A는 DePasquale 외19에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기에서 우리는 우리가 서식지의 다른 유형에 대한 물고기의 환경 설정을 조사 할 수있는 실험 디자인을 제시한다. 선호도 테스트에서 중요한 몇 가지 중요한 단계는 다음과 같습니다: 1) 균일한 조건이 다른 복제물(예: 외부 소음 또는 움직임, 실험자, 물 화학, 광레벨)에 걸쳐 유지되도록 보장합니다. 2) 영역이 복제 물 사이에 회전하고 상당한 양의 물이 편향을 줄이기 위해 테스트 사이에 신선한 기름통으로 대체되도록 보장; (3) 각 그룹의 개인 수와 복제 탱크 수 모두에서 중요한 결과를 감지하기 위해 적절한 샘플 크기를 사용하는지 확인합니다. 4) 시험이 기록된 경우 적절한 비디오 녹화 및 파일 전송을 최적화하고 보장합니다.
현재 프로토콜에 대한 수정에는 다른 농축 항목, 다른 기판 또는 다른 유량과 같은 다양한 다른 서식지 유형에 물고기를 노출하는 것이 포함됩니다. 또한 동물 추적 소프트웨어를 사용하여 물고기가 각 구역의 공간을 어떻게 사용하는지 더 잘 이해할 수 있습니다(예: 물고기가 유동 구역의 물의 흐름에 대해 수영하는 시간을 보내거나 서식지의 해당 부분을 완전히 피합니까). 그러나 이러한 유형의 추적 소프트웨어를 수용하기 위해 실험 탱크의 벽을 수정해야 할 수도 있습니다. 마지막으로, 여기에 설명된 선호도 테스트는 실험자가 조사하고자 하는 모든 어종 또는 잠재적으로 모든 수생 생물에 적용될 수 있습니다.
현재 프로토콜의 한계는 동물에게 제공되는 자원에 의해 선호도 테스트가 제한된다는 것입니다. 따라서, 동물은 선호하는 선택을하지 않을 수 있지만, 제시 된 그 중 가장 불쾌한20. 그러나, 처음에 선택을 갖는 것은 제한된 옵션 (즉, 가장 선호하는 서식지에만 액세스)을 부여하는 것보다 복지에 더 좋을 수 있습니다. 또한, 제브라피쉬는 빛의 배경을 발견하여23을발견할 수 있으며, 따라서 대체 탱크 색상(예를 들어, 검은색)이 더 적합할 수 있다. 더욱이, 선호도 검사는 종종 문제의 동물이 미래의 필요21,22보다즉각적인 단서에 작용할 수 있는 시간의 작은 창에서 이루어진 관찰에 제한된다. 또한 성별, 그룹 크기 및 사회적 맥락은 그룹 역학에 영향을 미치고 따라서 물고기의 서식지 선호도에 영향을 미치는 요소이므로 복제전반에 걸쳐 이러한 요소를 일관되게 유지하는 것이 중요합니다.
우리의 대표적인 결과로 우리는 제브라피쉬가 농축 및 흐름 및 농축 전용 영역을 우선적으로 선택하고 유동 전용 및 일반 영역을 피하는 것으로 나타났습니다. 요약하면, 농축 및 흐름 영역은 다른 모든 영역보다 선호되었습니다. 농축 된 환경, 특히 농축 및 흐름 영역에 대한 선호는 감각 자극 (탐사)에 대한 필요성이 증가한 결과일 수도 있고 숨길 곳을 찾아야 할 필요가있을 수 있습니다 (conspecifics에서 경쟁 감소). 흥미롭게도, 흐름 전용 및 일반 영역을 통해 중앙 경기장에 대 한 약간의 선호가 있었다, 배달 되는 음식의 잠재력수영 보다 더 높은 동기 부여 요인 제안. 구역 간 이동 측면에서 관찰 기간 초반에는 끝보다 영역 간 전환이 더 많았습니다. 관찰 기간의 시작 부분에 운동의 증가는 먹이의 타이밍에 해당 할 수있다 (물고기는 기록이 시작되기 전에 반 시간 공급했다), 따라서 그들은 이동하고 추가 음식을 찾기 위해 더 많은 동기를 부여 되었을 수 있습니다. 요약하자면, 현재 연구에 설명된 프로토콜은 물고기의 서식지 선호도를 살펴보는 효과적인 도구입니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
이 작품은 연구 협력 펠로우십과 펜실베니아 주립 대학의 허크 연구소뿐만 아니라 USDA AES 4558에 의해 지원되었다. 연구는 펜실베니아 주립 대학의 동물 관리 및 사용 프로토콜의 모든 요구 사항을 준수; IACUC 번호 46466.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Artificial Aquarium Plants | Smarlin | B07PDZQ5M5 | |
| Artificial Seaweed Water Plants for Aquarium | MyLifeUNIT | PT16L212 | |
| Experimental tanks | United State Plastic Corporation | 6106 | |
| Floating food ring | SunGrow | B07M6VWH9V | |
| Flow meter | YSI | BA1100 | |
| Jager Aquarium Thermostat Heater | Ehiem | 3619090 | |
| Master Water Quality Test Kit | API | 34 | |
| SPSS Statistics for Macintosh | IBM | Version 25.0 | |
| Submersible Pump, SL- | Songlong | SL-381 | |
| TetraMin Tropical Flakes | Tetra | 16106 | |
| Triple Flow Corner Biofilter | Lee's | 13405 | |
| Video camera | Coleman | TrekHD CVW16HD | |
| Windows Media Player (video software) | Microsoft | Windows Media Player 12 |
References
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