Summary
Фундаментальный аспект оценки благополучия животных в неволе заключается в том, чтобы спросить, есть ли у животных то, что они хотят. Здесь мы представляем протокол для определения жилищных предпочтений в зебрафиш(Danio rerio) в отношении наличия / отсутствия экологического обогащения и доступа к течению воды.
Abstract
Методы оценки благосостояния животных пытаются принять во внимание конкретные потребности и желания животного в вопросе. Обеспечение обогащения (добавление физических объектов или конспецифических веществ в жилищную среду) часто является способом дать неволе животных возможность выбирать, с кем или с чем они взаимодействуют и как они проводят свое время. Фундаментальным компонентом водной среды, которая часто упускается из виду в неволе, однако, является способность для животного, чтобы выбрать для участия в физических упражнений. Для многих животных, в том числе рыбы, физические упражнения является важным аспектом их истории жизни, и, как известно, имеют много преимуществ для здоровья, в том числе положительные изменения в мозге и поведении. Здесь мы представляем метод оценки предпочтений среды обитания у животных в неволе. Протокол можно легко адаптировать для изучения различных факторов окружающей среды (например, гравия против песка в качестве субстрата, пластиковых растений по сравнению с живыми растениями, низкого потока по сравнению с высоким потоком воды) у различных водных видов или для использования в наземных видах. Статистическая оценка предпочтений проводится с использованием индекса предпочтений Иакова, который оценивает среду обитания с -1 (избегание) до No1 (наиболее предпочтительно). С помощью этой информации, можно определить, что животное хочет с точки зрения благосостояния, в том числе их предпочтительным местом.
Introduction
Правила, регулирующие порядок размещения лабораторных животных в неволе, являются четкими и четко определенными. Международная ассоциация по оценке и аккредитации лабораторных животных (AAALAC) осуществляет надзор и управление всеми организациями и учреждениями, которые работают с исследовательскими животными, и имеет конкретные руководящие принципы для животноводства и жилья, соответствующие видам. Например, Руководство AAALAC по вопросам жилья и ухода за зебрафишами, Danio Rerio1 "решительно поощряет" использование обогащения (добавление физических объектов или специфики в жилищной среде) при жилье зебры в неволе. В руководстве далее говорится: "Обеспечение искусственных растений или структур, которые имитируют среду обитания зебры позволяют животным выбор в их среде".
Фактические данные свидетельствуют о том, что обогащение может стимулировать рост новых нейронов (нейрогенез) в областях мозга, участвующих в обработке пространственной информации2, и считается, что эти нервные изменения связаны с расширением способности к обучению3. Влияние обогащения на нейрогенез и обучение были широко изучены в различных таксонов, в том числе рыбы4,5, птицы6, рептилий7, и млекопитающих8. Хотя эти типы исследований важны для понимания влияния обогащения на мозг и поведение, они не принимают во внимание конкретные выборы или предпочтения животных для конкретной среды над другой.
Фундаментальный вопрос, чтобы спросить при оценке благосостояния животных в неволе является ли или не животные имеют то, что они хотят9. Способ исследовать этот вопрос, который предоставляет материальные доказательства, чтобы предоставить животным выбор, который позволяет нам понять их субъективные предпочтения. Например, два исследования исследовали ли зебрарыбы предпочитают доступ к обогащенной или простой окружающей среды, с обоими исследованиями, указывающими предпочтение областей, которые содержат обогащение10,11. Тем не менее, было также высказано предположение, что зебра рыбы кажутся равнодушными к экологическому обогащению12, так что ответ на этот вопрос, очевидно, не ясно. Другое применение тестирования предпочтений, связанных с благополучием животных, распространяется на попытки понять, как различные аспекты обогащенной окружающей среды играют определенную роль в выборе отдельного животного. В рыбе только, различные виды обогащения имеют дифференциальное воздействие на мозг и поведение, и эта связь еще более осложняется индивидуальными различиями в чертах личности13. Кроме того, тестирование предпочтений может быть полезным для сравнительных исследований по обогащению окружающей среды. Даже в различных видах рыб, обогащение было показано, что влияние на многие различные виды поведения, в том числе агрессии14, смелость15, передвижения16, и рискованное поведение17.
Индекс предпочтений Иакова является статистическим тестом, который часто используется для количественной оценки жилищных предпочтений18. Индекс предпочтений Иакова присваивает значение каждой другой среде обитания в зависимости от количества животных, присутствующих в каждом типе среды обитания в разных точках времени, где предпочтения варьируются от -1 (избегание) до 1 (наиболее предпочтительным). Здесь мы описываем метод использования индекса предпочтений Иакова для изучения жилищных предпочтений в рыбе и используем пример оценки двух важных характеристик водной среды: 1) наличие или отсутствие обогащения; и 2) поток воды19. Однако протокол можно легко адаптировать для изучения различных факторов окружающей среды (например, гравия против песка в качестве субстрата, пластиковых растений по сравнению с живыми растениями, низкого по сравнению с высоким потоком воды) различных видов и ландшафтов (например, водных и наземных).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Нынешнее исследование имеет одобрение и соответствует всем требованиям по уходу за животными и протоколы использования Университета штата Пенсильвания; МАКУК No 46466.
1. Настройка аппарата предпочтений
- Получить одобрение от Института по уходу за животными комитета (или эквивалент организации) для всех экспериментальных и животноводства процедур с участием живых животных, прежде чем начать эксперимент.
- Используйте экспериментальный резервуар из непрозрачного белого пластика. Стены между зонами сделаны из серого акрила, который фиксируется на месте с кремниевым герметиком.
ПРИМЕЧАНИЕ: Размер экспериментального резервуара зависит от размера интересующих видов и количества используемых особей (например, для 8 взрослых зебр, рекомендуется бак 76 см L x 76 см W x 30 см Н). - Разделите экспериментальный резервуар на четыре зоны, которые различаются в соответствии с конкретными параметрами среды обитания, которые должны быть протестированы. Примеры различных видов обогащения для исследования включают песчаный против скалистого субстрата, искусственные растения против укрытий, или поток воды против присутствия искусственных растений (Рисунок 1).
- При использовании потока воды в качестве параметра, представляющих интерес, используйте небольшие насосы для подачи струй воды (см. Таблицу Материалов). Установите насосы на выбранной скорости, чтобы они обеспечивали постоянный и направленный поток воды. Выберите желаемую скорость на основе видов экологии и истории жизни (например, 14 см/с для зебры).
- В середине экспериментального танка, есть центральная арена, где пища доставляется(рисунок 1). Доступ к центральной арене из каждой зоны осуществляется через небольшое отверстие в разделительных стенах. Открытие достаточно большой для видов, представляющих интерес, чтобы перемещаться между зонами беспрепятственно, но достаточно мал, чтобы уменьшить любые визуальные сигналы рыбы могут возникнуть из других зон.
- Поместите биофильтр и обогреватель в каждом углу бака, но за пределами экспериментальной области, чтобы не нарушить поток воды и обеспечить постоянную температуру воды во всех зонах.
- Настройка дополнительных экспериментальных танков, как пространство диктует. Поверните различные зоны в каждом экспериментальном резервуаре, чтобы ограничить любое последовательное смещение. Убедитесь, что все репликационные резервуары имеют одинаковые условия (одинаковые уровни освещений, температура воды и т.д.)
- Поместите камеры (см. Таблицу Материалов)на штативы непосредственно над каждым экспериментальным резервуаром, чтобы все зоны были видны. Избегайте широкоугольных линз и убедитесь, что карты памяти имеют достаточно места для записи.
- Установите освещение комнаты на постепенный (например, 1/2 ч) 12 л: 12 D цикл для имитации восхода и захода солнца. Поддерживайте температуру воды на уровне 25 и 1 градусов по Цельсию.
2. Захват, акклиматизация и процедура
- Храните рыбу в домашних резервуарах, когда они не проходят испытания. Чистая все испытания рыбы из своих домашних танков и место в центре арене экспериментального танка (День 1). Минимизация времени захвата для уменьшения стресса (например, менее 30 с).
ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативная процедура для передачи рыбы из своего домашнего резервуара в экспериментальный резервуар, который может свести к минимуму стресс для транспортировки рыбы в стакане резервуарной воды. - Держите количество и пол рыбы в каждом экспериментальном баке постоянной через репликации танков и выбрать на основе размера видов и экологии.
- В дни 1-4 рыбы проводят время, акклиматизируя и исследуя различные зоны. Не собирайте данные в эти дни.
ПРИМЕЧАНИЕ: Продлить или уменьшить количество дней для акклиматизации в зависимости от конкретного экспериментального протокола. Тем не менее, период акклиматизации должен быть достаточным, чтобы свести к минимуму последствия обработки, а также получить рыбы привыкли к кормлению в аппарате. - В период акклиматизации внимательно следите за качеством воды путем проведения регулярных испытаний качества воды (например, уровень рН, нитрата или нитрита) и заменяете воду при обнаружении каких-либо проблем (см. Таблицу Материалов).
- Кормите рыбный хлопьев (см. Таблица материалов)на центральной арене с помощью плавающего пищевого кольца (см. Таблица материалов), прикрепленного к стене центральной арены на поверхности воды. Пищевое кольцо обеспечивает, чтобы частицы пищи оставались в пределах центральной арены и не представляли предубеждений для зон из-за дрейфующих продуктов питания.
- Дайте рыбе .5 h, чтобы накормить объявление libitum перед удалением остатки пищи из экспериментального резервуара с сеткой погружения. Кормите рыбу один раз утром и один раз во второй половине дня.
- Оцените поведение в дни 5-7. Включите камеры и запишите поведение рыбы в течение 2 ч после каждого запланированного утреннего и дневного кормления. На 8-й день удалите всю рыбу из экспериментальных резервуаров с помощью сетки для погружения и поместите их обратно в свои домашние резервуары.
- В зависимости от того, сколько водоотливной воды доступно, заменить по крайней мере 1/3 воды в экспериментальном резервуаре со свежей водоотливной водой, чтобы уменьшить любое воздействие гормонов стресса на рыбу в следующих репликаций.
- Установка экспериментальных танков в соответствии с графиком ротации зон ы на эту неделю. Вращание зоны уменьшает вероятность любого поведенческого смещения, возникающего в результате размещения любой зоны относительно друг друга. Затем начните процесс тестирования снова с новой партии рыбы.
3. Измерения и анализ данных
- Загрузите видео на компьютер в конце каждого дня записи. Это гарантирует, что есть место на карте памяти перед каждым использованием.
- Используйте программное обеспечение для видео (см. Таблицу Материалов)для количественной оценки предпочтений зон. Вручную подсчитайте количество рыбы в каждой зоне с интервалом в 5 минут в каждом периоде записи 2 ч (включите центральную арену в эти графы). Определите пол рыбы во время анализа, если по видеоматериалам возможна дифференциация между самцами и самками.
- Чтобы проанализировать предпочтения среды обитания, вычислите среднее количество рыбы на одну зону для каждого резервуара репликации (т.е. усреднете все данные за 3 дня). Для того, чтобы получить оценку предпочтений для использования структуры, вычислите индекс предпочтений Jacobs15 как
Дж.К. (гх хп)/) (рх и р) - 2"rхи р.
где x является зоной интереса, rx является соотношение мили рыбы в зоне x к общему количеству рыбы во всех зонах, а p является доступной долей всех зон в экспериментальном резервуаре. Индекс колеблется от 1 евро для максимальных предпочтений и 1 евро для максимального избежания. - Чтобы определить, есть ли какие-либо изменения в скорости, с которой рыба переключается между зонами в течение периода наблюдения, рассчитать скорость переключения, rsr, в первый и последний 5 мин каждого периода наблюдения, где rsr является количество раз рыба входит в каждую зону от центральной арены, разделены на общее количество рыбы.
- Рассмотрим рыбу, которая вступила в зону, когда все тело рыбы пересекает через отверстие, разделяющее зоны. Рассчитайте начальную и отделочные средние скорости переключения для каждого репликационного бака. Провести все поведенческие наблюдения одного и того же экспериментатора, чтобы уменьшить любые предубеждения наблюдения экспериментатора.
- Используя статистическое программное обеспечение (см. Таблицу материалов),проведите соответствующий статистический анализ. Предлагаемые анализы включают односторонний ANOVA, с индексом предпочтений в качестве зависимой переменной и зоной в качестве переменной предиктора, и парный т-тест на начальном и отделочном среднем частоте переключения для каждого бака.
- Примените многократное сравнение Тюки после специального теста для дальнейшего изучения сравнений зон, где каждая зона сравнивается друг с другом. Более сложный статистический анализ включает в себя смешанные модели, которые оценивают временные эффекты, эффекты арены, половые эффекты или даже индивидуальные различия в поведении.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мы использовали тест предпочтений для изучения жилищных предпочтений у зебры, учитывая выбор между различным обогащением, включая 1) пластиковые растения и песчаный субстрат; и 2) поток воды. Они были разделены на четыре зоны: i) Только обогащенные; ii) только поток; iii) обогащенный и поток; (iv) равнина; и центральная арена, куда доставили19блюд еды. «Зебрафиш» отдавал наибольшее предпочтение зоне Enriched and Flow, которая значительно отличалась от всех других зон (только для обогащения, только потока, равнины и Центральной Арены; р Злт; 0,01). Рыба избегала как потока только и равнины зон, проводя больше времени в Центральной Арене19 (Рисунок 2A). Кроме того, зебрафиш перемещалась между различными зонами обитания чаще в начале периода наблюдения, чем в конце(рисунок 2B).
Рисунок 1: Примеры различных экспериментальных конструкций для проверки предпочтений среды обитания. (A)Установка экспериментального танка для проверки предпочтений песчаного против скалистого субстрата. (B) Установка экспериментального резервуара для проверки предпочтений обогащения (пластиковые растения) по сравнению с укрытием. (C) Установка экспериментального резервуара для проверки предпочтений обогащения (пластиковые растения) по сравнению с потоком воды. Во всех фигурных панелях четыре угловых отсека не были доступны для рыбы и содержали только обогреватели и фильтры. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Репрезентативные данные, показывающие результаты теста на предпочтения среды обитания на зебрафишах. (A) Индекс предпочтений Jacobs для каждой зоны: (i) Обогащенный только; (ii)Обогащенный и поток; (iii)Только поток; (iv)Равнина; и нейтральная Центральная Арена. Положительные и отрицательные значения указывают на предпочтение и избегание, соответственно. Коробки указывают на диапазон 25 и 75-го процентиля и содержат среднюю линию; бары представляют 10-й и 90-й процентильные значения; открытые точки представляют точки за пределами этих значений. a - значительное отличие от всех зон(p qlt; 0.05); b - значительно отличается от обогащенного и потока, только обогащенного, и Центральной Арены(p qlt; 0.05); и (B)участки коробок, показывающие скорость переключения в начале и конце периода наблюдения (коробки указывают на диапазон 25 и 75-го процентиля и содержат медианную линию; бары представляют значения 10-го и 90-го процентиля). Рисунок 2A был изменен с DePasquale и др.19. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы представляем экспериментальную конструкцию, которая позволяет исследовать предпочтения рыб для различных типов мест обитания. Некоторые важные шаги, которые имеют важное значение при тестировании предпочтений, включают: 1) обеспечение одинаковых условий для различных репликаторов (например, внешние шумы или движение, экспериментатор, химия воды, уровень освещенности); 2) обеспечение того, чтобы зоны вращались между репликациями и значительное количество воды заменялось пресной водоотливной водой между испытаниями для уменьшения смещений; (3) обеспечение того, чтобы для обнаружения значительных результатов использовался соответствующий размер выборки как с точки зрения числа лиц в каждой группе, так и числа рефлицитовых цистерн; и 4) в случае записи испытаний, оптимизации и обеспечения надлежащей видеозаписи и передачи файлов.
Изменения в текущем протоколе включают подвергая рыбу к различным другим типам среды обитания, таким как различные элементы обогащения, различные субстраты, или даже различные темпы потока. Кроме того, можно использовать программное обеспечение для отслеживания животных для дальнейшего понимания того, как рыбы используют пространство в каждой зоне (например, делают ли рыбы время, плавая против потока воды в зонах потока, или же они вообще избегают этой части среды обитания). Тем не менее, стены экспериментального танка, возможно, потребуется изменить для размещения этого типа программного обеспечения отслеживания. Наконец, описанный здесь тест предпочтений может быть адаптирован к любому виду рыб или, возможно, к любому водного организма, который экспериментатор хочет исследовать.
Ограничением текущего протокола является то, что тестирование предпочтений ограничено ресурсами, которые представлены животным. Таким образом, животное не может быть выбор предпочтительного выбора, но наименее неприятным из тех, представленных20. Однако, возможно, что выбор в первую очередь лучше для благосостояния, чем только ограниченные возможности (т.е. доступ только к наиболее предпочтительной среде обитания). Кроме того, было высказано предположение, что зебрафиш найти светфон aversive23, таким образом, альтернативный цвет танка (например, черный) может быть более подходящим. Кроме того, тестирование предпочтений часто ограничивается наблюдениями, сделанными в небольшое окно времени, где животное, о котором идет речь, может действовать на немедленные сигналы, а не будущие потребности21,22. Кроме того, гендерные, групповые размеры и социальный контекст являются факторами, влияющими на динамику группи и, следовательно, потенциально предпочтения среды обитания у рыб, поэтому важно стараться поддерживать эти факторы в различных репликациях.
С нашими репрезентативными результатами мы показали, что зебра фиш преференциально выбирает зоны «Обогащенный и поток» и «Обогащенные только» и избегая только потоковых и равнинных зон. В целом зона Обогащения и Потока была предпочтительнее для всех других зон. Предпочтение обогащенной среде, и в частности обогащенной и теточной зоне, может быть результатом возросшей потребности в сенсорной стимуляции (исследовании) или может быть необходимостью найти места, где можно спрятаться (снижение конкуренции со стороны конспецифических). Интересно, что центральная арена отдавала небольшое предпочтение зонам Flow Only и Plain, что свидетельствует о том, что потенциал доставки продовольствия является более важным мотивационным фактором, чем плавание. С точки зрения движения между зонами в начале периода наблюдения было больше переключения между зонами, чем в конце. Увеличение движения в начале периода наблюдения может соответствовать срокам кормления (рыбу кормили за полчаса до начала записи), поэтому они, возможно, были более мотивированы к перемещению и поиску дополнительной пищи. Таким образом, протокол, описанный в настоящем исследовании, является эффективным инструментом для изучения предпочтений среды обитания рыб.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана научно-исследовательской стипендией сотрудничества и Институтом Гек в Университете штата Пенсильвания, а также USDA AES 4558. Исследование соответствовало всем требованиям по уходу за животными и протоколам использования Университета штата Пенсильвания; МАКУК No 46466.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Artificial Aquarium Plants | Smarlin | B07PDZQ5M5 | |
| Artificial Seaweed Water Plants for Aquarium | MyLifeUNIT | PT16L212 | |
| Experimental tanks | United State Plastic Corporation | 6106 | |
| Floating food ring | SunGrow | B07M6VWH9V | |
| Flow meter | YSI | BA1100 | |
| Jager Aquarium Thermostat Heater | Ehiem | 3619090 | |
| Master Water Quality Test Kit | API | 34 | |
| SPSS Statistics for Macintosh | IBM | Version 25.0 | |
| Submersible Pump, SL- | Songlong | SL-381 | |
| TetraMin Tropical Flakes | Tetra | 16106 | |
| Triple Flow Corner Biofilter | Lee's | 13405 | |
| Video camera | Coleman | TrekHD CVW16HD | |
| Windows Media Player (video software) | Microsoft | Windows Media Player 12 |
References
- Reed, B., Jennings, M. Guidance on the housing and care of zebrafish, Danio rerio. AAALAC International. , 36 (2010).
- van Praag, H., Kempermann, G., Gage, F. H. Neural consequences of environmental enrichment. Nature Reviews Neuroscience. 1, 191-198 (2000).
- Oomen, C. A., Berkinschtein, P., Kent, B. A., Sakisda, L. M., Bussey, T. J. Adult hippocampal neurogenesis and its role in cognition. Wiley Interdisciplinary Reviews - Cognitive Science. 5 (5), 573-587 (2014).
- DePasquale, C., Neuberger, T., Hirrlinger, A. M., Braithwaite, V. A. The influence of complex and threatening environments in early life on brain size and behaviour. Proceeedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 283 (1823), 1-8 (2016).
- Salvanes, A. G. V., et al. Environmental enrichment promotes neural plasticity and cognitive ability in fish. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 280, 1-7 (2013).
- Barnea, A., Pravosudov, V. V. Birds as a model to study adult neurogenesis: bridging evolutionary, comparative and neuroethological approaches. European Journal of Neuroscience. 34 (6), 884-907 (2011).
- LaDage, L. D., et al. Interaction between territoriality, spatial environment, and hippocampal neurogenesis in male side-blotched lizards. Behavioral Neuroscience. 127 (4), 555-565 (2013).
- Kempermann, G. Why New Neurons? Possible Functions for Adult Hippocampal Neurogenesis. Journal of Neuroscience. 22 (3), 635-638 (2002).
- Dawkins, M. S. Using behaviour to assess animal welfare. Animal Welfare. 13, 3-7 (2004).
- Kistler, C., Hegglin, D., Würbel, H., König, B. Preference for structured environment in zebrafish (Danio rerio) and checker barbs (Puntius oligolepis). Applied Animal Behaviour Science. 135, 318-327 (2011).
- Schroeder, P., Jones, S., Young, I. S., Sneddon, L. U. What do zebrafish want? Impact of social grouping, dominance and gender on preference for enrichment. Laboratory Animals. 48 (4), 328-337 (2014).
- Matthews, M., Trevarrow, B., Matthews, J. A virtual guide for zebrafish users. Lab Animal. 31 (3), 34-40 (2002).
- Näslund, J., Johnsson, J. I. Environmental enrichment for fish in captive environments: Effects of physical structures and substrates. Fish and Fisheries. 17 (1), 1-30 (2016).
- Oliveira, K. V., Barreto, R. E. Environmental enrichment reduces aggression of pearl cichlid, Geophagus brasiliensis, during resident-intruder interactions. Neotropical Ichthyology. 8 (2), 329-332 (2010).
- Brydges, N. M., Braithwaite, V. A. Does environmental enrichment affect the behaviour of fish commonly used in laboratory work. Animal Behaviour Science. 118, 137-143 (2009).
- Ahlbeck Bergendahl, I., Miller, S., Depasquale, C., Giralico, L., Braithwaite, V. A. Becoming a better swimmer: structural complexity enhances agility in a captive-reared fish. Journal of Fish Biology. 90 (3), 1112-1117 (2017).
- Roberts, L. J., Taylor, J., de Leaniz, C. G. Environmental enrichment reduces maladaptive risk-taking behavior in salmon reared for conservation. Biological Conservation. 144 (7), 1972-1979 (2011).
- Jacobs, J. Quantitative measurement of food selection. Oecologia. 14, 413-417 (1974).
- DePasquale, C., Fettrow, S., Sturgill, J., Braithwaite, V. A. The impact of flow and physical enrichment on preferences in zebrafish. Applied Animal Behaviour Science. 215, 77-81 (2019).
- Bekoff, M. Encyclopedia of Animal Rights and Animal Welfare, 2nd edition. , Greenwood Press. Santa Barbara, CA. 53 (2009).
- Fraser, D., Nicol, C. J. Preference and motivation research. Animal Welfare. , 183-199 (2011).
- Franks, B. What do animals want. Animal Welfare. 28, 1-10 (2019).
- Blaser, R. E., Rosemberg, D. B. Measures of anxiety in zebrafish (Danio rerio): dissociation of black/white preference and novel tank test. PLoS One. 7 (5), 1-8 (2012).
