Summary
3D çok renkli DNA FISH, 3B korunmuş çekirdekler içinde birden fazla genomik loci görselleştirmek için bir araç temsil eder, kesin olarak tek bir hücre düzeyinde nükleer alan içinde karşılıklı etkileşimleri ve lokalizasyon tanımlayan. Burada, adım protokol bir adım insan birincil hücrelerin geniş bir yelpazede için açıklanmıştır.
Abstract
Hücre biyolojisinde önemli bir soru nükleer uzay içinde genomik organizasyon ve kromatin mimarisinin gen ekspresyonu, hücre kimliği ve farklılaşma gibi süreçleri nasıl etkileyebildiğidir. Genomun 3Boyutlu mimarisini incelemek için geliştirilen birçok yaklaşım iki tamamlayıcı kategoriye ayrılabilir: kromozom konformasyon yakalama tabanlı teknolojiler (C-teknolojileri) ve görüntüleme. Eski sabit hücrelerin bir popülasyonkromozom konformasyonve proksimal DNA etkileşimleri yakalama dayalı iken, ikinci, 3D korunmuş çekirdekleri üzerinde yerinde hibridizasyon DNA floresandayalı (FISH) çağdaş görselleştirme sağlar tek bir hücre düzeyinde birden fazla loci (çok renkli), çekirdek (3D çok renkli DNA FISH) içinde etkileşimleri ve dağılımı inceleyerek. 3D çok renkli DNA FISH tekniği nükleer mimarinin kapsamlı bir analiz izin değil, sadece birkaç önceden belirlenmiş loci görselleştirme bir sınırlama vardır. Ancak, sonuçlarının sağlamlığı göz önüne alındığında, 3D-mikroskopi ve görüntü rekonstrüksiyonu ile birlikte 3D çok renkli DNA FISH C-teknoloji tabanlı sonuçları doğrulamak ve belirli lokus pozisyon ve organizasyon açık bir şekilde çalışma için olası bir yöntemdir tek bir hücre düzeyinde. Burada, insan birincil hücrelerin geniş bir yelpazede için uygun 3D çok renkli DNA FISH adım yöntemi ile bir adım önermek ve tüm pratik eylemler, önemli adımlar, 3D görüntüleme ve veri analizi kavramları başarılı ve bilgilendirici 3D çok renkli elde etmek için gerekli tartışmak FARKLı biyolojik bağlamlarda DNA FISH.
Introduction
Yüksek ökaryotlar sistematik olarak yoğunlaştırmak ve çekirdek1dakika 3D alanda genetik bilgi büyük miktarda sıkıştırmak gerekir1 ,2,3,4. Bugün, genomun mekansal olarak bölmelerde ve topolojik olarak ilişkili etki alanlarında 5 sıralı olduğunuve DNA katlama nın birden fazla seviyesinin kromatin döngüoluşumunuiçerebilecek farklı genomik bölgeler arasında temas lar oluşturduğunubiliyoruz. Kromatin 3D dinamik döngü transkripsiyon8gibi birçok farklı biyolojik süreçleri etkileyebilir,9, farklılaşma ve geliştirme10,11, DNA onarım12,13, onun pertürbations çeşitli hastalıklarda yer alırken14,15,16 ve gelişimsel bozukluklar15,17,18.
3D genom organizasyonunu incelemek için birçok yaklaşım geliştirilmiştir. Kromozom konformasyon yakalama tabanlı teknolojiler (C-teknolojileri, 3C, 4C, 5C, Hi-C ve türevleri) sabit hücrelerde genom organizasyonu çalışmak için geliştirilmiştir3,4,19,20. Bu tür yaklaşımlar, genomik loci ler arasındaki temas frekanslarını fiziksel yakınlıkta yakalayabilme yeteneğine dayanır. C-teknolojileri, kendi karmaşıklığına bağlı olarak, küresel 3D genom organizasyonu ve bir hücre popülasyonunun nükleer topoloji yakalamak3,4,19,20. Bununla birlikte, 3D etkileşimleri zaman ve mekan dinamik, multipleks etkileşimleri oluşan bireysel hücreler arasında son derece değişken, ve yaygın heterojen21,22.
3D çok renkli DNA floresans in situ hibridizasyon (FISH) belirli genomik lokusların tek hücre düzeyinde görüntülenmesine olanak tanıyan ve 3D nükleer mimarinin C teknolojilerine tamamlayıcı bir şekilde doğrudan araştırılmasını sağlayan bir tekniktir. Şu anda C sonuçlarını kesin olarak doğrulamak için kullanılan bir teknolojiyi temsil eder. 3D çok renkli DNA FISH, floresan olarak etiketlenmiş problar kullanır. Farklı floroforların ve uygun mikroskopi ekipmanlarının kullanımı, nükleer alan daki birden fazla hedefin çağdaş bir şekilde görüntülenmesine olanak sağlar23,24. Son yıllarda, FISH yüksek çözünürlüklü ince ölçekli yapıların görselleştirme elde etmek için mikroskobik teknolojik gelişmeler ile kombine edilmiştir25,26 veya canlı görüntüleme nükleik asitlerin görselleştirilmesi için CRISPR-Cas yaklaşımlarıile 27,28. Geniş benimsenmesine rağmen, kullanılan biyolojik malzeme adapte edilmelidir, çünkü 3D çok renkli DNA FISH yaklaşımı hala birçok laboratuvarda zor kabul edilir.
Burada, birden fazla genomik lokusgörselleştirme sağlayan ve çekirdeklerin 3D yapısını koruyarak, insan birincil hücrelerin geniş bir yelpazede uygulanabilir 3D çok renkli DNA FISH (hücre / sonda hazırlama veri analizi) için kapsamlı bir protokol sağlar. Nükleer mimariyi incelemek için çekirdeklerin 3 Boyutlu yapısı korunmalıdır. Bu nedenle, diğer mevcut protokoller29aksine,30,31, biz bir alkol gradyan kullanımı ve kromatin yapısını etkileyebilir alkol kapakları depolama önlemek32. Yöntem korunmuş 3D DNA FISH protokolleri uyarlanmıştır24,33 insan birincil hücrelerin geniş bir yelpazede uygulanacak, hem izole ex vivo veya in vitro kültürlü. Farklı nükleer morfoloji ve sitolojik özellikler için permeabilizasyon ve deproteinizasyon parametreleri vardır (örneğin, farklı nükleer sıkıştırma dereceleri, sitoiskelet bolluğu)34. Bu parametreler genellikle diğer protokollerde açıklanan24,33, farklı hücre türleri içinde prosedür net bir ayrımcılık sağlamadan. Ayrıca, nuclεD (3D nükleer temas bulucu)16adlı özel bir araç geliştirdi, otomatik bir şekilde nükleer alan içinde farklı loci ve nükleer topolojik dağılımı arasındaki 3D yakınlık artıracak veri analizi için ilkeler sağlayan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. NICK çevirisi ile DNA sondası hazırlama ve etiketleme prosedürleri
- ArındırMak ve temiz bakteriyel yapay kromozomlar (BACs), plazmidler veya pcr ürünleri belirli kitleri ile(Malzeme Tablosu),ddH2O resuspend, bir agarose jel üzerinde elektroforez tarafından kontrol ve nicel.
- Tablo1'e göre 0,5 mL düşük bağlayıcı DNA tüpündeki tüm reaktifleri karıştırarak 50°L'lik son hacimde 1,5−2 μg DNA'dan 1,5−2 μg'lik DNA çevirisi yapın.
NOT: Doğrudan etiketlenmiş problar sinyalin gürültü oranını artırabilir. Nick çevirisi ile çeşitli Alexa florokromları ile dolaylı ve doğrudan etiketli problar üretmek için kitleri ticari olarak mevcuttur. - Başlangıç DNA malzemesinin uzunluğuna bağlı olarak 16 °C'de bir termal mikserde nick çeviri karışımını kuluçkaya yatırın: PCR ürünleri için 45 dk (her biri 2.000 bp PCR ürün havuzu) ve BAC DNA ve plazmidler için 4 saate kadar.
- %2.2 agarose jel üzerinde elektroforez tarafından adım 1.3 üretilen probların boyutunu kontrol edin.
NOT: En uygun prob boyutu <200 bp(Şekil 1A).- DNA yeterince sindirilmemişse, reaksiyona 5 U U ve 0.05 U DNase I ekleyin ve 16 °C'de 1−2 saat kuluçkaya yatırın ve daha sonra tekrar kontrol edin. Reaksiyonu 0,5 mM EDTA (son konsantrasyon) ile durdurun. Probları -20 °C'de saklayın.
- Her DNA FISH deneyi için, probların üretildiği başlangıç DNA materyaline bağlı olarak aşağıdaki prob miktarlarını çökeltin: nick çevrilmiş PCR ürünlerinden 200 ng, nick çevrilmiş BAC'lerden 100 ng veya nick tercüme li plazmidden 300 ng. DDH2O'dan 150 μL'ye kadar, 20 μg etiketsiz somon spermi DNA'sı, 3,5 μg türe özgü Cot-1 DNA'sı, 3 cilt %100 EtOH ve 1/10 hacim 3 M sodyum asetat pH 5.2 ekleyin. 1 saat için -80 °C'de çökeltin.
- 4 °C'de 1 saat maksimum hızda santrifüj ve supernatant atın. Peleti %70 EtOH ile iki kez yıkayın.
- Peleti 2 μL%100 formamid pH 7.0'da yeniden askıya alın, 40 °C'de 30 dakika sallayın (birkaç saate kadar sürebilir) ve daha sonra eşit hacimde 4x tuzlu-sodyum sitrat (SSC)/%20 dekstran sülfat ekleyin.
- 1 75,3 g NaCl ve 88,2 g sodyum sitrat 1 L H2O. Otoklav, filtre ve aliquots son hacminde karıştırarak 20x SSC hazırlayın.
NOT: Çok renkli DNA FISH için, farklı problar birbirleri ile anneal olabilir problar dışında birlikte çökelti olabilir. Bu özel durumlarda, bunları ayrı ayrı ele alın, prob sayısına göre 1,5−1.7 adımlarında belirtilen reaktifleri bölen probları çökeltin ve yeniden askıya alın. Probları ancak formamide yeniden süspansiyon dan sonra birleştirin. 10 mm'den büyük veya 10 mm'den küçük cam kapaklar kullanılıyorsa, slayt boyutuyla orantılı olarak 1,5−1,7 adımlarında kullanılan reaktiflerin hacmini yukarı veya aşağı ölçeklendirin. Hibridizasyon probları -20 °C'de uzun bir süre (en fazla iki ay) saklanabilir.
- 1 75,3 g NaCl ve 88,2 g sodyum sitrat 1 L H2O. Otoklav, filtre ve aliquots son hacminde karıştırarak 20x SSC hazırlayın.
2. Hücre fiksasyonu, ön arıtma ve permeabilizasyon
NOT: Permeabilizasyon ve deproteinizasyon pasajları önemli adımlardır. Reaktiflerin reaksiyon ve konsantrasyon süresi güçlü hücre tipine bağlıdır, sitoplazma bolluğu, ve nükleer morfoloji.
- İnsan primer T lenfositleri için hücre fiksasyonu, ön tedavi ve permeabilizasyon
NOT: Bu protokol küçük çekirdekleri ve düşük miktarda sitoplazmaile küçük hücreler için uygundur.- Cam kapaklar kullanın (10 mm, kalınlık No. 1.5H).
- Camları ddH2O ile yıkayın, sonra %70 EtOH ile ve kurumasına izin verin. 24 kuyuluk bir plakanın her kuyusu için bir bardak kullanın.
- 200 μL%0.1 poli-L-l-lizin (w/v)(Malzeme Tablosu)doğrudan camın üzerine bir damla oluşturacak şekilde ekleyin. Damla 2−5 dk. Kuyuya dokunmadan cam yüzeyde kalmalı.
- Adım 2.1.3'u iki kat daha gerçekleştirin.
- 200 μL süspansiyon hücresi (2 x 106/mL, ex vivo primer T lenfositlerin PBS süspansiyonu) doğrudan cama koyun, hücrelerin oda sıcaklığında (RT) 30 dakika boyunca tohumatmasını bekleyin.
- Damlayı hızla çıkarın. 10 dakika için taze yapılmış% 4 PFA (PBS/0.1% TWEEN 20, pH 7.0, filtrelenmiş olarak hazırlanan) ekleyin ve RT de tohumlu hücreleri düzeltmek.
- RT'de %0,05 Triton X-100/PBS (TPBS) ile 5 dk için üç kez yıkayın.
- 250 μL PBS/well'e 250 μL PBS/well'e 37 °C'de 1 saat boyunca 24 kuyulu bir tabla 2,5 μL RNase kokteyli(Malzeme Tablosu)ekleyerek RNase tedavisini gerçekleştirin.
- PBS'de durulayın, %20 gliserol/PBS ekleyin ve 4 °C'de geceleme (ON) ekleyin.
NOT: Bu adım 1 saat ile ON arasında değişebilir. Slaytlar 4 °C'de %20 gliserol/PBS'de 7 güne kadar tutulabilir. - Kuru buzda donma (15−30 s), RT'de yavaş yavaş çözülün ve %20 gliserol/PBS ile ıslatın. Adımı tekrarlayın 2.1.9 başka üç kez.
- 5 dakika boyunca %0,5 TPBS'de yıkayın. %0,05 TPBS'de yıkayın, 5 dakika boyunca IKI kez RT. Incubate incubate in cubate in cubate 0,1 N HCl için 12 dk RT. Rinse 2x SSC'de.
- RT'de %50 formamid pH 7.0/2x SSC ON'da kuluçka.
NOT: Kuluçka süresi optimize edilebilir ve sonunda azaltılabilir. Slaytlar birkaç gün boyunca % 50 formamid/2x SSC'de tutulabilir.
- İnsan primer miyoblastları için hücre fiksasyonu, ön tedavi ve permeabilizasyon
NOT: Bu protokol, yüksek miktarda sitoplazma içeren büyük hücreler için uygundur.- Büyüme ortamında (Dulbecco'nun modifiye Kartal orta (DMEM), %20 fetal sığır serumu (FBS), 25 ng/mL fibroblast büyüme faktörü (FGF), 10 ng/mL epidermal büyüme faktörü (EGF), 10 μg/mL insan insülini, 1x glutamin, 1x penisilin/streptomisin) en az 24 saat (birleşmenin %50−70'ine ulaşır).
NOT: Yapışmayı kolaylaştırmak için, jelatin veya kollajen veya poli-L-lizin tohumlama dan önce kapak kaplamak için kullanılabilir. - PBS'nin 2−3'lük değişikliklerinde hücreleri durula. Taze yapılmış% 4 PFA ekleyin ve RT 10 dakika hücreleri düzeltmek.
- RT'de %0,01 TPBS'de 3 dk için üç kez yıkayın.
- 250 μL PBS/well'e 250 μL PBS/well'e 37 °C'de 1 saat boyunca 24 kuyulu bir tabla 2,5 μL RNase kokteyli(Malzeme Tablosu)ekleyerek RNase tedavisini gerçekleştirin.
- PBS durulayın,% 20 gliserol / PBS ekleyin ve RT de ON inkübat.
NOT: Bu adım 1 saat ile ON arasında değişebilir. Slaytlar 4 °C'de %20 gliserol/PBS'de 7 güne kadar tutulabilir. - Kuru buzda donma (15−30 s), RT'de yavaş yavaş çözülün ve %20 gliserol/PBS ile ıslatın. Bu adımı üç kez tekrarlayın.
- PBS'de her biri 10 dakika boyunca üç kez yıkayın. 2x SSC'de RT. Rinse'de 5 dk için 0,1 N HCl inkübat.
- RT'de %50 formamid pH 7.0/2x SSC ON'da kuluçka.
NOT: Kuluçka süresi optimize edilebilir ve sonunda azaltılabilir. Slaytlar birkaç gün boyunca % 50 formamid/2x SSC'de tutulabilir. - 2 dakika boyunca 2x SSC'de slaytları (%50 formamid/2x SSC'de tutulur) dengeleyin. Daha sonra PBS'de 3 dk.
- Hücre tipine bağlı olarak birkaç saniyeden 5 dakikaya kadar %0.01 N HCl/0.0025% pepsin ile tedavi edin. Bu adımda, hücreleri optik mikroskop altında gözlemleyin ve çekirdekler sitoplazmadan kurtulur kurtulmaz reaksiyonu durdurun (örneğin, nükleoller hala görünür ve sağlam).
- Pepsin'i 50 mM MgCl2/PBS'de her biri 5 dakika boyunca iki kez yıkayarak inaktive edin.
- 1 dk. PBS'de 5 dk için %1 PFA/PBS'de düzeltme sonrası. 2x SSC'de 5 dakika boyunca iki kez yıkayın ve en az 30 dakika boyunca %50 formamid/2x SSC ekleyin.
- Büyüme ortamında (Dulbecco'nun modifiye Kartal orta (DMEM), %20 fetal sığır serumu (FBS), 25 ng/mL fibroblast büyüme faktörü (FGF), 10 ng/mL epidermal büyüme faktörü (EGF), 10 μg/mL insan insülini, 1x glutamin, 1x penisilin/streptomisin) en az 24 saat (birleşmenin %50−70'ine ulaşır).
3. 3D çok renkli DNA FISH hibridizasyon
- 5 dakika boyunca 80 °C'de probları dennature ve sonra buz üzerinde hızlı bir şekilde koymak.
- Hibritleştirme problarını temiz bir mikroskop slaytına yükleyin. Melezleştirme problarının düşmesi üzerine hücrelerle birlikte kapağı ters çevirin.
- Kapağı kauçuk çimentoyla kapatın. Kauçuk çimento tamamen kuruolsun. Daha sonra bir ısıtma bloğuna kaydırışlar yerleştirin ve 75 °C'de 4 dk.
NOT: Denatürasyon zamanlaması ve denatürasyon sıcaklığı 80 °C'ye kadar artırılabilir. - Su banyosunda yüzen metalik bir kutuda 37 °C'de hibritleştirin.
NOT: Sinyalin gürültü oranını artırmak için hibridizasyon sıcaklığı 42 °C'ye kadar çıkabilir. - Kauçuk çimento soyma, 2x SCC slaytlar batırın, cam kapak kapalı şerit ve 6-iyi plaka 2x SSC aktarın.
- 37 °C'de 5 dakika boyunca 2x SSC'de üç kez yıkayın, bir kuluçka makinesishake'de 90 rpm'de titreyin. 0.1x SSC'de 60 °C'de 5 dakika boyunca üç kez yıkayın, bir kuvöz çalkalayıcıda 90 rpm'de titreyin. 4x SSC/0.2% TWEEN 20 kısa bir süre durula.
4. 3D çok renkli DNA FISH algılama
NOT: Doğrudan etiketlenmiş problar için 4.1 ve 4.2 adımlarını atlayın.
- Blok 4x SSC/0.2% TWEEN 20/4% sığır serum albumin (BSA) 20 dakika 37 °C 24-iyi plaka, bir kuvöz shaker 20 rpm sallayarak.
- Uygun anti-digoksijenin konsantrasyonu ile inkübat (1:150), ve/veya streptavidin (1:1,000)(Malzeme Tablosu)4x SSC/%0.2 TWEEN %20/4 BSA'da 37 °C'de karanlık ve ıslak bir odada 35 dakika boyunca seyreltilir.
- 4x SSC/0.2% TWEEN 20 37 °C'de 5 dakika her biri için üç kez yıkayın, bir kuluçka çalkalayıcı bir 6-iyi plaka 90 rpm sallayarak.
- 24-iyi plaka rt 2 dakika için% 2 formaldehit / PBS PBS PBS ve post-fix denge.
NOT: Doğrudan etiketlenmiş probların fiksasyon sonrası gerekmez. - PBS'de 5 x kısa bir süre yıkayın. 1 ng/mL DAPI (4,6-diamidino-2-fenilindole)/Rt'de 5 dk pbs ile leke.
- PBS'de 5 x kısa bir süre yıkayın. Antifade çözeltisi ile montaj (Malzeme Tablosu).
5. 3D çok renkli DNA FISH mikroskopisi ve analizi
- Mikroskop sistemi yle 3Boyutlu görüntüler edinin.
NOT: Burada ardışık kesitler arasında eksenel uzaklığı 0.2−0.25 m olan geniş alan mikroskobu(Şekil 1B)kullanılır. - Farklı yazılım ve araçları kullanarak 3B görüntü yığınlarını analiz edin (burada, NuCLεD veya 3D Nükleer Kontaklar Bulucu).
NOT: Araç NuCLεD otomatik olarak floresan hücre görüntüsü z-yığınları 3D çok renkli DNA FISH analiz etmek için geliştirilmiştir. NuCLεD, hücre görüntü yığınlarındaki çekirdekleri 3B olarak yeniden yapılandırırken floresan 3B noktaları algılar ve yerelleştirir. Çekirdekteki noktaların göreli konumlandırmasını (örn. çekirdeğin centroid'inden ve/veya çekirdeğin çevresine uzaklığı) ve her çekirdek ve noktalar arası uzaklıklar için maksimum yarıçapı ölçer. Kullanılan araç ve algoritma cortesi ve ark.16'datam olarak tanımlanmıştır. - NuCLεD tarafından alınan verileri (örneğin, belirtilen genomik loci ile nükleer merkezve temas frekansları arasındaki 3B mesafeler) analiz edin.
NOT: Belirtilen genomik loci ile nükleer merkezci arasındaki 3B mesafeler için, her çekirdek için maksimum yarıçapüzerindeki mesafeleri normalleştirin ve bu verileri nükleer merkezciyi normalleştirilmiş uzaklıkların frekans dağılımları olarak temsil edin. Uzun menzilli etkileşim çalışmaları için, temas frekansları 10−20%21 aralığında değişebilir ve 2 μm35civarında konabilir bir eşik inter-mesafe ile olması gerekiyordu.- İstatistiksel analiz yapmak için, biyolojik çoğaltma başına yaklaşık 100 çekirdeği analiz edin. Belirtilen genomik loci arasındaki 3B mesafeleri, seçilen eşik arası mesafenin altında olan mesafelerin kümülatif frekans dağılımları olarak temsil eder ve dağılımlarda farklılıkların önemini değerlendirmek için t-testikullanır. Ayrıca, seçilen eşik ara mesafenin altındaki etkileşimler için pozitif çekirdeklerin yüzdesini hesaplayın ve yüzdeler arasındaki farklılıkların önemini değerlendirmek için Fisher'ın tam testini kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu makalede açıklanan 3D çok renkli DNA FISH yöntemi korunmuş 3D çekirdekleri içinde farklı genomik lokus çağdaş görselleştirme sağlar(Şekil 1B). Bu protokol, aleller arasındaki mesafelerin ölçülmesine izin verir, ve farklı genomik loci onların mekansal yakınlık değerlendirmek için, ve nükleer uzay içinde konumlarını değerlendirmek için (örneğin, centroid veya çekirdeklerin çevresi loci mesafe)16. Ancak, kullanılan her hücre türü için doğru ve özel olarak ayarlanılması gereken birçok önemli adım vardır; 3D çok renkli DNA FISH'in başarısı için aşağıdaki adımlara özellikle dikkat etmek önemle tavsiye edilir.
DNA sondası hazırlama için sonda boyutunun <200 bp (Şekil 1A)olup olmadığını kontroledin. Bu boyut 3D çok renkli DNA FISH(Şekil 1B)başarılı bir işlem sağlar. Nick çevirisi ile üretilen suboptimal DNA FISH probları kısmen sindirilebilir (Şekil 2A) veya üzerinde sindirilmiş (Şekil 2B). Kısmen sindirilmiş problarda, probun çekirdeklere girememesi ve tamamlayıcı genomik lokusu düzgün bir şekilde melezleşememesi nedeniyle işlem hücrelerde sinyal olmayacaktır. Sindirilmiş problar üzerinde hibridizasyon özgüllük kaybı ve arka plan sonucu bir artış nedeniyle, nonspesifik bir sinyal neden olacaktır. Sindirilmiş probların temsili bir örneği Şekil 3B'dekien uygun sindirilmiş probunkarşılaştırıldığında Şekil 3A'da gösterilmiştir.
Deproteinizasyon ve pepsinizasyon için hücre tipine göre aşağıdaki adımları uygulayın. Özellikle, dikkate nükleer boyutu ve sitoplazma bolluğu. İnsan primer ex vivo izole T lenfositler ve küçük, son derece sıkıştırılmış çekirdekleri ve düşük bol sitoplazma ile hücreler için, HCl deproteinizasyon çok önemlidir. 5 dk için 0.1 N HCl ile tedavi DNA FISH görselleştirme için yeterli değildir. 12 dk için 0,1 N HCl tedavisi DNA problarına çekirdek erişilebilirliğini teşvik etmek ve nükleer bütünlüğü korumak için tavsiye edilir(Şekil 4A). Sitoplazmanın pepsin sindirimi, DNA FISH'in iyi bir sinyalini elde etmek için gerekli değildir (Şekil 4B).
Büyük çekirdekleri ve bol sitoplazmaya sahip insan primer miyoblastları ve hücreleri için pepsinizasyon adımı esastır. Sitoiskeletin kısa ve suboptimal pepsinizasyonu, sondanın çekirdeklere girişini engelleyecektir(Şekil 4C),DNA FISH sinyalinin yokluğunda sona erer. Ancak, hücreler pepse üzerinde ise, çekirdekleri bozulmadan kalmaz(Şekil 4D),onların 3D yapısını kaybeder. Şekil 4E'debaşarılı 3D çok renkli DNA FISH örneği verilmiştir.
Hibridizasyon sırasında, coverslip'i doğru bir şekilde kapatın; aksi takdirde, sonda dağılır ve kurur. Denatürasyon ve hibridizasyon adımları, prob ve genomik DNA'nın reanneal olmaması için hızlı bir şekilde yapılmalıdır. Denatürasyon süresi artırılabilir.
Şekil 1: Temsili DNA sondaları ve 3D çok renkli DNA FISH. (A) Nick, optimal boyuttaki DNA sondalarını %2,2'lik agarose jel (şerit 1, 2), 50 bp marker (M) üzerinde çevirmiştir. (B) Temsili 3D çok renkli DNA FISH çekirdeği insan birincil miyoblastlarda 3q11.2 bölgesine (yeşil), 10q26.3 bölgeye (kırmızı) ve 8q24.13 bölgeye (macenta) haritalama probları kullanarak. Çekirdekler DAPI (mavi) ile sayaçlı. 63x büyütme. Ölçek çubuğu = 5 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: En iyi şekilde sindirilmemiş DNA FISH sondalarına örnekler. (A) Sindirilmemiş (şerit 1, 2) veya kısmen sindirilmiş (şerit 3) nick çevrilmiş DNA probları %2.2 agarose jel, 2log marker (M) üzerinde çalışır. (B) Üzerinde sindirilmiş nick çevrilmiş DNA probları üzerinde çalışan 2.2% agarose jel, 2log marker (M). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Suboptimal veya optimal DNA FISH probları kullanılarak 3D çok renkli DNA FISH karşılaştırılması. (A) Temsili 3D çok renkli DNA FISH çekirdekleri insan birincil miyoblastlarda 8q24.13 bölgeye (macenta) sindirilmiş sonda haritalama üzerinde kullanarak. Çekirdekler DAPI (mavi) ile sayaçlı. 63x büyütme. Ölçek çubuğu = 10 μm. (B) Temsili 3D çok renkli DNA FISH çekirdekleri insan primer miyoblastlarda 8q24.13 bölgesine (macenta) en iyi şekilde sindirilmiş prob haritalamasını kullanır. Çekirdekler DAPI (mavi) ile sayaçlı. 63x büyütme. Ölçek çubuğu = 10 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: 3D çok renkli DNA FISH sonuçlarında suboptimal deproteinizasyon ve pepsinizasyon adımlarının olası sonuçları. (A) Temsili 3D çok renkli DNA FISH çekirdekleri insan birincil T lenfositler için tedavi 5 dakika (sol) veya 12 dk (sağ) 0.1 N HCl ile, 8q24.13 bölgeye prob haritalama kullanarak (yeşil). Çekirdekler DAPI (mavi) ile sayaçlı. 100x büyütme. Ölçek çubuğu = 10 μm. (B) Temsili 3D çok renkli DNA FISH çekirdekleri insan primer T lenfositler 12 dakika için 0.1 N HCl (sol) ile tedavi veya 0.01 N HCl/0.0025% pepsin ile birleştiğinde 2 dakika (sağ), 8q24.13 bölgeye prob haritalama kullanarak (yeşil). Çekirdekler DAPI (mavi) ile sayaçlı. 100x büyütme. Ölçek çubuğu = 10 μm. (C) Temsili 3D çok renkli DNA FISH çekirdekleri insan primer miyoblastlar kısa ve suboptimal pepsinizasyon ile tedavi, 8q24.13 bölgeye prob haritalama kullanarak (magenta). Çekirdekler DAPI (mavi) ile sayaçlı. 63x büyütme. Ölçek çubuğu = 10 μm. (D) İnsan primer miyoblastların temsili 3D çok renkli DNA FISH çekirdekleri uzun süreli pepsinizasyon adımı ile tedavi edilir, prob haritalama 8q24.13 bölgeye (magenta). Çekirdekler DAPI (mavi) ile sayaçlı. 63x büyütme. Ölçek çubuğu = 5 μm. (E) 8q24.13 bölgesine (macenta) prob haritalama kullanılarak optimal HCl/pepsin koşulları ile tedavi edilen insan primer miyoblastlarının temsili 3D çok renkli DNA FISH çekirdekleri. Çekirdekler DAPI (mavi) ile sayaçlı. 63x büyütme. Ölçek çubuğu = 25 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Nick çeviri reaktifleri | Başlangıç konsantrasyonu | Son konsantrasyon |
| dNTPs (C-G-A) | 0,5 mM | 0,05 mM |
| dTTP | 0,1 mM | 0,01 mM |
| Biotin/Dig/Cy3 dUTP | 1 mM | 0,02 mM |
| Tris HCl pH 7.8 | 1 M | 50 mM |
| MgCl2 | 100mm | 5 mM |
| β-mercaptoethanol | 100mm | 10 mM |
| Bsa | 100 ng/μL | 10 ng/μL |
| DNA Pol I | 10 U/μL | 0.1 U/μL |
| DNase I | 1 U/μL | 0.002 U/μL |
| DNA 2 μg | X | X |
| ddH2O | 50 μL'ye kadar |
Tablo 1: Nick Çeviri. Tablo tüm reaktifler açıklayan, konsantrasyon ve nick çeviri reaksiyonu için önerilen zamanlama.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mevcut yöntem insan birincil hücrelerin geniş bir yelpazede 3D çok renkli DNA FISH gerçekleştirmek için adım protokolü bir adım açıklar. DNA FISH geniş kullanımda bir teknoloji olmasına rağmen, korunmuş 3D interfaz çekirdekleri üzerinde 3D çok renkli DNA FISH hala birçok laboratuvarda gerçekleştirmek zordur, özellikle kullanılan örneklerin özellikleri nedeniyle23,24.
Prob nick çeviri başarılı 3D çok renkli DNA FISH için temel bir adımdır; bu reaksiyon için birçok farklı substrat (BAC, fosmid, plazmid, PCR ürünleri) kullanılabilir ve reaksiyon ve enzim konsantrasyonunun zamanlaması substrat uzunluğuna göre ayarlanabilir. Uygun bir prob sindirimi temeldir(Şekil 1), optimal olmayan problar(Şekil 2) sinyal veya nonspesifik bir sinyalle sonuçlanacaktır(Şekil 3A). Permeabilizasyon, deproteinizasyon ve pepsinizasyon adımları kullanılan hücre tipine güçlü bir şekilde bağlı olan önemli pasajlardır. Ex vivo izole T lenfositler gibi küçük çekirdekleri ve düşük sitoiskelet bolluğu olan hücreler, uzamış 0.1 N HCl tedavisi ile deproteinizasyon gerektirir. Ayrıca, Triton X-100 yüksek yüzdeleri ile PBS yıkıntılar bu hücrelerin çekirdeklerinde prob girişi yardımcı olabilir. Aksine, in vitro kültüre insan birincil miyoblastlar büyük çekirdekleri mevcut, sitoiskelet yüksek içeriği ile, pepsin ile sitosolik yapıların sindirim gerekir. Bu genel roller, belirli hücresel özelliklere bağlı olarak farklı adımları birleştirerek, hücrelerin geniş bir yelpazede uygulanabilir.
Taze hazırlanmış biyolojik malzeme, taze çözeltiler (özellikle deterjanlı çözeltiler) ve floresan reaktiflerin kullanımı kuvvetle önerilmektedir: pH 7.0'da filtrelenmiş PFA; otoklavlı ve filtreli 20x SSC pH 7.0; pH 7.0'da filtrelenmiş formamid; nükleaz içermeyen su; ve değiştirilmiş UTP tek kullanımlık aliquots. % 20 gliserol / PBS ile uzun süreli kuluçka, ya da 50% formamid/2x SSC hibridizasyon kolaylaştırabilir. HCl ve/veya pepsin tedavisi daha da arttırılabilir. Hibridizasyon zamanlaması, probların miktarı, konsantrasyon ve anti-digoksigenin ve streptavidin inkübatasyon zamanlaması daha fazla gürültü oranı sinyal geliştirmek için ayarlanabilir.
3D çok renkli DNA FISH C teknolojileri için tamamlayıcı bir araç temsil eder, C tabanlı sonuçları doğrulamak için standart yöntem. 3D mikroskopi ve analiz ile birleştiğinde, 3D çok renkli DNA FISH genomik lokus ve nükleer alan içindeki topolojik dağılımları arasındaki yakınlığı tek hücre düzeyinde izleyebilir. 3D çok renkli DNA FISH, genomik loci, RNA (messenger RNA veya düzenleyici olmayan kodlama RNA) arasındaki dinamikler ve etkileşimler hakkında kapsamlı bir genel bakış için RNA FISH ve immünofloresans gibi diğer metodolojilerle daha da entegre edilebilir. proteinlerin, nükleer yapıyı görselleştirmek ve hücresel kimliği alt üst eden epigenetik mekanizmaları araştırmak için eşsiz bir fırsat sağlar.
Süper çözünürlük 25 ile FISH teknolojilerinin büyük gelişme rağmen25,26, canlı hücre görüntüleme27,28,36, tek molekül algılama37, ve Oligopaint 37 gibi oligonükleotid dizileri ile birden fazla hedefin çağdaş görselleştirme37,38 3D yüksek iş lenme yaklaşımları ile39, teknolojinin bir sınırlama önceden belirlenmiş genomik loci ayrık sayısı kalır görselleştirilmelidir. Bu, nükleer mimarinin geniş kapsamlı bir analizini önler. Çeşitli çalışmalar son zamanlarda barkod DNA FISH40,41,42,43gibi tek hücrelerde genom organizasyonu adresine hibridizasyon ardışık yöntemler açıklanmıştır. Bir seferde test edilebilir loci sayısı artacak gibi daha fazla çaba, görüntüleme teknolojileri ile nükleer mimari heterojenite geniş görselleştirmek için genom geniş özelliklere 3D çok renkli DNA FISH tek hücreli doğa çift için gerekli olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Yazarlar INGM Görüntüleme Tesisi (Istituto Nazionale di Genetica Molecolare "Romeo ed Enrica Invernizzi" (INGM), Milano, İtalya), özellikle C. Cordiglieri, 3D çok renkli DNA FISH görüntüleri sırasında yardım için teknik yardım kabul Edinme. Bu çalışma B.B.:EPIGEN İtalyan amiral gemisi programı, Association Française contre les Myopathies (AFM-Telethon, grant nr 18754) ve Giovani Ricercatori, İtalya Sağlık Bakanlığı 'na (GR-2011-02349383) aşağıdaki hibeler tarafından desteklenmiştir. Bu çalışma F.M.'ye aşağıdaki hibe ile desteklenmiştir: Fondazione Cariplo (Bando Giovani, grant nr 2018-0321).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well plates | Thermo Fisher Scientific | 142475 | |
| 6-well plates | Thermo Fisher Scientific | 140675 | |
| Anti-Digoxigenin 488 | DBA | DI7488 | |
| b-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| bFGF | PeproTech | 100-18B | |
| Biotin 11 d-UTP | Thermo Fisher Scientific | R0081 | |
| BSA (bovine serum albumine) | Sigma | A7030 | |
| Coverlsips | Marienfeld | 117500 | |
| CY3 d-UTP | GE Healthcare | PA53022 | |
| DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole) | Thermo Fisher Scientific | D21490 | |
| Deoxyribonucleic acids single strand from salmon testes | Sigma | D7656 | |
| Dextran sulfate (powder) | Santa Cruz | sc-203917A | |
| Digoxigenin 11 d-UTP | Roche | 11093088910 | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 21969-035 500mL | |
| DNA polymerase I | Thermo Fisher Scientific | 18010-017 | |
| DNase I | Sigma | AMPD1 | |
| dNTPs (C-G-A-T) | Euroclone | BL0423A/C/G | |
| EGF | Sigma | E9644.2MG | |
| Ethanol | Sigma | 02860-1L | |
| FBS Hyclone | Thermo Fisher Scientific | SH30109 | |
| Formaldehyde solution | Sigma | F8775-25mL | |
| Formamide | Sigma | F9037 | |
| Glutammine | Thermo Fisher Scientific | 25030-024 100mL | |
| Glycerol | Sigma | G5516-100mL | |
| Glycogen | Thermo Fisher Scientific | AM9510 | |
| HCl | Sigma | 30721 | |
| Human Cot-1 DNA | Thermo Fisher Scientific | 15279-001 | |
| Insulin Human | Sigma | I9278-5 mL | |
| MgCl2 | Sigma | 63069 | |
| NaAc (Sodium Acetate, pH 5.2, 3 M) | Sigma | S2889 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127-25G | |
| PBS (phosphate-buffered saline) | Sigma | P4417 | |
| Pennycillin/Streptavidin | Thermo Fisher Scientific | 15070-063 100mL | |
| Pepsin | Biorad | P6887 | |
| PhasePrep BAC DNA Kit | Sigma | NA0100-1KT | |
| Poly-L-lysine solution | Sigma | P8920 | |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36970 | |
| PureLink Quick Gel Extraction & PCR Purification Combo Kit | Thermo Fisher Scientific | K220001 | |
| PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit | Thermo Fisher Scientific | K210010 | |
| RNAse cocktail | Thermo Fisher Scientific | AM2288 | |
| Rubbercement | Bostik | ||
| Slides | VWR | 631-0114 | |
| Streptavidina Alexa fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | S21374 | |
| Tri-Sodium Citrate | Sigma | 1110379026 | |
| Tris-HCl | Sigma | T3253-500g | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-250mL | |
| TWEEN 20 | Sigma | P9416-100mL |
References
- Cremer, T., Cremer, C. Chromosome territories, nuclear architecture and gene regulation in mammalian cells. Nature Reviews: Genetics. 2 (4), 292-301 (2001).
- Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 326 (5950), 289-293 (2009).
- Schmitt, A. D., Hu, M., Ren, B. Genome-wide mapping and analysis of chromosome architecture. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 17 (12), 743-755 (2016).
- Bonev, B., Cavalli, G. Organization and function of the 3D genome. Nature Reviews: Genetics. 17 (12), 772 (2016).
- van Steensel, B., Furlong, E. E. M. The role of transcription in shaping the spatial organization of the genome. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 20 (6), 327-337 (2019).
- Rajarajan, P., Gil, S. E., Brennand, K. J., Akbarian, S. Spatial genome organization and cognition. Nature Reviews: Neuroscience. 17 (11), 681-691 (2016).
- Pombo, A., Dillon, N. Three-dimensional genome architecture: players and mechanisms. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 16 (4), 245-257 (2015).
- Fanucchi, S., Shibayama, Y., Burd, S., Weinberg, M. S., Mhlanga, M. M. Chromosomal contact permits transcription between coregulated genes. Cell. 155 (3), 606-620 (2013).
- Therizols, P., et al. Chromatin decondensation is sufficient to alter nuclear organization in embryonic stem cells. Science. 346 (6214), 1238-1242 (2014).
- Gonzalez-Sandoval, A., et al. Perinuclear Anchoring of H3K9-Methylated Chromatin Stabilizes Induced Cell Fate in C. elegans Embryos. Cell. 163 (6), 1333-1347 (2015).
- Hubner, B., et al. Remodeling of nuclear landscapes during human myelopoietic cell differentiation maintains co-aligned active and inactive nuclear compartments. Epigenetics Chromatin. 8, 47 (2015).
- Aymard, F., et al. Genome-wide mapping of long-range contacts unveils clustering of DNA double-strand breaks at damaged active genes. Nature Structural & Molecular Biology. 24 (4), 353-361 (2017).
- Sellou, H., et al. The poly(ADP-ribose)-dependent chromatin remodeler Alc1 induces local chromatin relaxation upon DNA damage. Molecular Biology of the Cell. 27 (24), 3791-3799 (2016).
- Krijger, P. H., de Laat, W. Regulation of disease-associated gene expression in the 3D genome. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 17 (12), 771-782 (2016).
- Lupianez, D. G., Spielmann, M., Mundlos, S. Breaking TADs: How Alterations of Chromatin Domains Result in Disease. Trends in Genetics. 32 (4), 225-237 (2016).
- Cortesi, A., et al. 4q-D4Z4 chromatin architecture regulates the transcription of muscle atrophic genes in facioscapulohumeral muscular dystrophy. Genome Research. 29 (6), 883-895 (2019).
- Woltering, J. M., Noordermeer, D., Leleu, M., Duboule, D. Conservation and divergence of regulatory strategies at Hox Loci and the origin of tetrapod digits. PLoS Biology. 12 (1), 1001773 (2014).
- Woltering, J. M., Duboule, D. Tetrapod axial evolution and developmental constraints; Empirical underpinning by a mouse model. Mechanisms of Development. 138, Pt 2 64-72 (2015).
- de Laat, W., Dekker, J. 3C-based technologies to study the shape of the genome. Methods. 58 (3), 189-191 (2012).
- Denker, A., de Laat, W. The second decade of 3C technologies: detailed insights into nuclear organization. Genes & Development. 30 (12), 1357-1382 (2016).
- Finn, E. H., et al. Extensive Heterogeneity and Intrinsic Variation in Spatial Genome Organization. Cell. 176 (6), 1502-1515 (2019).
- Zheng, M., et al. Multiplex chromatin interactions with single-molecule precision. Nature. 566 (7745), 558-562 (2019).
- Solovei, I. Fluorescence in situ hybridization (FISH) on tissue cryosections. Methods in Molecular Biology. 659, 71-82 (2010).
- Cremer, M., et al. Multicolor 3D fluorescence in situ hybridization for imaging interphase chromosomes. Methods in Molecular Biology. 463, 205-239 (2008).
- Legant, W. R., et al. High-density three-dimensional localization microscopy across large volumes. Nature Methods. 13 (4), 359-365 (2016).
- Jungmann, R., et al. Quantitative super-resolution imaging with qPAINT. Nature Methods. 13 (5), 439-442 (2016).
- Chen, B., et al. Dynamic imaging of genomic loci in living human cells by an optimized CRISPR/Cas system. Cell. 155 (7), 1479-1491 (2013).
- Nelles, D. A., et al. Programmable RNA Tracking in Live Cells with CRISPR/Cas9. Cell. 165 (2), 488-496 (2016).
- Byron, M., Hall, L. L., Lawrence, J. B. A multifaceted FISH approach to study endogenous RNAs and DNAs in native nuclear and cell structures. Current Protocol of Human Genetics. , Chapter 4, Unit 4 15 (2013).
- Chaumeil, J., Augui, S., Chow, J. C., Heard, E. Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation. Methods in Molecular Biology. 463, 297-308 (2008).
- Takizawa, T., Gudla, P. R., Guo, L., Lockett, S., Misteli, T. Allele-specific nuclear positioning of the monoallelically expressed astrocyte marker GFAP. Genes & Development. 22 (4), 489-498 (2008).
- Kraus, F., et al. Quantitative 3D structured illumination microscopy of nuclear structures. Nature Protocols. 12 (5), 1011-1028 (2017).
- Solovei, I., Cremer, M. 3D-FISH on cultured cells combined with immunostaining. Methods in Molecular Biology. 659, 117-126 (2010).
- Skinner, B. M., Johnson, E. E. Nuclear morphologies: their diversity and functional relevance. Chromosoma. 126 (2), 195-212 (2017).
- Schoenfelder, S., et al. The pluripotent regulatory circuitry connecting promoters to their long-range interacting elements. Genome Research. 25 (4), 582-597 (2015).
- Lubeck, E., Cai, L. Single-cell systems biology by super-resolution imaging and combinatorial labeling. Nature Methods. 9 (7), 743-748 (2012).
- Beliveau, B. J., et al. Single-molecule super-resolution imaging of chromosomes and in situ haplotype visualization using Oligopaint FISH probes. Nature Communication. 6, 7147 (2015).
- Beliveau, B. J., et al. Versatile design and synthesis platform for visualizing genomes with Oligopaint FISH probes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (52), 21301-21306 (2012).
- Samacoits, A., et al. A computational framework to study sub-cellular RNA localization. Nature Communication. 9 (1), 4584 (2018).
- Cardozo Gizzi, A. M., et al. Microscopy-Based Chromosome Conformation Capture Enables Simultaneous Visualization of Genome Organization and Transcription in Intact Organisms. Molecular Cell. 74 (1), 212-222 (2019).
- Mateo, L. J., et al. Visualizing DNA folding and RNA in embryos at single-cell resolution. Nature. 568 (7750), 49-54 (2019).
- Nir, G., et al. Walking along chromosomes with super-resolution imaging, contact maps, and integrative modeling. PLoS Genetics. 14 (12), 1007872 (2018).
- Bintu, B., et al. Super-resolution chromatin tracing reveals domains and cooperative interactions in single cells. Science. 362 (6413), (2018).
