JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Genetics

3D Многоцветный инструмент ДНК FISH для изучения ядерной архитектуры в первичных клетках человека

Published: January 25, 2020
doi:
10.3791/60712
, , ,
1Istituto Nazionale di Genetica Molecolare “Romeo ed Enrica Invernizzi”, INGM

Summary

3D многоцветная ДНК FISH представляет собой инструмент для визуализации нескольких геномных локусов в 3D сохранившихся ядрах, однозначно определяя их взаимные взаимодействия и локализацию в ядерном пространстве на уровне одной клетки. Здесь описывается протокол шаг за шагом для широкого спектра первичных клеток человека.

Abstract

Важным вопросом в клеточной биологии является геномная организация в ядерном пространстве и то, как архитектура хроматина может влиять на такие процессы, как экспрессия генов, клеточная идентичность и дифференциация. Многие подходы, разработанные для изучения 3D-архитектуры генома, можно разделить на две взаимодополняющие категории: технологии захвата хромосомы (C-технологии) и визуализации. В то время как первый основан на захвате хромосомы конформации и проксимальных взаимодействий ДНК в популяции фиксированных клеток, последний, основанный на флуоресценции ДНК на месте гибридизации (FISH) на 3D-сохраненных ядер, позволяет современную визуализацию несколько локусов на уровне одной клетки (многоцветный), изучая их взаимодействия и распределение внутри ядра (3D многоцветная ДНК FISH). Техника 3D многоцветной ДНК FISH имеет ограничение визуализации лишь нескольких предопределенных локусов, не позволяя всесторонний анализ ядерной архитектуры. Однако, учитывая надежность его результатов, 3D многоцветная ДНК FISH в сочетании с 3D-микроскопией и реконструкцией изображения является возможным методом проверки результатов на основе C-технологий и однозначного изучения положения и организации конкретных локусов на уровне одной ячейки. Здесь мы предлагаем шаг за шагом метод 3D многоцветной ДНК FISH подходит для широкого спектра основных клеток человека и обсуждаем все практические действия, важные шаги, понятия 3D-изображения и анализа данных, необходимых для получения успешного и информативного 3D многоцветного ДНК FISH в различных биологических контекстах.

Introduction

Высшие эукариоты должны систематически конденсировать и уплотнять огромное количество генетической информации в минуту 3D пространство ядра1,2,3,4. Сегодня мы знаем, что геном пространственно упорядочен в отсеках и топологически связанных областях5 и что несколько уровней сворачивания ДНК генерируют контакты между различными геномными регионами, которые могут включать образование хроматиновых циклов6,7. 3D динамическая петля хроматина может влиять на многие различные биологические процессы, такие как транскрипция8,9,дифференциация и развитие10,11,репарация ДНК12,13, в то время как его возмущения участвуют в различных заболеваниях14,15,16 и дефекты развития15,17,18.

Для изучения организации 3D генома было разработано множество подходов. Хромосомы конформации захвата на основе технологий (C-технологии, 3C, 4C, 5C, Hi-C и производных) были разработаны для изучения организации генома в фиксированных клетках3,4,19,20. Такие подходы основаны на способности захватывать контактные частоты между геномными локусами в физической близости. C-технологии, в зависимости от их сложности, ловят глобальную организацию 3D генома и ядерную топологию популяции клеток3,4,19,20. Тем не менее, 3D взаимодействия являются динамическими во времени и пространстве, весьма изменчивы между отдельными клетками, состоящими из мультиплексных взаимодействий, и широко неоднородны21,22.

3D многоцветная флуоресценция ДНК на месте гибридизации (FISH) является методом, который позволяет визуализации конкретных геномных локусов на уровне одной клетки, что позволяет прямое исследование 3D ядерной архитектуры в дополнение к C-технологий. Он представляет собой технологию, используемую в настоящее время для однозначной проверки C-результатов. 3D многоцветная ДНК FISH использует флуоресцентно маркированные зонды, дополняющие геномные локусовы интересов. Использование различных фторофоров и подходящего микроскопионного оборудования позволяет современную визуализацию нескольких целей в ядерном пространстве23,24. В последние годы FISH был объединен с технологическими достижениями в микроскопии, чтобы получить визуализацию мелкомасштабных структур с высоким разрешением25,26 или с CRISPR-Cas подходы для визуализации нуклеиновых кислот в живой визуализации27,28. Несмотря на широкое внедрение, 3D многоцветный подход DNA FISH по-прежнему считается сложным во многих лабораториях, поскольку используемый биологический материал должен быть адаптирован.

Здесь мы предоставляем всеобъемлющий протокол для 3D многоцветной ДНК FISH (от подготовки клеток/зонда до анализа данных), применимый к широкому кругу первичных клеток человека, что позволяет визуализировать несколько геномных локусов и сохранять 3D-структуру ядер. Для изучения ядерной архитектуры необходимо сохранить трехдернскую структуру ядер. По этой причине, в отличие от других существующих протоколов29,30,31, мы избегаем использования градиента алкоголя и хранения крышки в спирте, которые могут повлиять на структуру хроматина32. Метод адаптирован из сохранившихся 3D-протоколов ДНК FISH24,33, которые будут применяться к широкому кругу первичных клеток человека, как изолированных ex vivo, так и культивируемых in vitro. Существуют параметры пермяки и депротеинации для различных ядерных морфологии и цитологических характеристик (например, разной степени ядерного уплотнения, цитоскелет изобилие)34. Эти параметры часто обычно описаны в других протоколах24,33, без предоставления четкой дискриминации процедуры в различных типах клеток. Кроме того, мы разработали специальный инструмент под названием NuCL’D (ядерный локатор контактов в 3D)16, обеспечивая принципы анализа данных, которые улучшат 3D близость между различными локусами и их ядерное топологическое распределение в ядерном пространстве в автоматизированном режиме.

Protocol

1. Подготовка зонда дна и процедуры маркировки с переводом nick Очистите и очистите и очистите бактериальные искусственные хромосомы (BACs), плазмиды или продукты ПЦР с конкретными комплектами(Таблица материалов),resuspend в ddH2O, проверить электрофорусна на гель агарозы и ко…

Representative Results

Метод 3D многоцветной ДНК FISH, описанный в данной статье, позволяет современную визуализацию различных геномных локусов в сохранившихся 3D ядрах(рисунок 1B). Этот протокол позволяет измерять расстояния между аллелями, и различные геномные loci для того чтобы оценит?…

Discussion

Текущий метод описывает пошагу протокол для выполнения 3D многоцветной ДНК FISH на широком диапазоне первичных клеток человека. Хотя ДНК FISH является технологией широкого использования, 3D многоцветная ДНК FISH на сохранившихся 3D межфазных ядрах по-прежнему трудно выполнить во многих лабор?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы признают техническую помощь INGM Imaging Facility (Istituto Nazionale di Genetica Molecolare “Ромео эд Энрика Инверници” (INGM), Милан, Италия), в частности C. Cordiglieri, за помощь в 3D многоцветных изображений ДНК FISH Приобретение. Эта работа была поддержана следующими грантами Для B.B.: EPIGEN Итальянский флагман программы, Ассоциация Франсез contre les Myopathies (AFM-Telethon, грант nr 18754) и Джовани Ricercatori, Министерство здравоохранения Италии (GR-2011-02349383). Эта работа была поддержана следующим грантом Ф.М.: Fondazione Cariplo (Bando Giovani, грант nr 2018-0321).

Materials

24-well plates Thermo Fisher Scientific 142475
6-well plates Thermo Fisher Scientific 140675
Anti-Digoxigenin 488 DBA DI7488
b-Mercaptoethanol Sigma M3148
bFGF PeproTech 100-18B
Biotin 11 d-UTP Thermo Fisher Scientific R0081
BSA (bovine serum albumine) Sigma A7030
Coverlsips Marienfeld 117500
CY3 d-UTP GE Healthcare PA53022
DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole) Thermo Fisher Scientific D21490
Deoxyribonucleic acids single strand from salmon testes Sigma D7656
Dextran sulfate (powder) Santa Cruz sc-203917A
Digoxigenin 11 d-UTP Roche 11093088910
DMEM Thermo Fisher Scientific 21969-035 500mL
DNA polymerase I Thermo Fisher Scientific 18010-017
DNase I Sigma AMPD1
dNTPs (C-G-A-T) Euroclone BL0423A/C/G
EGF Sigma E9644.2MG
Ethanol Sigma 02860-1L
FBS Hyclone Thermo Fisher Scientific SH30109
Formaldehyde solution Sigma F8775-25mL
Formamide Sigma F9037
Glutammine Thermo Fisher Scientific 25030-024 100mL
Glycerol Sigma G5516-100mL
Glycogen Thermo Fisher Scientific AM9510
HCl Sigma 30721
Human Cot-1 DNA Thermo Fisher Scientific 15279-001
Insulin Human Sigma I9278-5 mL
MgCl2 Sigma 63069
NaAc (Sodium Acetate, pH 5.2, 3 M) Sigma S2889
NaCl Sigma S9888
Paraformaldehyde Sigma 158127-25G
PBS (phosphate-buffered saline) Sigma P4417
Pennycillin/Streptavidin Thermo Fisher Scientific 15070-063 100mL
Pepsin Biorad P6887
PhasePrep BAC DNA Kit Sigma NA0100-1KT
Poly-L-lysine solution Sigma P8920
ProLong Diamond Antifade Mountant Thermo Fisher Scientific P36970
PureLink Quick Gel Extraction & PCR Purification Combo Kit Thermo Fisher Scientific K220001
PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit Thermo Fisher Scientific K210010
RNAse cocktail Thermo Fisher Scientific AM2288
Rubbercement Bostik
Slides VWR 631-0114
Streptavidina Alexa fluor 647 Thermo Fisher Scientific S21374
Tri-Sodium Citrate Sigma 1110379026
Tris-HCl Sigma T3253-500g
Triton X-100 Sigma T8787-250mL
TWEEN 20 Sigma P9416-100mL
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cremer, T., Cremer, C. Chromosome territories, nuclear architecture and gene regulation in mammalian cells. Nature Reviews: Genetics. 2 (4), 292-301 (2001).
  2. Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 326 (5950), 289-293 (2009).
  3. Schmitt, A. D., Hu, M., Ren, B. Genome-wide mapping and analysis of chromosome architecture. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 17 (12), 743-755 (2016).
  4. Bonev, B., Cavalli, G. Organization and function of the 3D genome. Nature Reviews: Genetics. 17 (12), 772 (2016).
  5. van Steensel, B., Furlong, E. E. M. The role of transcription in shaping the spatial organization of the genome. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 20 (6), 327-337 (2019).
  6. Rajarajan, P., Gil, S. E., Brennand, K. J., Akbarian, S. Spatial genome organization and cognition. Nature Reviews: Neuroscience. 17 (11), 681-691 (2016).
  7. Pombo, A., Dillon, N. Three-dimensional genome architecture: players and mechanisms. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 16 (4), 245-257 (2015).
  8. Fanucchi, S., Shibayama, Y., Burd, S., Weinberg, M. S., Mhlanga, M. M. Chromosomal contact permits transcription between coregulated genes. Cell. 155 (3), 606-620 (2013).
  9. Therizols, P., et al. Chromatin decondensation is sufficient to alter nuclear organization in embryonic stem cells. Science. 346 (6214), 1238-1242 (2014).
  10. Gonzalez-Sandoval, A., et al. Perinuclear Anchoring of H3K9-Methylated Chromatin Stabilizes Induced Cell Fate in C. elegans Embryos. Cell. 163 (6), 1333-1347 (2015).
  11. Hubner, B., et al. Remodeling of nuclear landscapes during human myelopoietic cell differentiation maintains co-aligned active and inactive nuclear compartments. Epigenetics Chromatin. 8, 47 (2015).
  12. Aymard, F., et al. Genome-wide mapping of long-range contacts unveils clustering of DNA double-strand breaks at damaged active genes. Nature Structural & Molecular Biology. 24 (4), 353-361 (2017).
  13. Sellou, H., et al. The poly(ADP-ribose)-dependent chromatin remodeler Alc1 induces local chromatin relaxation upon DNA damage. Molecular Biology of the Cell. 27 (24), 3791-3799 (2016).
  14. Krijger, P. H., de Laat, W. Regulation of disease-associated gene expression in the 3D genome. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 17 (12), 771-782 (2016).
  15. Lupianez, D. G., Spielmann, M., Mundlos, S. Breaking TADs: How Alterations of Chromatin Domains Result in Disease. Trends in Genetics. 32 (4), 225-237 (2016).
  16. Cortesi, A., et al. 4q-D4Z4 chromatin architecture regulates the transcription of muscle atrophic genes in facioscapulohumeral muscular dystrophy. Genome Research. 29 (6), 883-895 (2019).
  17. Woltering, J. M., Noordermeer, D., Leleu, M., Duboule, D. Conservation and divergence of regulatory strategies at Hox Loci and the origin of tetrapod digits. PLoS Biology. 12 (1), 1001773 (2014).
  18. Woltering, J. M., Duboule, D. Tetrapod axial evolution and developmental constraints; Empirical underpinning by a mouse model. Mechanisms of Development. 138, 64-72 (2015).
  19. de Laat, W., Dekker, J. 3C-based technologies to study the shape of the genome. Methods. 58 (3), 189-191 (2012).
  20. Denker, A., de Laat, W. The second decade of 3C technologies: detailed insights into nuclear organization. Genes & Development. 30 (12), 1357-1382 (2016).
  21. Finn, E. H., et al. Extensive Heterogeneity and Intrinsic Variation in Spatial Genome Organization. Cell. 176 (6), 1502-1515 (2019).
  22. Zheng, M., et al. Multiplex chromatin interactions with single-molecule precision. Nature. 566 (7745), 558-562 (2019).
  23. Solovei, I. Fluorescence in situ hybridization (FISH) on tissue cryosections. Methods in Molecular Biology. 659, 71-82 (2010).
  24. Cremer, M., et al. Multicolor 3D fluorescence in situ hybridization for imaging interphase chromosomes. Methods in Molecular Biology. 463, 205-239 (2008).
  25. Legant, W. R., et al. High-density three-dimensional localization microscopy across large volumes. Nature Methods. 13 (4), 359-365 (2016).
  26. Jungmann, R., et al. Quantitative super-resolution imaging with qPAINT. Nature Methods. 13 (5), 439-442 (2016).
  27. Chen, B., et al. Dynamic imaging of genomic loci in living human cells by an optimized CRISPR/Cas system. Cell. 155 (7), 1479-1491 (2013).
  28. Nelles, D. A., et al. Programmable RNA Tracking in Live Cells with CRISPR/Cas9. Cell. 165 (2), 488-496 (2016).
  29. Byron, M., Hall, L. L., Lawrence, J. B. A multifaceted FISH approach to study endogenous RNAs and DNAs in native nuclear and cell structures. Current Protocol of Human Genetics. , 15 (2013).
  30. Chaumeil, J., Augui, S., Chow, J. C., Heard, E. Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation. Methods in Molecular Biology. 463, 297-308 (2008).
  31. Takizawa, T., Gudla, P. R., Guo, L., Lockett, S., Misteli, T. Allele-specific nuclear positioning of the monoallelically expressed astrocyte marker GFAP. Genes & Development. 22 (4), 489-498 (2008).
  32. Kraus, F., et al. Quantitative 3D structured illumination microscopy of nuclear structures. Nature Protocols. 12 (5), 1011-1028 (2017).
  33. Solovei, I., Cremer, M. 3D-FISH on cultured cells combined with immunostaining. Methods in Molecular Biology. 659, 117-126 (2010).
  34. Skinner, B. M., Johnson, E. E. Nuclear morphologies: their diversity and functional relevance. Chromosoma. 126 (2), 195-212 (2017).
  35. Schoenfelder, S., et al. The pluripotent regulatory circuitry connecting promoters to their long-range interacting elements. Genome Research. 25 (4), 582-597 (2015).
  36. Lubeck, E., Cai, L. Single-cell systems biology by super-resolution imaging and combinatorial labeling. Nature Methods. 9 (7), 743-748 (2012).
  37. Beliveau, B. J., et al. Single-molecule super-resolution imaging of chromosomes and in situ haplotype visualization using Oligopaint FISH probes. Nature Communication. 6, 7147 (2015).
  38. Beliveau, B. J., et al. Versatile design and synthesis platform for visualizing genomes with Oligopaint FISH probes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (52), 21301-21306 (2012).
  39. Samacoits, A., et al. A computational framework to study sub-cellular RNA localization. Nature Communication. 9 (1), 4584 (2018).
  40. Cardozo Gizzi, A. M., et al. Microscopy-Based Chromosome Conformation Capture Enables Simultaneous Visualization of Genome Organization and Transcription in Intact Organisms. Molecular Cell. 74 (1), 212-222 (2019).
  41. Mateo, L. J., et al. Visualizing DNA folding and RNA in embryos at single-cell resolution. Nature. 568 (7750), 49-54 (2019).
  42. Nir, G., et al. Walking along chromosomes with super-resolution imaging, contact maps, and integrative modeling. PLoS Genetics. 14 (12), 1007872 (2018).
  43. Bintu, B., et al. Super-resolution chromatin tracing reveals domains and cooperative interactions in single cells. Science. 362 (6413), (2018).

Tags

3D Multicolor DNA FISHNuclear ArchitectureGenomic LociChromosome CaptureNick TranslationProbe PrecipitationCell FixationPermeabilizationRNAse Treatment

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Marasca, F., Cortesi, A., Manganaro, L., Bodega, B. 3D Multicolor DNA FISH Tool to Study Nuclear Architecture in Human Primary Cells. J. Vis. Exp. (155), e60712, doi:10.3791/60712 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image