JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Genetics

3D Çok Renkli DNA FISH Aracı İnsan Birincil Hücrelerde Nükleer Mimari Çalışma

Published: January 25, 2020
doi:
10.3791/60712
, , ,
1Istituto Nazionale di Genetica Molecolare “Romeo ed Enrica Invernizzi”, INGM

Summary

3D çok renkli DNA FISH, 3B korunmuş çekirdekler içinde birden fazla genomik loci görselleştirmek için bir araç temsil eder, kesin olarak tek bir hücre düzeyinde nükleer alan içinde karşılıklı etkileşimleri ve lokalizasyon tanımlayan. Burada, adım protokol bir adım insan birincil hücrelerin geniş bir yelpazede için açıklanmıştır.

Abstract

Hücre biyolojisinde önemli bir soru nükleer uzay içinde genomik organizasyon ve kromatin mimarisinin gen ekspresyonu, hücre kimliği ve farklılaşma gibi süreçleri nasıl etkileyebildiğidir. Genomun 3Boyutlu mimarisini incelemek için geliştirilen birçok yaklaşım iki tamamlayıcı kategoriye ayrılabilir: kromozom konformasyon yakalama tabanlı teknolojiler (C-teknolojileri) ve görüntüleme. Eski sabit hücrelerin bir popülasyonkromozom konformasyonve proksimal DNA etkileşimleri yakalama dayalı iken, ikinci, 3D korunmuş çekirdekleri üzerinde yerinde hibridizasyon DNA floresandayalı (FISH) çağdaş görselleştirme sağlar tek bir hücre düzeyinde birden fazla loci (çok renkli), çekirdek (3D çok renkli DNA FISH) içinde etkileşimleri ve dağılımı inceleyerek. 3D çok renkli DNA FISH tekniği nükleer mimarinin kapsamlı bir analiz izin değil, sadece birkaç önceden belirlenmiş loci görselleştirme bir sınırlama vardır. Ancak, sonuçlarının sağlamlığı göz önüne alındığında, 3D-mikroskopi ve görüntü rekonstrüksiyonu ile birlikte 3D çok renkli DNA FISH C-teknoloji tabanlı sonuçları doğrulamak ve belirli lokus pozisyon ve organizasyon açık bir şekilde çalışma için olası bir yöntemdir tek bir hücre düzeyinde. Burada, insan birincil hücrelerin geniş bir yelpazede için uygun 3D çok renkli DNA FISH adım yöntemi ile bir adım önermek ve tüm pratik eylemler, önemli adımlar, 3D görüntüleme ve veri analizi kavramları başarılı ve bilgilendirici 3D çok renkli elde etmek için gerekli tartışmak FARKLı biyolojik bağlamlarda DNA FISH.

Introduction

Yüksek ökaryotlar sistematik olarak yoğunlaştırmak ve çekirdek1dakika 3D alanda genetik bilgi büyük miktarda sıkıştırmak gerekir1 ,2,3,4. Bugün, genomun mekansal olarak bölmelerde ve topolojik olarak ilişkili etki alanlarında 5 sıralı olduğunuve DNA katlama nın birden fazla seviyesinin kromatin döngüoluşumunuiçerebilecek farklı genomik bölgeler arasında temas lar oluşturduğunubiliyoruz. Kromatin 3D dinamik döngü transkripsiyon8gibi birçok farklı biyolojik süreçleri etkileyebilir,9, farklılaşma ve geliştirme10,11, DNA onarım12,13, onun pertürbations çeşitli hastalıklarda yer alırken14,15,16 ve gelişimsel bozukluklar15,17,18.

3D genom organizasyonunu incelemek için birçok yaklaşım geliştirilmiştir. Kromozom konformasyon yakalama tabanlı teknolojiler (C-teknolojileri, 3C, 4C, 5C, Hi-C ve türevleri) sabit hücrelerde genom organizasyonu çalışmak için geliştirilmiştir3,4,19,20. Bu tür yaklaşımlar, genomik loci ler arasındaki temas frekanslarını fiziksel yakınlıkta yakalayabilme yeteneğine dayanır. C-teknolojileri, kendi karmaşıklığına bağlı olarak, küresel 3D genom organizasyonu ve bir hücre popülasyonunun nükleer topoloji yakalamak3,4,19,20. Bununla birlikte, 3D etkileşimleri zaman ve mekan dinamik, multipleks etkileşimleri oluşan bireysel hücreler arasında son derece değişken, ve yaygın heterojen21,22.

3D çok renkli DNA floresans in situ hibridizasyon (FISH) belirli genomik lokusların tek hücre düzeyinde görüntülenmesine olanak tanıyan ve 3D nükleer mimarinin C teknolojilerine tamamlayıcı bir şekilde doğrudan araştırılmasını sağlayan bir tekniktir. Şu anda C sonuçlarını kesin olarak doğrulamak için kullanılan bir teknolojiyi temsil eder. 3D çok renkli DNA FISH, floresan olarak etiketlenmiş problar kullanır. Farklı floroforların ve uygun mikroskopi ekipmanlarının kullanımı, nükleer alan daki birden fazla hedefin çağdaş bir şekilde görüntülenmesine olanak sağlar23,24. Son yıllarda, FISH yüksek çözünürlüklü ince ölçekli yapıların görselleştirme elde etmek için mikroskobik teknolojik gelişmeler ile kombine edilmiştir25,26 veya canlı görüntüleme nükleik asitlerin görselleştirilmesi için CRISPR-Cas yaklaşımlarıile 27,28. Geniş benimsenmesine rağmen, kullanılan biyolojik malzeme adapte edilmelidir, çünkü 3D çok renkli DNA FISH yaklaşımı hala birçok laboratuvarda zor kabul edilir.

Burada, birden fazla genomik lokusgörselleştirme sağlayan ve çekirdeklerin 3D yapısını koruyarak, insan birincil hücrelerin geniş bir yelpazede uygulanabilir 3D çok renkli DNA FISH (hücre / sonda hazırlama veri analizi) için kapsamlı bir protokol sağlar. Nükleer mimariyi incelemek için çekirdeklerin 3 Boyutlu yapısı korunmalıdır. Bu nedenle, diğer mevcut protokoller29aksine,30,31, biz bir alkol gradyan kullanımı ve kromatin yapısını etkileyebilir alkol kapakları depolama önlemek32. Yöntem korunmuş 3D DNA FISH protokolleri uyarlanmıştır24,33 insan birincil hücrelerin geniş bir yelpazede uygulanacak, hem izole ex vivo veya in vitro kültürlü. Farklı nükleer morfoloji ve sitolojik özellikler için permeabilizasyon ve deproteinizasyon parametreleri vardır (örneğin, farklı nükleer sıkıştırma dereceleri, sitoiskelet bolluğu)34. Bu parametreler genellikle diğer protokollerde açıklanan24,33, farklı hücre türleri içinde prosedür net bir ayrımcılık sağlamadan. Ayrıca, nuclεD (3D nükleer temas bulucu)16adlı özel bir araç geliştirdi, otomatik bir şekilde nükleer alan içinde farklı loci ve nükleer topolojik dağılımı arasındaki 3D yakınlık artıracak veri analizi için ilkeler sağlayan.

Protocol

1. NICK çevirisi ile DNA sondası hazırlama ve etiketleme prosedürleri ArındırMak ve temiz bakteriyel yapay kromozomlar (BACs), plazmidler veya pcr ürünleri belirli kitleri ile(Malzeme Tablosu),ddH2O resuspend, bir agarose jel üzerinde elektroforez tarafından kontrol ve nicel. Tablo1’e göre 0,5 mL düşük bağlayıcı DNA tüpündeki tüm reaktifleri karıştırarak 50°L’lik son hacimde 1,5−2 μg DNA’dan 1,5−2 μg’lik DNA çevirisi yapın.<b…

Representative Results

Bu makalede açıklanan 3D çok renkli DNA FISH yöntemi korunmuş 3D çekirdekleri içinde farklı genomik lokus çağdaş görselleştirme sağlar(Şekil 1B). Bu protokol, aleller arasındaki mesafelerin ölçülmesine izin verir, ve farklı genomik loci onların mekansal yakınlık değerlendirmek için, ve nükleer uzay içinde konumlarını değerlendirmek için (örneğin, centroid veya çekirdeklerin çevresi loci mesafe)16. Ancak, kullanılan …

Discussion

Mevcut yöntem insan birincil hücrelerin geniş bir yelpazede 3D çok renkli DNA FISH gerçekleştirmek için adım protokolü bir adım açıklar. DNA FISH geniş kullanımda bir teknoloji olmasına rağmen, korunmuş 3D interfaz çekirdekleri üzerinde 3D çok renkli DNA FISH hala birçok laboratuvarda gerçekleştirmek zordur, özellikle kullanılan örneklerin özellikleri nedeniyle23,24.

Prob nick çeviri başarılı 3D çok renk…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar INGM Görüntüleme Tesisi (Istituto Nazionale di Genetica Molecolare “Romeo ed Enrica Invernizzi” (INGM), Milano, İtalya), özellikle C. Cordiglieri, 3D çok renkli DNA FISH görüntüleri sırasında yardım için teknik yardım kabul Edinme. Bu çalışma B.B.:EPIGEN İtalyan amiral gemisi programı, Association Française contre les Myopathies (AFM-Telethon, grant nr 18754) ve Giovani Ricercatori, İtalya Sağlık Bakanlığı ‘na (GR-2011-02349383) aşağıdaki hibeler tarafından desteklenmiştir. Bu çalışma F.M.’ye aşağıdaki hibe ile desteklenmiştir: Fondazione Cariplo (Bando Giovani, grant nr 2018-0321).

Materials

24-well plates Thermo Fisher Scientific 142475
6-well plates Thermo Fisher Scientific 140675
Anti-Digoxigenin 488 DBA DI7488
b-Mercaptoethanol Sigma M3148
bFGF PeproTech 100-18B
Biotin 11 d-UTP Thermo Fisher Scientific R0081
BSA (bovine serum albumine) Sigma A7030
Coverlsips Marienfeld 117500
CY3 d-UTP GE Healthcare PA53022
DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole) Thermo Fisher Scientific D21490
Deoxyribonucleic acids single strand from salmon testes Sigma D7656
Dextran sulfate (powder) Santa Cruz sc-203917A
Digoxigenin 11 d-UTP Roche 11093088910
DMEM Thermo Fisher Scientific 21969-035 500mL
DNA polymerase I Thermo Fisher Scientific 18010-017
DNase I Sigma AMPD1
dNTPs (C-G-A-T) Euroclone BL0423A/C/G
EGF Sigma E9644.2MG
Ethanol Sigma 02860-1L
FBS Hyclone Thermo Fisher Scientific SH30109
Formaldehyde solution Sigma F8775-25mL
Formamide Sigma F9037
Glutammine Thermo Fisher Scientific 25030-024 100mL
Glycerol Sigma G5516-100mL
Glycogen Thermo Fisher Scientific AM9510
HCl Sigma 30721
Human Cot-1 DNA Thermo Fisher Scientific 15279-001
Insulin Human Sigma I9278-5 mL
MgCl2 Sigma 63069
NaAc (Sodium Acetate, pH 5.2, 3 M) Sigma S2889
NaCl Sigma S9888
Paraformaldehyde Sigma 158127-25G
PBS (phosphate-buffered saline) Sigma P4417
Pennycillin/Streptavidin Thermo Fisher Scientific 15070-063 100mL
Pepsin Biorad P6887
PhasePrep BAC DNA Kit Sigma NA0100-1KT
Poly-L-lysine solution Sigma P8920
ProLong Diamond Antifade Mountant Thermo Fisher Scientific P36970
PureLink Quick Gel Extraction & PCR Purification Combo Kit Thermo Fisher Scientific K220001
PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit Thermo Fisher Scientific K210010
RNAse cocktail Thermo Fisher Scientific AM2288
Rubbercement Bostik
Slides VWR 631-0114
Streptavidina Alexa fluor 647 Thermo Fisher Scientific S21374
Tri-Sodium Citrate Sigma 1110379026
Tris-HCl Sigma T3253-500g
Triton X-100 Sigma T8787-250mL
TWEEN 20 Sigma P9416-100mL
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cremer, T., Cremer, C. Chromosome territories, nuclear architecture and gene regulation in mammalian cells. Nature Reviews: Genetics. 2 (4), 292-301 (2001).
  2. Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 326 (5950), 289-293 (2009).
  3. Schmitt, A. D., Hu, M., Ren, B. Genome-wide mapping and analysis of chromosome architecture. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 17 (12), 743-755 (2016).
  4. Bonev, B., Cavalli, G. Organization and function of the 3D genome. Nature Reviews: Genetics. 17 (12), 772 (2016).
  5. van Steensel, B., Furlong, E. E. M. The role of transcription in shaping the spatial organization of the genome. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 20 (6), 327-337 (2019).
  6. Rajarajan, P., Gil, S. E., Brennand, K. J., Akbarian, S. Spatial genome organization and cognition. Nature Reviews: Neuroscience. 17 (11), 681-691 (2016).
  7. Pombo, A., Dillon, N. Three-dimensional genome architecture: players and mechanisms. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 16 (4), 245-257 (2015).
  8. Fanucchi, S., Shibayama, Y., Burd, S., Weinberg, M. S., Mhlanga, M. M. Chromosomal contact permits transcription between coregulated genes. Cell. 155 (3), 606-620 (2013).
  9. Therizols, P., et al. Chromatin decondensation is sufficient to alter nuclear organization in embryonic stem cells. Science. 346 (6214), 1238-1242 (2014).
  10. Gonzalez-Sandoval, A., et al. Perinuclear Anchoring of H3K9-Methylated Chromatin Stabilizes Induced Cell Fate in C. elegans Embryos. Cell. 163 (6), 1333-1347 (2015).
  11. Hubner, B., et al. Remodeling of nuclear landscapes during human myelopoietic cell differentiation maintains co-aligned active and inactive nuclear compartments. Epigenetics Chromatin. 8, 47 (2015).
  12. Aymard, F., et al. Genome-wide mapping of long-range contacts unveils clustering of DNA double-strand breaks at damaged active genes. Nature Structural & Molecular Biology. 24 (4), 353-361 (2017).
  13. Sellou, H., et al. The poly(ADP-ribose)-dependent chromatin remodeler Alc1 induces local chromatin relaxation upon DNA damage. Molecular Biology of the Cell. 27 (24), 3791-3799 (2016).
  14. Krijger, P. H., de Laat, W. Regulation of disease-associated gene expression in the 3D genome. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 17 (12), 771-782 (2016).
  15. Lupianez, D. G., Spielmann, M., Mundlos, S. Breaking TADs: How Alterations of Chromatin Domains Result in Disease. Trends in Genetics. 32 (4), 225-237 (2016).
  16. Cortesi, A., et al. 4q-D4Z4 chromatin architecture regulates the transcription of muscle atrophic genes in facioscapulohumeral muscular dystrophy. Genome Research. 29 (6), 883-895 (2019).
  17. Woltering, J. M., Noordermeer, D., Leleu, M., Duboule, D. Conservation and divergence of regulatory strategies at Hox Loci and the origin of tetrapod digits. PLoS Biology. 12 (1), 1001773 (2014).
  18. Woltering, J. M., Duboule, D. Tetrapod axial evolution and developmental constraints; Empirical underpinning by a mouse model. Mechanisms of Development. 138, 64-72 (2015).
  19. de Laat, W., Dekker, J. 3C-based technologies to study the shape of the genome. Methods. 58 (3), 189-191 (2012).
  20. Denker, A., de Laat, W. The second decade of 3C technologies: detailed insights into nuclear organization. Genes & Development. 30 (12), 1357-1382 (2016).
  21. Finn, E. H., et al. Extensive Heterogeneity and Intrinsic Variation in Spatial Genome Organization. Cell. 176 (6), 1502-1515 (2019).
  22. Zheng, M., et al. Multiplex chromatin interactions with single-molecule precision. Nature. 566 (7745), 558-562 (2019).
  23. Solovei, I. Fluorescence in situ hybridization (FISH) on tissue cryosections. Methods in Molecular Biology. 659, 71-82 (2010).
  24. Cremer, M., et al. Multicolor 3D fluorescence in situ hybridization for imaging interphase chromosomes. Methods in Molecular Biology. 463, 205-239 (2008).
  25. Legant, W. R., et al. High-density three-dimensional localization microscopy across large volumes. Nature Methods. 13 (4), 359-365 (2016).
  26. Jungmann, R., et al. Quantitative super-resolution imaging with qPAINT. Nature Methods. 13 (5), 439-442 (2016).
  27. Chen, B., et al. Dynamic imaging of genomic loci in living human cells by an optimized CRISPR/Cas system. Cell. 155 (7), 1479-1491 (2013).
  28. Nelles, D. A., et al. Programmable RNA Tracking in Live Cells with CRISPR/Cas9. Cell. 165 (2), 488-496 (2016).
  29. Byron, M., Hall, L. L., Lawrence, J. B. A multifaceted FISH approach to study endogenous RNAs and DNAs in native nuclear and cell structures. Current Protocol of Human Genetics. , 15 (2013).
  30. Chaumeil, J., Augui, S., Chow, J. C., Heard, E. Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation. Methods in Molecular Biology. 463, 297-308 (2008).
  31. Takizawa, T., Gudla, P. R., Guo, L., Lockett, S., Misteli, T. Allele-specific nuclear positioning of the monoallelically expressed astrocyte marker GFAP. Genes & Development. 22 (4), 489-498 (2008).
  32. Kraus, F., et al. Quantitative 3D structured illumination microscopy of nuclear structures. Nature Protocols. 12 (5), 1011-1028 (2017).
  33. Solovei, I., Cremer, M. 3D-FISH on cultured cells combined with immunostaining. Methods in Molecular Biology. 659, 117-126 (2010).
  34. Skinner, B. M., Johnson, E. E. Nuclear morphologies: their diversity and functional relevance. Chromosoma. 126 (2), 195-212 (2017).
  35. Schoenfelder, S., et al. The pluripotent regulatory circuitry connecting promoters to their long-range interacting elements. Genome Research. 25 (4), 582-597 (2015).
  36. Lubeck, E., Cai, L. Single-cell systems biology by super-resolution imaging and combinatorial labeling. Nature Methods. 9 (7), 743-748 (2012).
  37. Beliveau, B. J., et al. Single-molecule super-resolution imaging of chromosomes and in situ haplotype visualization using Oligopaint FISH probes. Nature Communication. 6, 7147 (2015).
  38. Beliveau, B. J., et al. Versatile design and synthesis platform for visualizing genomes with Oligopaint FISH probes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (52), 21301-21306 (2012).
  39. Samacoits, A., et al. A computational framework to study sub-cellular RNA localization. Nature Communication. 9 (1), 4584 (2018).
  40. Cardozo Gizzi, A. M., et al. Microscopy-Based Chromosome Conformation Capture Enables Simultaneous Visualization of Genome Organization and Transcription in Intact Organisms. Molecular Cell. 74 (1), 212-222 (2019).
  41. Mateo, L. J., et al. Visualizing DNA folding and RNA in embryos at single-cell resolution. Nature. 568 (7750), 49-54 (2019).
  42. Nir, G., et al. Walking along chromosomes with super-resolution imaging, contact maps, and integrative modeling. PLoS Genetics. 14 (12), 1007872 (2018).
  43. Bintu, B., et al. Super-resolution chromatin tracing reveals domains and cooperative interactions in single cells. Science. 362 (6413), (2018).

Tags

3D Multicolor DNA FISHNuclear ArchitectureGenomic LociChromosome CaptureNick TranslationProbe PrecipitationCell FixationPermeabilizationRNAse Treatment

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Marasca, F., Cortesi, A., Manganaro, L., Bodega, B. 3D Multicolor DNA FISH Tool to Study Nuclear Architecture in Human Primary Cells. J. Vis. Exp. (155), e60712, doi:10.3791/60712 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image