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Genetics

ヒト初等細胞の核アーキテクチャを研究する3D多色DNA FISHツール

Published: January 25, 2020
doi:
10.3791/60712
, , ,
1Istituto Nazionale di Genetica Molecolare “Romeo ed Enrica Invernizzi”, INGM

Summary

3DマルチカラーDNA FISHは、3D保存核内の複数のゲノム軌跡を視覚化するツールを表し、核空間内での相互相互作用と局在性を単一の細胞レベルで明確に定義します。ここで、ヒト一次細胞の広いスペクトルについて段階的にプロトコルをステップごとに説明する。

Abstract

細胞生物学における大きな問題は、核空間内のゲノム組織と、クロマチンアーキテクチャが遺伝子発現、細胞同一性、分化などのプロセスにどのような影響を与えるかです。ゲノムの3Dアーキテクチャを研究するために開発された多くのアプローチは、染色体立体構造キャプチャベースの技術(C技術)とイメージングの2つの相補的なカテゴリーに分けることができます。前者は固定細胞集団における染色体立体構造と近位DNA相互作用を捉えるが、後者は3D保存核上のその場ハイブリダイゼーション(FISH)におけるDNA蛍光に基づいて、現代的な視覚化を可能にする単一の細胞レベル(多色)で複数の遺伝子座を有し、核内での相互作用と分布を調べる(3D多色DNA FISH)。3D多色DNA FISHの技術は、少数の所定の座位座のみを可視化するという制限があり、核アーキテクチャの包括的な分析を許さない。しかし、その結果の堅牢性を考えると、3D多色DNA FISHと3D顕微鏡と画像再構成を組み合わせて、C技術ベースの結果を検証し、特定の遺伝子座の位置と組織を明確に研究する方法です。1 つのセル レベルで。ここでは、幅広いヒト初等細胞に適した3D多色DNA FISHのステップバイステップ方式を提案し、成功した有益な3Dマルチカラーを得るために必要なすべての実用的な行動、重要なステップ、3Dイメージングの概念、およびデータ分析について議論するDNA FISH 異なる生物学的文脈の中で.

Introduction

高い真核生物は、核1、2、3、4の分の3D空間で、膨大な量の遺伝情報を体系的に凝縮し、コンパクト化する必要があります。今日、我々は、ゲノムが区画およびトポロジー関連ドメイン5において空間的に秩序化され、DNAフォールディングの複数のレベルがクロマチンループ形成6、7を伴う可能性のある異なるゲノム領域間の接触を生成することを知っている。クロマチンの3D動的ループは、転写8、9、分化および現像10、11、DNA修復12、13、その摂動が様々な疾患14、15、16および発達欠陥15、17、18に関与している間、多くの異なる生物学的プロセスに影響を及ぼし得る。

3Dゲノム組織を研究するために多くのアプローチが開発されています。染色体コンフォメーションキャプチャベースの技術(C技術、3C、4C、5C、Hi-Cおよび誘導体)は、固定細胞3、4、19、20のゲノム組織を研究するために開発された。このようなアプローチは、物理的近接でゲノム遺伝子座間の接触周波数を捕捉する能力に基づいている。C-技術は、その複雑さに応じて、細胞集団3、4、19、20のグローバル3Dゲノム組織と核トポロジーをキャッチします。それにもかかわらず、3D相互作用は時間および空間において動的であり、多重相互作用からなる個々の細胞間で高度に可変であり、かつ広範囲に異種21、22である。

3D多色DNA蛍光インシトゥハイブリダイゼーション(FISH)は、特定のゲノム軌跡を単一細胞レベルで可視化し、C技術に対して3D核アーキテクチャを補完的に直接調査することを可能にする技術です。これは、C-結果を明確に検証するために現在使用されている技術を表します。3DマルチカラーDNA FISHは、興味のゲノム遺伝子座に相補的な蛍光標識プローブを使用しています。異なる蛍光発光器および適切な顕微鏡装置の使用は核空間23、24内の複数のターゲットの現代的な視覚化を可能にする。近年、FISHは、マイクロスコピーの技術進歩と組み合わされ、高解像度25、26、またはCRISPR-Cas法による微細スケール構造の可視化を得て、ライブイメージング27,28で核酸の可視化を行っている。広く採用されているにもかかわらず、3D多色DNA FISHアプローチは、使用される生物学的材料を適応しなければならないため、多くの研究室では依然として困難であると考えられている。

ここでは、幅広いヒト一次細胞に適用できる3D多色DNA FISH(細胞/プローブ調製からデータ解析まで)の包括的なプロトコルを提供し、多重ゲノム軌跡の可視化を可能にし、核の3D構造を維持します。核建築を研究するためには、核の3D構造を維持しなければならない。このため、他の既存のプロトコル29、30、31とは対照的に、クロマチン構造32に影響を与えるアルコールのアルコール勾配およびカバースリップの貯蔵の使用を避ける。この方法は、保存された3D DNA FISHプロトコル24、33から、広範囲のヒト一次細胞に適用されるように適合され、両方とも単離されたエクスビボまたはインビトロで培養される。異なる核形態および細胞学的特性に対する透過性および脱蛋白パラメータ(例えば、異なる核圧縮度、細胞骨格量)34がある。これらのパラメータは、一般に、異なる細胞型内での手順の明確な識別を提供することなく、他のプロトコル24、33で説明される。さらに、核空間内の異なる軌跡とその核トポロジー分布の3D近接性を自動で改善するデータ解析の原理を提供する、NuCLεD(3Dにおける核接触ロケータ)16という特定のツールを開発しました。

Protocol

ニック翻訳によるDNAプローブ調製とラベリング手順 細菌人工染色体(BAC)、プラスミドまたはPCR製品を特定のキット(材料表)で精製し、精製し、アガロースゲル上の電気泳動でチェックし、定量します。 表1に従って0.5 mLの低結合DNAチューブに全ての試薬を混合することにより、ステップ1.1から50μLの最終体積で1.5-2μgのDNAにニック翻訳を行う。<br…

Representative Results

本稿で説明した3D多色DNA FISHの方法により、保存された3D核内の異なるゲノム軌跡を現代的に視覚化することができます(図1B)。このプロトコルは、対立遺伝子と、それらの空間的近接性を評価するために異なるゲノム遺伝子座との間の距離の測定を可能にし、かつ、核空間内の位置(例えば、心積心または核の周囲からの軌跡距離)16を評価す…

Discussion

現在の方法は、ヒト一次細胞の広い範囲で3D多色DNA FISHを実行するためのステップバイステッププロトコルを記述する。DNA FISHは広く使用されている技術ですが、保存された3Dの相間核上の3D多色DNA FISHは、主に23、24を使用するサンプルの特性のために、多くの研究室で行うことが困難です。

プローブニック翻訳は、成功した3Dマ…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

著者らは、3D多色DNA FISH画像の間の支援のために、INGMイメージング施設(イシティト・ナツィオナーレ・ディ・ジェネティスタ・モレコラレ「ロミオ・エド・エンリカ・インヴェルニッツィ」(INGM)、ミラノ、ミラノ、特にC.コルディグリエリの技術的支援を認める取得。この作品は、B.B.への助成金、EPIGENイタリアの旗艦プログラム、協会フランセーズ・コントル・レ・ミオパシー(AFM-Telethon、助成金nr 18754)、イタリア保健省のジョヴァニ・リセルカトリ(GR-2011-02349383)に支えられてきました。この作品は、F.M.への以下の助成金によって支えられてきました:フォンダツィオーネ・カリプロ(バンド・ジョヴァーニ、グラントnr 2018-0321)。

Materials

24-well plates Thermo Fisher Scientific 142475
6-well plates Thermo Fisher Scientific 140675
Anti-Digoxigenin 488 DBA DI7488
b-Mercaptoethanol Sigma M3148
bFGF PeproTech 100-18B
Biotin 11 d-UTP Thermo Fisher Scientific R0081
BSA (bovine serum albumine) Sigma A7030
Coverlsips Marienfeld 117500
CY3 d-UTP GE Healthcare PA53022
DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole) Thermo Fisher Scientific D21490
Deoxyribonucleic acids single strand from salmon testes Sigma D7656
Dextran sulfate (powder) Santa Cruz sc-203917A
Digoxigenin 11 d-UTP Roche 11093088910
DMEM Thermo Fisher Scientific 21969-035 500mL
DNA polymerase I Thermo Fisher Scientific 18010-017
DNase I Sigma AMPD1
dNTPs (C-G-A-T) Euroclone BL0423A/C/G
EGF Sigma E9644.2MG
Ethanol Sigma 02860-1L
FBS Hyclone Thermo Fisher Scientific SH30109
Formaldehyde solution Sigma F8775-25mL
Formamide Sigma F9037
Glutammine Thermo Fisher Scientific 25030-024 100mL
Glycerol Sigma G5516-100mL
Glycogen Thermo Fisher Scientific AM9510
HCl Sigma 30721
Human Cot-1 DNA Thermo Fisher Scientific 15279-001
Insulin Human Sigma I9278-5 mL
MgCl2 Sigma 63069
NaAc (Sodium Acetate, pH 5.2, 3 M) Sigma S2889
NaCl Sigma S9888
Paraformaldehyde Sigma 158127-25G
PBS (phosphate-buffered saline) Sigma P4417
Pennycillin/Streptavidin Thermo Fisher Scientific 15070-063 100mL
Pepsin Biorad P6887
PhasePrep BAC DNA Kit Sigma NA0100-1KT
Poly-L-lysine solution Sigma P8920
ProLong Diamond Antifade Mountant Thermo Fisher Scientific P36970
PureLink Quick Gel Extraction & PCR Purification Combo Kit Thermo Fisher Scientific K220001
PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit Thermo Fisher Scientific K210010
RNAse cocktail Thermo Fisher Scientific AM2288
Rubbercement Bostik
Slides VWR 631-0114
Streptavidina Alexa fluor 647 Thermo Fisher Scientific S21374
Tri-Sodium Citrate Sigma 1110379026
Tris-HCl Sigma T3253-500g
Triton X-100 Sigma T8787-250mL
TWEEN 20 Sigma P9416-100mL
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References

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3D Multicolor DNA FISHNuclear ArchitectureGenomic LociChromosome CaptureNick TranslationProbe PrecipitationCell FixationPermeabilizationRNAse Treatment

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Marasca, F., Cortesi, A., Manganaro, L., Bodega, B. 3D Multicolor DNA FISH Tool to Study Nuclear Architecture in Human Primary Cells. J. Vis. Exp. (155), e60712, doi:10.3791/60712 (2020).
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