3D Multicolor DNA FISH Tool zur Erforschung der Kernarchitektur in menschlichen Primärzellen
Summary
3D-Mehrfarben-DNA-FISH stellt ein Werkzeug dar, um mehrere genomische Loci innerhalb von 3D-konservierten Kernen zu visualisieren und ihre wechselseitigen Wechselwirkungen und Lokalisierungen innerhalb des Kernraums auf einer einzigen Zellebene eindeutig zu definieren. Hier wird ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für ein breites Spektrum menschlicher Primärzellen beschrieben.
Abstract
Eine wichtige Frage in der Zellbiologie ist die genomische Organisation im Kernraum und wie die Chromatinarchitektur Prozesse wie Genexpression, Zellidentität und Differenzierung beeinflussen kann. Viele Ansätze, die zur Untersuchung der 3D-Architektur des Genoms entwickelt wurden, lassen sich in zwei sich ergänzende Kategorien unterteilen: Chromosomen-Konformationserfassungs-basierte Technologien (C-Technologien) und Bildgebung. Während ersteres auf der Erfassung der Chromosomenkonformation und proximalen DNA-Wechselwirkungen in einer Population fester Zellen basiert, ermöglicht letztere, basierend auf DNA-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) auf 3D-konservierten Kernen, eine zeitgemäße Visualisierung mehrere Loci auf einer einzelzelligen Ebene (mehrfarbig), die ihre Wechselwirkungen und Dieverteilung innerhalb des Zellkerns untersuchen (3D-Mehrfarben-DNA-FISCH). Die Technik der 3D-Mehrfarben-DNA FISH hat eine Einschränkung der Visualisierung nur ein paar vorbestimmte loci, nicht erlaubt eine umfassende Analyse der nuklearen Architektur. Angesichts der Robustheit der Ergebnisse ist 3D-Mehrfarben-DNA-FISH in Kombination mit 3D-Mikroskopie und Bildrekonstruktion jedoch eine mögliche Methode, um C-Technologie-basierte Ergebnisse zu validieren und die Position und Organisation spezifischer Loci eindeutig zu untersuchen. auf einer Einzelzellebene. Hier schlagen wir eine Schritt-für-Schritt-Methode der 3D-Mehrfarben-DNA-FISH vor, die für eine Vielzahl menschlicher Primärzellen geeignet ist, und diskutieren alle praktischen Maßnahmen, entscheidenden Schritte, Vorstellungen von 3D-Bildgebung und Datenanalyse, die erforderlich sind, um eine erfolgreiche und informative 3D-Multicolor-Funktion zu erhalten. DNA FISH in verschiedenen biologischen Kontexten.
Introduction
Höhere Eukaryoten müssen systematisch eine riesige Menge an genetischen Informationen im winzigen 3D-Raum des Kerns1,2,3,4kondensieren und verdichten. Heute wissen wir, dass das Genom räumlich in Kompartimenten und topologisch assoziierten Domänen5 angeordnet ist und dass die verschiedenen Ebenen der DNA-Faltung Kontakte zwischen verschiedenen genomischen Regionen erzeugen, die Chromatin-Schleifenbildung6,7beinhalten können. Die 3D-dynamische Schleife von Chromatin kann viele verschiedene biologische Prozesse beeinflussen, wie Transkription8,9, Differenzierung und Entwicklung10,11, DNA-Reparatur12,13, während seine Störungen sind in verschiedenen Krankheiten beteiligt14,15,16 und Entwicklungsfehler15,17,18.
Viele Ansätze wurden entwickelt, um die 3D-Genom-Organisation zu untersuchen. Chromosomen-Konformations-Capture-basierte Technologien (C-Technologien, 3C, 4C, 5C, Hi-C und Derivate) wurden entwickelt, um Genomorganisation in festen Zellen3,4,19,20zu untersuchen. Solche Ansätze basieren auf der Fähigkeit, die Kontaktfrequenzen zwischen genomischen Loci in physischer Nähe zu erfassen. C-Technologien fangen je nach Komplexität die globale 3D-Genomorganisation und Kerntopologie einer Zellpopulation3,4,19,20. Dennoch sind 3D-Interaktionen zeitlich und räumlich dynamisch, sehr variabel zwischen einzelnen Zellen, die aus Multiplex-Wechselwirkungen bestehen, und sind weitgehend heterogen21,22.
Die 3D-Mehrfarben-DNA-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) ist eine Technik, die die Visualisierung spezifischer genomischer Loci auf einer einzelnen Zellebene ermöglicht und eine direkte Untersuchung der 3D-Kernarchitektur in komplementärer Weise zu C-Technologien ermöglicht. Es stellt eine Technologie dar, die derzeit verwendet wird, um C-Ergebnisse eindeutig zu validieren. 3D-Multicolor-DNA-FISH verwendet fluoreszierend markierte Sonden, die die genomischen Loci der Interessen ergänzen. Der Einsatz verschiedener Fluorophore und geeigneter Mikroskopiegeräte ermöglicht die zeitgemäße Visualisierung mehrerer Ziele im Kernraum23,24. In den letzten Jahren wurde FISH mit technologischen Fortschritten in der Mikroskopie kombiniert, um die Visualisierung von feinskaligen Strukturen mit hoher Auflösungvon 25,26 oder mit CRISPR-Cas-Ansätzen zur Visualisierung der Nukleinsäuren in Live-Bildgebung zu erhalten27,28. Trotz breiter Akzeptanz wird der 3D-Multicolor-DNA-FISH-Ansatz in vielen Laboratorien immer noch als schwierig angesehen, da das verwendete biologische Material angepasst werden muss.
Hier bieten wir ein umfassendes Protokoll für 3D-Mehrfarben-DNA-FISH (von der Zell-/Sondenvorbereitung bis zur Datenanalyse), das für eine Vielzahl menschlicher Primärzellen gilt, um die Visualisierung mehrerer genomischer Loci zu ermöglichen und die 3D-Struktur von Kernen zu erhalten. Um die Kernarchitektur zu untersuchen, muss die 3D-Struktur von Kernen erhalten bleiben. Aus diesem Grund vermeiden wir im Gegensatz zu anderen bestehenden Protokollen29,30,31, die Verwendung eines Alkoholgradienten und die Lagerung der Abdeckungen in Alkohol, die die Chromatinstruktur beeinflussen können32. Die Methode wird aus den konservierten 3D-DNA-FISH-Protokollen24,33 angepasst, um auf eine breite Palette menschlicher Primärzellen angewendet zu werden, sowohl isoliert ex vivo als auch kultiviert in vitro. Es gibt Permeabilisations- und Deproteinisierungsparameter für verschiedene kernotische Morphologie n.Ä. und zytologische Eigenschaften (z.B. unterschiedliche Grade der nuklearen Verdichtung, Zytoskelettreichtum)34. Diese Parameter werden häufig in anderen Protokollen24,33beschrieben, ohne dass das Verfahren innerhalb verschiedener Zelltypen eindeutig diskriminiert wird. Darüber hinaus haben wir ein spezielles Tool namens NuCL-D (Nuclear Contacts locator in 3D)16entwickelt, das Prinzipien für die Datenanalyse bietet, die die 3D-Nähe zwischen verschiedenen Loci und ihrer nuklearen topologischen Verteilung innerhalb des Kernraums auf automatisierte Weise verbessern.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die aktuelle Methode beschreibt ein Schritt-für-Schritt-Protokoll, um 3D-Mehrfarben-DNA-FISH auf einer Vielzahl menschlicher Primärzellen durchzuführen. Obwohl DNA FISH eine Technologie im breiten Einsatz ist, ist 3D-Mehrfarben-DNA-FISH auf konservierten 3D-Interphasenkernen in vielen Laboratorien immer noch schwierig durchzuführen, vor allem aufgrund der Eigenschaften der verwendeten Proben23,24.
Probe nick Translation ist ein gru…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren würdigen die technische Unterstützung der INGM Imaging Facility (Istituto Nazionale di Genetica Molecolare “Romeo ed Enrica Invernizzi” (INGM), Mailand, Italien), insbesondere C. Cordiglieri, für die Unterstützung bei 3D-Mehrfarben-DNA-FISH-Bildern Erwerb. Diese Arbeit wurde durch folgende Stipendien an B.B. unterstützt: EPIGEN Italienisches Flaggschiff-Programm, Association Francoise contre les Myopathies (AFM-Telethon, Grant nr 18754) und Giovani Ricercatori, italienisches Gesundheitsministerium (GR-2011-02349383). Diese Arbeit wurde durch folgenden Zuschuss an F.M. unterstützt: Fondazione Cariplo (Bando Giovani, Grant nr 2018-0321).
Materials
| 24-well plates | Thermo Fisher Scientific | 142475 | |
| 6-well plates | Thermo Fisher Scientific | 140675 | |
| Anti-Digoxigenin 488 | DBA | DI7488 | |
| b-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| bFGF | PeproTech | 100-18B | |
| Biotin 11 d-UTP | Thermo Fisher Scientific | R0081 | |
| BSA (bovine serum albumine) | Sigma | A7030 | |
| Coverlsips | Marienfeld | 117500 | |
| CY3 d-UTP | GE Healthcare | PA53022 | |
| DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole) | Thermo Fisher Scientific | D21490 | |
| Deoxyribonucleic acids single strand from salmon testes | Sigma | D7656 | |
| Dextran sulfate (powder) | Santa Cruz | sc-203917A | |
| Digoxigenin 11 d-UTP | Roche | 11093088910 | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 21969-035 500mL | |
| DNA polymerase I | Thermo Fisher Scientific | 18010-017 | |
| DNase I | Sigma | AMPD1 | |
| dNTPs (C-G-A-T) | Euroclone | BL0423A/C/G | |
| EGF | Sigma | E9644.2MG | |
| Ethanol | Sigma | 02860-1L | |
| FBS Hyclone | Thermo Fisher Scientific | SH30109 | |
| Formaldehyde solution | Sigma | F8775-25mL | |
| Formamide | Sigma | F9037 | |
| Glutammine | Thermo Fisher Scientific | 25030-024 100mL | |
| Glycerol | Sigma | G5516-100mL | |
| Glycogen | Thermo Fisher Scientific | AM9510 | |
| HCl | Sigma | 30721 | |
| Human Cot-1 DNA | Thermo Fisher Scientific | 15279-001 | |
| Insulin Human | Sigma | I9278-5 mL | |
| MgCl2 | Sigma | 63069 | |
| NaAc (Sodium Acetate, pH 5.2, 3 M) | Sigma | S2889 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127-25G | |
| PBS (phosphate-buffered saline) | Sigma | P4417 | |
| Pennycillin/Streptavidin | Thermo Fisher Scientific | 15070-063 100mL | |
| Pepsin | Biorad | P6887 | |
| PhasePrep BAC DNA Kit | Sigma | NA0100-1KT | |
| Poly-L-lysine solution | Sigma | P8920 | |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36970 | |
| PureLink Quick Gel Extraction & PCR Purification Combo Kit | Thermo Fisher Scientific | K220001 | |
| PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit | Thermo Fisher Scientific | K210010 | |
| RNAse cocktail | Thermo Fisher Scientific | AM2288 | |
| Rubbercement | Bostik | ||
| Slides | VWR | 631-0114 | |
| Streptavidina Alexa fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | S21374 | |
| Tri-Sodium Citrate | Sigma | 1110379026 | |
| Tris-HCl | Sigma | T3253-500g | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-250mL | |
| TWEEN 20 | Sigma | P9416-100mL |
References
- Cremer, T., Cremer, C. Chromosome territories, nuclear architecture and gene regulation in mammalian cells. Nature Reviews: Genetics. 2 (4), 292-301 (2001).
- Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 326 (5950), 289-293 (2009).
- Schmitt, A. D., Hu, M., Ren, B. Genome-wide mapping and analysis of chromosome architecture. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 17 (12), 743-755 (2016).
- Bonev, B., Cavalli, G. Organization and function of the 3D genome. Nature Reviews: Genetics. 17 (12), 772 (2016).
- van Steensel, B., Furlong, E. E. M. The role of transcription in shaping the spatial organization of the genome. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 20 (6), 327-337 (2019).
- Rajarajan, P., Gil, S. E., Brennand, K. J., Akbarian, S. Spatial genome organization and cognition. Nature Reviews: Neuroscience. 17 (11), 681-691 (2016).
- Pombo, A., Dillon, N. Three-dimensional genome architecture: players and mechanisms. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 16 (4), 245-257 (2015).
- Fanucchi, S., Shibayama, Y., Burd, S., Weinberg, M. S., Mhlanga, M. M. Chromosomal contact permits transcription between coregulated genes. Cell. 155 (3), 606-620 (2013).
- Therizols, P., et al. Chromatin decondensation is sufficient to alter nuclear organization in embryonic stem cells. Science. 346 (6214), 1238-1242 (2014).
- Gonzalez-Sandoval, A., et al. Perinuclear Anchoring of H3K9-Methylated Chromatin Stabilizes Induced Cell Fate in C. elegans Embryos. Cell. 163 (6), 1333-1347 (2015).
- Hubner, B., et al. Remodeling of nuclear landscapes during human myelopoietic cell differentiation maintains co-aligned active and inactive nuclear compartments. Epigenetics Chromatin. 8, 47 (2015).
- Aymard, F., et al. Genome-wide mapping of long-range contacts unveils clustering of DNA double-strand breaks at damaged active genes. Nature Structural & Molecular Biology. 24 (4), 353-361 (2017).
- Sellou, H., et al. The poly(ADP-ribose)-dependent chromatin remodeler Alc1 induces local chromatin relaxation upon DNA damage. Molecular Biology of the Cell. 27 (24), 3791-3799 (2016).
- Krijger, P. H., de Laat, W. Regulation of disease-associated gene expression in the 3D genome. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 17 (12), 771-782 (2016).
- Lupianez, D. G., Spielmann, M., Mundlos, S. Breaking TADs: How Alterations of Chromatin Domains Result in Disease. Trends in Genetics. 32 (4), 225-237 (2016).
- Cortesi, A., et al. 4q-D4Z4 chromatin architecture regulates the transcription of muscle atrophic genes in facioscapulohumeral muscular dystrophy. Genome Research. 29 (6), 883-895 (2019).
- Woltering, J. M., Noordermeer, D., Leleu, M., Duboule, D. Conservation and divergence of regulatory strategies at Hox Loci and the origin of tetrapod digits. PLoS Biology. 12 (1), 1001773 (2014).
- Woltering, J. M., Duboule, D. Tetrapod axial evolution and developmental constraints; Empirical underpinning by a mouse model. Mechanisms of Development. 138, 64-72 (2015).
- de Laat, W., Dekker, J. 3C-based technologies to study the shape of the genome. Methods. 58 (3), 189-191 (2012).
- Denker, A., de Laat, W. The second decade of 3C technologies: detailed insights into nuclear organization. Genes & Development. 30 (12), 1357-1382 (2016).
- Finn, E. H., et al. Extensive Heterogeneity and Intrinsic Variation in Spatial Genome Organization. Cell. 176 (6), 1502-1515 (2019).
- Zheng, M., et al. Multiplex chromatin interactions with single-molecule precision. Nature. 566 (7745), 558-562 (2019).
- Solovei, I. Fluorescence in situ hybridization (FISH) on tissue cryosections. Methods in Molecular Biology. 659, 71-82 (2010).
- Cremer, M., et al. Multicolor 3D fluorescence in situ hybridization for imaging interphase chromosomes. Methods in Molecular Biology. 463, 205-239 (2008).
- Legant, W. R., et al. High-density three-dimensional localization microscopy across large volumes. Nature Methods. 13 (4), 359-365 (2016).
- Jungmann, R., et al. Quantitative super-resolution imaging with qPAINT. Nature Methods. 13 (5), 439-442 (2016).
- Chen, B., et al. Dynamic imaging of genomic loci in living human cells by an optimized CRISPR/Cas system. Cell. 155 (7), 1479-1491 (2013).
- Nelles, D. A., et al. Programmable RNA Tracking in Live Cells with CRISPR/Cas9. Cell. 165 (2), 488-496 (2016).
- Byron, M., Hall, L. L., Lawrence, J. B. A multifaceted FISH approach to study endogenous RNAs and DNAs in native nuclear and cell structures. Current Protocol of Human Genetics. , 15 (2013).
- Chaumeil, J., Augui, S., Chow, J. C., Heard, E. Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation. Methods in Molecular Biology. 463, 297-308 (2008).
- Takizawa, T., Gudla, P. R., Guo, L., Lockett, S., Misteli, T. Allele-specific nuclear positioning of the monoallelically expressed astrocyte marker GFAP. Genes & Development. 22 (4), 489-498 (2008).
- Kraus, F., et al. Quantitative 3D structured illumination microscopy of nuclear structures. Nature Protocols. 12 (5), 1011-1028 (2017).
- Solovei, I., Cremer, M. 3D-FISH on cultured cells combined with immunostaining. Methods in Molecular Biology. 659, 117-126 (2010).
- Skinner, B. M., Johnson, E. E. Nuclear morphologies: their diversity and functional relevance. Chromosoma. 126 (2), 195-212 (2017).
- Schoenfelder, S., et al. The pluripotent regulatory circuitry connecting promoters to their long-range interacting elements. Genome Research. 25 (4), 582-597 (2015).
- Lubeck, E., Cai, L. Single-cell systems biology by super-resolution imaging and combinatorial labeling. Nature Methods. 9 (7), 743-748 (2012).
- Beliveau, B. J., et al. Single-molecule super-resolution imaging of chromosomes and in situ haplotype visualization using Oligopaint FISH probes. Nature Communication. 6, 7147 (2015).
- Beliveau, B. J., et al. Versatile design and synthesis platform for visualizing genomes with Oligopaint FISH probes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (52), 21301-21306 (2012).
- Samacoits, A., et al. A computational framework to study sub-cellular RNA localization. Nature Communication. 9 (1), 4584 (2018).
- Cardozo Gizzi, A. M., et al. Microscopy-Based Chromosome Conformation Capture Enables Simultaneous Visualization of Genome Organization and Transcription in Intact Organisms. Molecular Cell. 74 (1), 212-222 (2019).
- Mateo, L. J., et al. Visualizing DNA folding and RNA in embryos at single-cell resolution. Nature. 568 (7750), 49-54 (2019).
- Nir, G., et al. Walking along chromosomes with super-resolution imaging, contact maps, and integrative modeling. PLoS Genetics. 14 (12), 1007872 (2018).
- Bintu, B., et al. Super-resolution chromatin tracing reveals domains and cooperative interactions in single cells. Science. 362 (6413), (2018).
