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Genetics

मानव प्राथमिक कोशिकाओं में परमाणु वास्तुकला का अध्ययन करने के लिए 3डी बहुरंगी डीएनए मछली उपकरण

Published: January 25, 2020
doi:
10.3791/60712
, , ,
1Istituto Nazionale di Genetica Molecolare “Romeo ed Enrica Invernizzi”, INGM

Summary

3डी मल्टीकलर डीएनए फिश 3डी संरक्षित नाभिक के भीतर कई जीनोमिक लोकी की कल्पना करने के लिए एक उपकरण का प्रतिनिधित्व करती है, जो एक ही कोशिका स्तर पर परमाणु अंतरिक्ष के भीतर उनकी पारस्परिक बातचीत और स्थानीयकरण को स्पष्ट रूप से परिभाषित करती है। यहां, मानव प्राथमिक कोशिकाओं के एक विस्तृत स्पेक्ट्रम के लिए कदम दर कदम प्रोटोकॉल वर्णित है।

Abstract

सेल जीव विज्ञान में एक बड़ा सवाल परमाणु अंतरिक्ष के भीतर जीनोमिक संगठन है और कैसे क्रोमेटिन वास्तुकला जीन अभिव्यक्ति, सेल पहचान और भेदभाव जैसी प्रक्रियाओं को प्रभावित कर सकता है। जीनोम के 3डी वास्तुकला का अध्ययन करने के लिए विकसित कई दृष्टिकोणों को दो पूरक श्रेणियों में विभाजित किया जा सकता है: गुणसूत्र संरचना कैप्चर आधारित प्रौद्योगिकियों (सी-टेक्नोलॉजीज) और इमेजिंग। जबकि पूर्व निश्चित कोशिकाओं की आबादी में गुणसूत्र संरचना और समीपस्थ डीएनए बातचीत पर कब्जा करने पर आधारित है, बाद, 3 डी संरक्षित नाभिक पर सीटू संकरण (मछली) में डीएनए फ्लोरेसेंस के आधार पर, समकालीन दृश्य की अनुमति देता है एक ही कोशिका स्तर (बहुरंगी) पर कई लोकी, नाभिक (3 डी बहुरंगी डीएनए मछली) के भीतर उनकी बातचीत और वितरण की जांच करती है। 3 डी मल्टीकलर डीएनए फिश की तकनीक में केवल कुछ पूर्व निर्धारित लोकी की कल्पना करने की सीमा है, जो परमाणु वास्तुकला के व्यापक विश्लेषण की अनुमति नहीं देता है। हालांकि, इसके परिणामों की मजबूती को देखते हुए, 3डी-माइक्रोस्कोपी और छवि पुनर्निर्माण के संयोजन में 3डी बहुरंगी डीएनए मछली सी-प्रौद्योगिकी आधारित परिणामों को मान्य करने और विशिष्ट लोकी की स्थिति और संगठन का स्पष्ट रूप से अध्ययन करने के लिए एक संभावित तरीका है एक ही सेल स्तर पर। यहां, हम मानव प्राथमिक कोशिकाओं की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए उपयुक्त 3डी बहुरंगी डीएनए मछली की चरण विधि के कदम से एक कदम का प्रस्ताव करते हैं और एक सफल और सूचनात्मक 3डी मल्टीकलर प्राप्त करने के लिए आवश्यक सभी व्यावहारिक कार्यों, महत्वपूर्ण कदमों, 3डी इमेजिंग की धारणाओं और डेटा विश्लेषण पर चर्चा करते हैं विभिन्न जैविक संदर्भों के भीतर डीएनए मछली।

Introduction

उच्च यूकेरियोट्स को नाभिक1,2, 3,4के 3डी अंतरिक्ष में व्यवस्थित रूप से गाढ़ा और कॉम्पैक्ट करने की आवश्यकता होती है । आज, हम जानते हैं कि जीनोम को डिब्बों और टोपिलॉजिकल रूप से जुड़े डोमेन5 में स्थानिक रूप से आदेश दिया जाता है और डीएनए तह के कई स्तर विभिन्न जीनोमिक क्षेत्रों के बीच संपर्क उत्पन्न करते हैं जिसमें क्रोमेटिन लूप गठन6,7शामिल हो सकता है। क्रोमेटिन की 3डी डायनेमिक लूपिंग कई विभिन्न जैविक प्रक्रियाओं जैसे ट्रांसक्रिप्शन8,9, विभेदन और विकास10,11,डीएनए मरम्मत12,13को प्रभावित कर सकती है, जबकि इसकी क्षोभ विभिन्न बीमारियों में शामिल हैं14,15,16 और विकासात्मक दोष15,17,18.

3डी जीनोम संगठन का अध्ययन करने के लिए कई दृष्टिकोण विकसित किए गए हैं। गुणसूत्र संरचना पर कब्जा आधारित प्रौद्योगिकियों (सी-टेक्नोलॉजीज, 3सी, 4C, 5C, हाय-सी और डेरिवेटिव) को फिक्स्ड कोशिकाओं3,4,19,20में जीनोम संगठन का अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया है । इस तरह के दृष्टिकोण भौतिक निकटता में जीनोमिक लोकी के बीच संपर्क आवृत्तियों पर कब्जा करने की क्षमता पर आधारित हैं। सी-टेक्नोलॉजीज, उनकी जटिलता के आधार पर, वैश्विक 3 डी जीनोम संगठन और एक सेल जनसंख्या3,4,19,20के परमाणु टोपोलॉजी को पकड़ते हैं। फिर भी, 3 डी इंटरैक्शन समय और स्थान में गतिशील होते हैं, मल्टीप्लेक्स इंटरैक्शन से मिलकर व्यक्तिगत कोशिकाओं के बीच अत्यधिक परिवर्तनशील होते हैं, और बड़े पैमाने पर विषम21,22होते हैं।

सीटू संकरण (मछली) में 3डी बहुरंगी डीएनए फ्लोरेसेंस एक तकनीक है जो एक ही कोशिका स्तर पर विशिष्ट जीनोमिक लोकी के दृश्य की अनुमति देती है, जिससे सी-प्रौद्योगिकियों के पूरक तरीके से 3डी परमाणु वास्तुकला की सीधी जांच सक्षम होती है। यह वर्तमान में सी-परिणामों को स्पष्ट रूप से मान्य करने के लिए उपयोग की जाने वाली तकनीक का प्रतिनिधित्व करता है। 3 डी बहुरंगी डीएनए मछली फ्लोरोसेंटी लेबल जांच का उपयोग करता है जो हितों के जीनोमिक लोकी के पूरक हैं। विभिन्न फ्लोरोफोरस और उपयुक्त माइक्रोस्कोपी उपकरणों के उपयोग से परमाणु अंतरिक्ष23,24के भीतर कई लक्ष्यों के समकालीन दृश्य की अनुमति मिल जाती है । हाल के वर्षों में, मछली को माइक्रोस्कोपी में तकनीकी प्रगति के साथ जोड़ा गया है ताकि लाइव इमेजिंग27,28में न्यूक्लिक एसिड के दृश्य के लिए उच्च संकल्प25,26 या CRISPR-कैस दृष्टिकोणों पर ठीक पैमाने की संरचनाओं का दृश्य प्राप्त किया जा सके। व्यापक गोद लेने के बावजूद, 3 डी बहुरंगी डीएनए मछली दृष्टिकोण अभी भी कई प्रयोगशालाओं में मुश्किल माना जाता है क्योंकि जैविक सामग्री का इस्तेमाल किया अनुकूलित किया जाना चाहिए ।

यहां, हम मानव प्राथमिक कोशिकाओं की एक विस्तृत श्रृंखला पर लागू 3डी बहुरंगी डीएनए मछली (सेल/जांच तैयारी से डेटा विश्लेषण तक) के लिए एक व्यापक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं, जिससे कई जीनोमिक लोकी के दृश्य को सक्षम किया जा सकता है और न्यूक्लिकी की 3डी संरचना को संरक्षित किया जा सकता है । परमाणु वास्तुकला का अध्ययन करने के लिए, नाभिक की 3 डी संरचना को संरक्षित किया जाना चाहिए। इस कारण से, अन्य मौजूदा प्रोटोकॉल29,30,31के विपरीत, हम अल्कोहल ढाल के उपयोग और अल्कोहल में कवरस्लिप के भंडारण से बचते हैं जो क्रोमेटिन संरचना32को प्रभावित कर सकता है। विधि संरक्षित 3 डी डीएनए मछली प्रोटोकॉल24,33 से अनुकूलित किया जाता है मानव प्राथमिक कोशिकाओं की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए लागू किया जाना है, दोनों अलग पूर्व वीवो या विट्रो में सुसंस्कृत । विभिन्न परमाणु आकृति विज्ञान और साइटोलॉजिकल विशेषताओं (जैसे, परमाणु कॉम्पैक्टेशन की विभिन्न डिग्री, साइटोस्केलेटन बहुतायत)34के लिए पार्मेबिलाइजेशन और डिप्रोटीनाइजेशन पैरामीटर हैं। इन मापदंडों को अक्सर अन्य प्रोटोकॉल24,33में वर्णित किया जाता है, विभिन्न सेल प्रकारों के भीतर प्रक्रिया का स्पष्ट भेदभाव प्रदान किए बिना। इसके अलावा, हमने 16 में NuCLεD (3D में परमाणु संपर्क लोकेटर)16नाम का एक विशिष्ट उपकरण विकसित किया है, जो डेटा विश्लेषण के लिए सिद्धांत प्रदान करता है जो स्वचालित तरीके से परमाणु अंतरिक्ष के भीतर विभिन्न लोकी और उनके परमाणु स्थलीय वितरण के बीच 3डी निकटता में सुधार करेगा।

Protocol

1. डीएनए जांच की तैयारी और निक अनुवाद के साथ लेबलिंग प्रक्रियाओं बैक्टीरियल कृत्रिम गुणसूत्रों (BACs), प्लाज्मिड या पीसीआर उत्पादों को विशिष्ट किट(सामग्री की तालिका)के साथ शुद्ध और साफ करें, डीड?…

Representative Results

इस लेख में वर्णित 3डी बहुरंगी डीएनए मछली की विधि संरक्षित 3 डी नाभिक(चित्रा 1बी)के भीतर विभिन्न जीनोमिक लोकी के समकालीन दृश्य की अनुमति देती है। यह प्रोटोकॉल एलील्स और विभिन्न जीनोमिक ?…

Discussion

वर्तमान विधि मानव प्राथमिक कोशिकाओं की एक विस्तृत श्रृंखला पर 3 डी बहुरंगी डीएनए मछली प्रदर्शन करने के लिए कदम प्रोटोकॉल द्वारा एक कदम का वर्णन करती है। हालांकि डीएनए मछली व्यापक उपयोग में एक तकनीक है…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

लेखक 3डी मल्टीकलर डीएनए फिश छवियों के दौरान सहायता के लिए विशेष रूप से सी कॉर्डिग्नेरी में इंग्म इमेजिंग फैसिलिटी (इस्टूटो नाजिओनेल डी जेनेटिका मोल्कोलारे “रोमियो एड एनरिका इनवर्नेज़ी” (INGM), मिलान, इटली की तकनीकी सहायता स्वीकार करते हैं अधिग्रहण. इस काम को बी बी को निम्नलिखित अनुदानों द्वारा समर्थित किया गया है: एपिजेन इतालवी फ्लैगशिप प्रोग्राम, एसोसिएशन फ्रैंकोइस कॉन्ट्रे लेस मायोपैथीज (एएफएम-टेलीथॉन, ग्रांट एनआर 18754) और जियोवानी राइसरकाटोरी, इतालवी स्वास्थ्य मंत्रालय (जीआर-2011-02349383)। इस काम को F.M.: फोंडाजिओन कैरिप्लो (बंदो जियोवानी, अनुदान एनआर 2018-0321) को निम्नलिखित अनुदान द्वारा समर्थित किया गया है।

Materials

24-well plates Thermo Fisher Scientific 142475
6-well plates Thermo Fisher Scientific 140675
Anti-Digoxigenin 488 DBA DI7488
b-Mercaptoethanol Sigma M3148
bFGF PeproTech 100-18B
Biotin 11 d-UTP Thermo Fisher Scientific R0081
BSA (bovine serum albumine) Sigma A7030
Coverlsips Marienfeld 117500
CY3 d-UTP GE Healthcare PA53022
DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole) Thermo Fisher Scientific D21490
Deoxyribonucleic acids single strand from salmon testes Sigma D7656
Dextran sulfate (powder) Santa Cruz sc-203917A
Digoxigenin 11 d-UTP Roche 11093088910
DMEM Thermo Fisher Scientific 21969-035 500mL
DNA polymerase I Thermo Fisher Scientific 18010-017
DNase I Sigma AMPD1
dNTPs (C-G-A-T) Euroclone BL0423A/C/G
EGF Sigma E9644.2MG
Ethanol Sigma 02860-1L
FBS Hyclone Thermo Fisher Scientific SH30109
Formaldehyde solution Sigma F8775-25mL
Formamide Sigma F9037
Glutammine Thermo Fisher Scientific 25030-024 100mL
Glycerol Sigma G5516-100mL
Glycogen Thermo Fisher Scientific AM9510
HCl Sigma 30721
Human Cot-1 DNA Thermo Fisher Scientific 15279-001
Insulin Human Sigma I9278-5 mL
MgCl2 Sigma 63069
NaAc (Sodium Acetate, pH 5.2, 3 M) Sigma S2889
NaCl Sigma S9888
Paraformaldehyde Sigma 158127-25G
PBS (phosphate-buffered saline) Sigma P4417
Pennycillin/Streptavidin Thermo Fisher Scientific 15070-063 100mL
Pepsin Biorad P6887
PhasePrep BAC DNA Kit Sigma NA0100-1KT
Poly-L-lysine solution Sigma P8920
ProLong Diamond Antifade Mountant Thermo Fisher Scientific P36970
PureLink Quick Gel Extraction & PCR Purification Combo Kit Thermo Fisher Scientific K220001
PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit Thermo Fisher Scientific K210010
RNAse cocktail Thermo Fisher Scientific AM2288
Rubbercement Bostik
Slides VWR 631-0114
Streptavidina Alexa fluor 647 Thermo Fisher Scientific S21374
Tri-Sodium Citrate Sigma 1110379026
Tris-HCl Sigma T3253-500g
Triton X-100 Sigma T8787-250mL
TWEEN 20 Sigma P9416-100mL
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References

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Marasca, F., Cortesi, A., Manganaro, L., Bodega, B. 3D Multicolor DNA FISH Tool to Study Nuclear Architecture in Human Primary Cells. J. Vis. Exp. (155), e60712, doi:10.3791/60712 (2020).
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