JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Genetics

3D Multicolor DNA FISH Tool til at studere nuklear arkitektur i humane primære celler

Published: January 25, 2020
doi:
10.3791/60712
, , ,
1Istituto Nazionale di Genetica Molecolare “Romeo ed Enrica Invernizzi”, INGM

Summary

3D multicolor DNA FISH repræsenterer et værktøj til at visualisere flere genomiske loci inden for 3D bevaret kerner, utvetydigt definere deres gensidige interaktioner og lokalisering i det nukleare rum på et enkelt celleniveau. Her beskrives en trinvis protokol for et bredt spektrum af humane primære celler.

Abstract

Et vigtigt spørgsmål i cellebiologi er genomisk organisation inden for det nukleare rum, og hvordan kromatinarkitektur kan påvirke processer som genekspression, celleidentitet og differentiering. Mange tilgange udviklet til at studere 3D-arkitekturen af genomet kan opdeles i to komplementære kategorier: kromosom kropsbygning capture baseret teknologier (C-teknologier) og billeddannelse. Mens førstnævnte er baseret på at fange de kromosom reformation og proksimale DNA interaktioner i en population af faste celler, sidstnævnte, baseret på DNA fluorescens in situ hybridization (FISH) på 3D-bevarede kerner, giver mulighed for moderne visualisering af multipel loci på et enkelt celleniveau (multifarve), undersøge deres interaktioner og fordeling i kernen (3D multicolor DNA FISH). Teknikken med 3D multicolor DNA FISH har en begrænsning af visualisere kun et par forudbestemt loci, ikke tillader en omfattende analyse af den nukleare arkitektur. I betragtning af resultaternes robusthed er 3D-flerfarvet DNA-FISK i kombination med 3D-mikroskopi og billedrekonstruktion imidlertid en mulig metode til validering af C-teknologibaserede resultater og utvetydigt undersøge placeringen og tilrettelæggelsen af specifikke på et enkelt celleniveau. Her foreslår vi en trin for trin metode til 3D multicolor DNA FISK egnet til en bred vifte af menneskelige primære celler og diskutere alle de praktiske handlinger, afgørende skridt, forestillinger om 3D-billedbehandling og dataanalyse er nødvendige for at opnå en vellykket og informativ 3D multicolor DNA FISK i forskellige biologiske sammenhænge.

Introduction

Højere eukaryoter nødt til systematisk at kondensere og komprimere en enorm mængde af genetiske oplysninger i det øjeblik 3D plads i kernen1,2,3,4. I dag ved vi, at genomet er rumligt bestilt i rum og topologisk tilknyttede domæner5, og at de mange niveauer af DNA foldning generere kontakter mellem forskellige genomiske regioner, der kan involvere kromatin loop dannelse6,7. 3D dynamisk looping af kromatin kan påvirke mange forskellige biologiske processer såsom transskription8,9,differentiering og udvikling10,11, DNA reparation12,13, mens dens forstyrrelser er involveret i forskellige sygdomme14,15,16 og udviklingsmæssige defekter15,17,18.

Mange tilgange er blevet udviklet til at studere 3D genom organisation. Kromosom konformation capture-baserede teknologier (C-teknologier, 3C, 4C, 5C, Hi-C og derivater) er blevet udviklet til at studere genom organisation i faste celler3,4,19,20. Sådanne tilgange er baseret på evnen til at fange kontaktfrekvenser mellem genomiske loci i fysisk nærhed. C-teknologier, afhængigt af deres kompleksitet, fange den globale 3D genom organisation og nuklear topologi af en celle befolkning3,4,19,20. Ikke desto mindre, 3D-interaktioner er dynamiske i tid og rum, meget variabel mellem de enkelte celler, der består af multiplex interaktioner, og er meget heterogen21,22.

3D multicolor DNA fluorescens in situ hybridization (FISH) er en teknik, der gør det muligt at visualisering af specifikke genomiske loci på et enkelt celleniveau, der muliggør direkte undersøgelse af 3D-nuklear arkitektur på en supplerende måde til C-teknologier. Det repræsenterer en teknologi, der i øjeblikket anvendes til entydigt at validere C-resultater. 3D flerfarvet DNA FISH bruger fluorescerende mærket sonder supplerer den genomiske loci af interesser. Brugen af forskellige fluorophorer og egnet mikroskopiudstyr gør det muligt at visualisering af flere mål inden for det nukleare rum23,24. I de senere år er FISH blevet kombineret med teknologiske fremskridt inden for mikroskopi for at opnå visualisering af fine strukturer ved høj opløsning25,26 eller med CRISPR-Cas tilgange til visualisering af nukleinsyrer i levende billeddannelse27,28. På trods af bred vedtagelse, 3D multicolor DNA FISH tilgang er stadig betragtes som vanskeligt i mange laboratorier, fordi det biologiske materiale, der anvendes skal tilpasses.

Her leverer vi en omfattende protokol for 3D multicolor DNA FISH (fra celle / sonde forberedelse til dataanalyse), der gælder for en bred vifte af menneskelige primære celler, så visualisering af flere genomiske loci og bevare 3D-strukturen af kerner. For at studere nuklear arkitektur skal 3D-strukturen af kerner bevares. Derfor undgår vi i modsætning til andre eksisterende protokoller29,30,31brugen af en alkoholgradient og opbevaring af dæksedler i alkohol, der kan påvirke kromatinstruktur32. Metoden er tilpasset fra bevarede 3D DNA FISH protokoller24,33, der skal anvendes på en bred vifte af menneskelige primære celler, både isolerede ex vivo eller dyrket in vitro. Der er permeabiliserings- og deproteiniseringsparametre for forskellige nukleare morfologi og cytologiske egenskaber (f.eks. forskellige grader af nuklear komprimering, cytoskeletoverflod)34. Disse parametre er ofte generelt beskrevet i andre protokol24,33, uden at give en klar forskelsbehandling af proceduren inden for forskellige celletyper. Desuden har vi udviklet et specifikt værktøj ved navn NuCLεD (nukleare kontakter locator i 3D)16, der giver principper for dataanalyse, der vil forbedre 3D nærhed mellem forskellige loci og deres nukleare topologiske distribution inden for det nukleare rum på en automatiseret måde.

Protocol

1. DNA-sonde forberedelse og mærkning procedurer med nick oversættelse Purify og ren bakterielle kunstige kromosomer (BaCs), plasmider eller PCR produkter med specifikke kits(Tabel over materialer),resuspend i ddH2O, kontrollere ved elektroforese på en agarose gel og kvantificere. Udfør nick oversættelse på 1,5−2 μg DNA fra trin 1.1 i et slutvolumen på 50 μL ved at blande alle reagenser i et 0,5 ml lavt bindende DNA-rør i henhold til tabel 1.<br…

Representative Results

Metoden til 3D multicolor DNA FISH beskrevet i denne artikel giver mulighed for moderne visualisering af forskellige genomiske loci inden bevaret 3D kerner (Figur 1B). Denne protokol gør det muligt at måle afstande mellem alleler og forskellige genomiske loci er for at vurdere deres rumlige nærhed og vurdere deres placering i det nukleare rum (f.eks. loci afstand fra centroid eller periferien af kerner)16. Der er dog mange afgørende trin, der skal…

Discussion

Den nuværende metode beskriver en trin for trin-protokol til at udføre 3D multicolor DNA FISH på en bred vifte af menneskelige primære celler. Selv om DNA FISH er en teknologi i bred anvendelse, 3D flerfarvet DNA FISK på bevaret 3D interfasede kerner er stadig vanskeligt at udføre i mange laboratorier, hovedsagelig på grund af de særlige kendetegn ved de anvendte prøver23,24.

Sonde nick oversættelse er et grundlæggende skrid…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Forfatterne anerkender den tekniske bistand fra INGM Imaging Facility (Istituto Nazionale di Genetica Molecolare “Romeo ed Enrica Invernizzi” (INGM), Milano, Italien), især C. Cordiglieri, for at få hjælp under 3D flerfarvet DNA FISH billeder Erhvervelse. Dette arbejde er blevet støttet af følgende tilskud til B.B.: EPIGEN italiensk flagskibsprogram, Association Française contre les Myopaties (AFM-Telethon, grant nr 18754) og Giovani Ricercatori, det italienske sundhedsministerium (GR-2011-02349383). Dette arbejde er blevet støttet af følgende tilskud til F.M.: Fondazione Cariplo (Bando Giovani, tilskud nr 2018-0321).

Materials

24-well plates Thermo Fisher Scientific 142475
6-well plates Thermo Fisher Scientific 140675
Anti-Digoxigenin 488 DBA DI7488
b-Mercaptoethanol Sigma M3148
bFGF PeproTech 100-18B
Biotin 11 d-UTP Thermo Fisher Scientific R0081
BSA (bovine serum albumine) Sigma A7030
Coverlsips Marienfeld 117500
CY3 d-UTP GE Healthcare PA53022
DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole) Thermo Fisher Scientific D21490
Deoxyribonucleic acids single strand from salmon testes Sigma D7656
Dextran sulfate (powder) Santa Cruz sc-203917A
Digoxigenin 11 d-UTP Roche 11093088910
DMEM Thermo Fisher Scientific 21969-035 500mL
DNA polymerase I Thermo Fisher Scientific 18010-017
DNase I Sigma AMPD1
dNTPs (C-G-A-T) Euroclone BL0423A/C/G
EGF Sigma E9644.2MG
Ethanol Sigma 02860-1L
FBS Hyclone Thermo Fisher Scientific SH30109
Formaldehyde solution Sigma F8775-25mL
Formamide Sigma F9037
Glutammine Thermo Fisher Scientific 25030-024 100mL
Glycerol Sigma G5516-100mL
Glycogen Thermo Fisher Scientific AM9510
HCl Sigma 30721
Human Cot-1 DNA Thermo Fisher Scientific 15279-001
Insulin Human Sigma I9278-5 mL
MgCl2 Sigma 63069
NaAc (Sodium Acetate, pH 5.2, 3 M) Sigma S2889
NaCl Sigma S9888
Paraformaldehyde Sigma 158127-25G
PBS (phosphate-buffered saline) Sigma P4417
Pennycillin/Streptavidin Thermo Fisher Scientific 15070-063 100mL
Pepsin Biorad P6887
PhasePrep BAC DNA Kit Sigma NA0100-1KT
Poly-L-lysine solution Sigma P8920
ProLong Diamond Antifade Mountant Thermo Fisher Scientific P36970
PureLink Quick Gel Extraction & PCR Purification Combo Kit Thermo Fisher Scientific K220001
PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit Thermo Fisher Scientific K210010
RNAse cocktail Thermo Fisher Scientific AM2288
Rubbercement Bostik
Slides VWR 631-0114
Streptavidina Alexa fluor 647 Thermo Fisher Scientific S21374
Tri-Sodium Citrate Sigma 1110379026
Tris-HCl Sigma T3253-500g
Triton X-100 Sigma T8787-250mL
TWEEN 20 Sigma P9416-100mL
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cremer, T., Cremer, C. Chromosome territories, nuclear architecture and gene regulation in mammalian cells. Nature Reviews: Genetics. 2 (4), 292-301 (2001).
  2. Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 326 (5950), 289-293 (2009).
  3. Schmitt, A. D., Hu, M., Ren, B. Genome-wide mapping and analysis of chromosome architecture. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 17 (12), 743-755 (2016).
  4. Bonev, B., Cavalli, G. Organization and function of the 3D genome. Nature Reviews: Genetics. 17 (12), 772 (2016).
  5. van Steensel, B., Furlong, E. E. M. The role of transcription in shaping the spatial organization of the genome. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 20 (6), 327-337 (2019).
  6. Rajarajan, P., Gil, S. E., Brennand, K. J., Akbarian, S. Spatial genome organization and cognition. Nature Reviews: Neuroscience. 17 (11), 681-691 (2016).
  7. Pombo, A., Dillon, N. Three-dimensional genome architecture: players and mechanisms. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 16 (4), 245-257 (2015).
  8. Fanucchi, S., Shibayama, Y., Burd, S., Weinberg, M. S., Mhlanga, M. M. Chromosomal contact permits transcription between coregulated genes. Cell. 155 (3), 606-620 (2013).
  9. Therizols, P., et al. Chromatin decondensation is sufficient to alter nuclear organization in embryonic stem cells. Science. 346 (6214), 1238-1242 (2014).
  10. Gonzalez-Sandoval, A., et al. Perinuclear Anchoring of H3K9-Methylated Chromatin Stabilizes Induced Cell Fate in C. elegans Embryos. Cell. 163 (6), 1333-1347 (2015).
  11. Hubner, B., et al. Remodeling of nuclear landscapes during human myelopoietic cell differentiation maintains co-aligned active and inactive nuclear compartments. Epigenetics Chromatin. 8, 47 (2015).
  12. Aymard, F., et al. Genome-wide mapping of long-range contacts unveils clustering of DNA double-strand breaks at damaged active genes. Nature Structural & Molecular Biology. 24 (4), 353-361 (2017).
  13. Sellou, H., et al. The poly(ADP-ribose)-dependent chromatin remodeler Alc1 induces local chromatin relaxation upon DNA damage. Molecular Biology of the Cell. 27 (24), 3791-3799 (2016).
  14. Krijger, P. H., de Laat, W. Regulation of disease-associated gene expression in the 3D genome. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 17 (12), 771-782 (2016).
  15. Lupianez, D. G., Spielmann, M., Mundlos, S. Breaking TADs: How Alterations of Chromatin Domains Result in Disease. Trends in Genetics. 32 (4), 225-237 (2016).
  16. Cortesi, A., et al. 4q-D4Z4 chromatin architecture regulates the transcription of muscle atrophic genes in facioscapulohumeral muscular dystrophy. Genome Research. 29 (6), 883-895 (2019).
  17. Woltering, J. M., Noordermeer, D., Leleu, M., Duboule, D. Conservation and divergence of regulatory strategies at Hox Loci and the origin of tetrapod digits. PLoS Biology. 12 (1), 1001773 (2014).
  18. Woltering, J. M., Duboule, D. Tetrapod axial evolution and developmental constraints; Empirical underpinning by a mouse model. Mechanisms of Development. 138, 64-72 (2015).
  19. de Laat, W., Dekker, J. 3C-based technologies to study the shape of the genome. Methods. 58 (3), 189-191 (2012).
  20. Denker, A., de Laat, W. The second decade of 3C technologies: detailed insights into nuclear organization. Genes & Development. 30 (12), 1357-1382 (2016).
  21. Finn, E. H., et al. Extensive Heterogeneity and Intrinsic Variation in Spatial Genome Organization. Cell. 176 (6), 1502-1515 (2019).
  22. Zheng, M., et al. Multiplex chromatin interactions with single-molecule precision. Nature. 566 (7745), 558-562 (2019).
  23. Solovei, I. Fluorescence in situ hybridization (FISH) on tissue cryosections. Methods in Molecular Biology. 659, 71-82 (2010).
  24. Cremer, M., et al. Multicolor 3D fluorescence in situ hybridization for imaging interphase chromosomes. Methods in Molecular Biology. 463, 205-239 (2008).
  25. Legant, W. R., et al. High-density three-dimensional localization microscopy across large volumes. Nature Methods. 13 (4), 359-365 (2016).
  26. Jungmann, R., et al. Quantitative super-resolution imaging with qPAINT. Nature Methods. 13 (5), 439-442 (2016).
  27. Chen, B., et al. Dynamic imaging of genomic loci in living human cells by an optimized CRISPR/Cas system. Cell. 155 (7), 1479-1491 (2013).
  28. Nelles, D. A., et al. Programmable RNA Tracking in Live Cells with CRISPR/Cas9. Cell. 165 (2), 488-496 (2016).
  29. Byron, M., Hall, L. L., Lawrence, J. B. A multifaceted FISH approach to study endogenous RNAs and DNAs in native nuclear and cell structures. Current Protocol of Human Genetics. , 15 (2013).
  30. Chaumeil, J., Augui, S., Chow, J. C., Heard, E. Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation. Methods in Molecular Biology. 463, 297-308 (2008).
  31. Takizawa, T., Gudla, P. R., Guo, L., Lockett, S., Misteli, T. Allele-specific nuclear positioning of the monoallelically expressed astrocyte marker GFAP. Genes & Development. 22 (4), 489-498 (2008).
  32. Kraus, F., et al. Quantitative 3D structured illumination microscopy of nuclear structures. Nature Protocols. 12 (5), 1011-1028 (2017).
  33. Solovei, I., Cremer, M. 3D-FISH on cultured cells combined with immunostaining. Methods in Molecular Biology. 659, 117-126 (2010).
  34. Skinner, B. M., Johnson, E. E. Nuclear morphologies: their diversity and functional relevance. Chromosoma. 126 (2), 195-212 (2017).
  35. Schoenfelder, S., et al. The pluripotent regulatory circuitry connecting promoters to their long-range interacting elements. Genome Research. 25 (4), 582-597 (2015).
  36. Lubeck, E., Cai, L. Single-cell systems biology by super-resolution imaging and combinatorial labeling. Nature Methods. 9 (7), 743-748 (2012).
  37. Beliveau, B. J., et al. Single-molecule super-resolution imaging of chromosomes and in situ haplotype visualization using Oligopaint FISH probes. Nature Communication. 6, 7147 (2015).
  38. Beliveau, B. J., et al. Versatile design and synthesis platform for visualizing genomes with Oligopaint FISH probes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (52), 21301-21306 (2012).
  39. Samacoits, A., et al. A computational framework to study sub-cellular RNA localization. Nature Communication. 9 (1), 4584 (2018).
  40. Cardozo Gizzi, A. M., et al. Microscopy-Based Chromosome Conformation Capture Enables Simultaneous Visualization of Genome Organization and Transcription in Intact Organisms. Molecular Cell. 74 (1), 212-222 (2019).
  41. Mateo, L. J., et al. Visualizing DNA folding and RNA in embryos at single-cell resolution. Nature. 568 (7750), 49-54 (2019).
  42. Nir, G., et al. Walking along chromosomes with super-resolution imaging, contact maps, and integrative modeling. PLoS Genetics. 14 (12), 1007872 (2018).
  43. Bintu, B., et al. Super-resolution chromatin tracing reveals domains and cooperative interactions in single cells. Science. 362 (6413), (2018).

Tags

3D Multicolor DNA FISHNuclear ArchitectureGenomic LociChromosome CaptureNick TranslationProbe PrecipitationCell FixationPermeabilizationRNAse Treatment

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Marasca, F., Cortesi, A., Manganaro, L., Bodega, B. 3D Multicolor DNA FISH Tool to Study Nuclear Architecture in Human Primary Cells. J. Vis. Exp. (155), e60712, doi:10.3791/60712 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image