인간의 1 차 세포에서 핵 아키텍처를 연구하는 3D 다색 DNA FISH 도구
Summary
3D 다색 DNA FISH는 3D 보존 핵 내에서 다중 게놈 궤시를 시각화하는 도구를 나타내며, 단일 세포 수준에서 핵 공간 내에서 상호 상호 작용 및 국소화를 명확하게 정의합니다. 여기서, 단계별 프로토콜은 인간 1차 세포의 광범위한 스펙트럼에 대해 기재된다.
Abstract
세포 생물학에 있는 중요한 질문은 핵 공간 내의 게놈 조직 및 어떻게 염색질 건축이 유전자 발현, 세포 정체성 및 분화와 같은 프로세스에 영향을 미칠 수 있는지입니다. 게놈의 3D 건축을 연구하기 위하여 개발된 많은 접근은 염색체 형성 포착 기지를 둔 기술 (C 기술) 및 화상 진찰의 2개의 상보적인 종류로 분할될 수 있습니다. 전자는 고정 된 세포의 집단에서 염색체 형태와 근위 DNA 상호 작용을 캡처에 기초하는 동안, 후자는, 3D 보존 핵에 대한 체형 혼성화 (FISH)의 DNA 형광에 기초하여, 현대 시각화를 허용 단일 세포 수준에서 다중 위치 (다중 색), 핵 내에서 그들의 상호 작용 및 분포를 검사 (3D 다색 DNA FISH). 3D 다색 DNA FISH의 기술은 핵 아키텍처의 포괄적 인 분석을 허용하지 않고 몇 개의 미리 결정된 궤위만 시각화하는 데 한계가 있습니다. 그러나, 그 결과의 견고성을 감안할 때, 3D 다색 DNA FISH는 3D 현미경 검사법 및 심상 재구성과 결합하여 C 기술 기반 결과를 검증하고 특정 로시의 위치와 조직을 명확하게 연구할 수 있는 방법입니다. 단일 셀 수준에서. 여기서, 우리는 광범위한 인간 1 차 세포에 적합한 3D 다색 DNA FISH의 단계별 방법을 제안하고 성공적이고 유익한 3D 다색을 얻기 위해 필요한 모든 실용적인 행동, 중요한 단계, 3D 이미징 및 데이터 분석에 대한 개념을 논의합니다. 다른 생물학적 맥락 내에서 DNA 물고기.
Introduction
더 높은 진핵생물은 체계적으로 응축하고 핵1,2,3,4의 분 3D 공간에서 유전 정보의 엄청난 양을 압축할 필요가있다. 오늘, 우리는 게놈이 구획 및 위상으로 연관된 도메인5에서 공간적으로 주문되고 DNA 접기의 다중 수준이 염색질 루프 대형6,7을관련시킬 수 있는 다른 게놈 지구 사이 접촉을 생성한다는 것을 알고 있습니다. 염색질의 3D 동적 루핑은 전사8,9,분화 및 개발10,11,DNA 수리12,13,다양한 질병에 관여하는 동안14,15, 16 및 발달 결함15,17,18과같은 다양한 생물학적 과정에 영향을 미칠 수 있습니다.
3D 게놈 조직을 연구하기 위해 많은 접근법이 개발되었습니다. 염색체 형성 포획 기반 기술(C-기술, 3C, 4C, 5C, Hi-C 및 유도체)은 고정 세포3,4,19,20에서게놈 조직을 연구하기 위해 개발되었다. 이러한 접근법은 물리적 근접에서 게놈 궤위 사이의 접촉 주파수를 포착하는 능력에 기초한다. C-기술은 그 복잡성에 따라, 세포 집단의 글로벌 3D 게놈 조직 및 핵 토폴로지를잡는다 3,4,19,20. 그럼에도 불구하고, 3D 상호작용은 시간과 공간에서 동적이며, 멀티플렉스 상호작용으로 구성된 개별 세포 들 사이에서 매우 가변적이며, 광범위하게 이질적인21,22이다.
3D 다색 DNA 형광을 현장에서 혼성화(FISH)는 단일 세포 수준에서 특정 게놈 궤변을 시각화할 수 있는 기술로, C-기술에 대한 보완적인 방식으로 3D 핵 아키텍처에 대한 직접 적인 조사가 가능합니다. 현재 C-결과의 유효성을 명확하게 확인하는 데 사용되는 기술을 나타냅니다. 3D 다색 DNA FISH는 관심 있는 게놈 성소에 상보적인 형광 표지 프로브를 사용합니다. 상이한 형광단 및 적합한 현미경 장비의 사용은 핵 공간23,24내의 여러 표적의 현대 시각화를 가능하게 한다. 최근, FISH는 고해상도25,26 또는 CRISPR-Cas 접근법과 함께 정밀한 스케일 구조의 시각화를 얻기 위해 현미경 검사법의 기술적 진보와 결합되어 라이브 이미징27,28에서핵산의 시각화를 위한접근법을가지고 있다. 광범위한 채택에도 불구하고, 사용되는 생물학적 물질이 적응되어야하기 때문에 3D 다색 DNA FISH 접근법은 여전히 많은 실험실에서 어려운 것으로 간주됩니다.
여기에서는 광범위한 인간 1차 세포에 적용할 수 있는 3D 다색 DNA FISH(세포/프로브 준비에서 데이터 분석까지)를 위한 포괄적인 프로토콜을 제공하여 다중 게놈 궤적의 시각화를 가능하게 하고 핵의 3D 구조를 보존합니다. 핵 건축을 연구하기 위해서는 핵의 3D 구조를 보존해야 한다. 이러한 이유로, 다른 기존프로토콜(29,30,31)과는 대조적으로, 우리는 크로마틴구조에영향을 미칠 수 있는 알코올의 구배 및 커버슬립의 저장을 피한다. 상기 방법은 보존된 3D DNA FISH프로토콜(24,33)으로부터 적응되어 광범위한 인간 1차 세포에 적용될 수 있으며, 둘 다 생체외에서 분리된 생체내 또는 배양된다. 상이한 핵 형태 및 세포학적 특성(예를 들어, 다른 정도의 핵 다짐, 세포골격 풍부)에 대한 투과 및 탈백인 매개변수가있다 34. 이들 파라미터는 일반적으로 상이한 세포 유형 내에서 절차의 명확한 차별을 제공하지 않고, 다른 프로토콜24,33에서설명된다. 또한 NuCLθD(3D의 핵 접촉 로케이터)라는 특정도구를 개발하여 자동화된 방식으로 핵 공간 내의 다른 동위층과 핵 위상 분포 사이의 3D 근접성을 개선하는 데이터 분석 원칙을 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
현재의 방법은 광범위한 인간 1차 세포에서 3D 다색 DNA FISH를 수행하기 위한 단계별 프로토콜을 설명한다. DNA FISH는 광범위하게 사용되는 기술이지만, 보존된 3D 상간 핵에 대한 3D 다색 DNA FISH는 주로 사용되는 시료의 특성으로 인해 많은 실험실에서 수행하기가 여전히 어렵다23,24.
프로브 닉 번역은 성공적인 3D 다색 DNA FISH를 위한 기?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 INGM 이미징 시설 (이스티투토 나치오날레 디 유게코콜라 몰레콜라 “로미오 에드 엔리카 인버니치”(INGM), 밀라노, 이탈리아, 특히 C. Cordiglieri의 기술 지원을 인정, 3D 다채 DNA FISH 이미지 동안 도움 수집. 이 작품은 B.B.에 다음과 같은 보조금에 의해 지원되고있다: EPIGEN 이탈리아어 주력 프로그램, 협회 프랑수아즈 콘트 레 Myopathies (AFM-텔레톤, 그랜트 nr 18754) 및 조바니 Ricercatori, 건강의 이탈리아 정부 (GR-2011-02349383). 이 작품은 F.M.에 다음과 같은 보조금에 의해 지원되고있다: 폰다지오네 카리플로 (반도 조바니, 부여 nr 2018-0321).
Materials
| 24-well plates | Thermo Fisher Scientific | 142475 | |
| 6-well plates | Thermo Fisher Scientific | 140675 | |
| Anti-Digoxigenin 488 | DBA | DI7488 | |
| b-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| bFGF | PeproTech | 100-18B | |
| Biotin 11 d-UTP | Thermo Fisher Scientific | R0081 | |
| BSA (bovine serum albumine) | Sigma | A7030 | |
| Coverlsips | Marienfeld | 117500 | |
| CY3 d-UTP | GE Healthcare | PA53022 | |
| DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole) | Thermo Fisher Scientific | D21490 | |
| Deoxyribonucleic acids single strand from salmon testes | Sigma | D7656 | |
| Dextran sulfate (powder) | Santa Cruz | sc-203917A | |
| Digoxigenin 11 d-UTP | Roche | 11093088910 | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 21969-035 500mL | |
| DNA polymerase I | Thermo Fisher Scientific | 18010-017 | |
| DNase I | Sigma | AMPD1 | |
| dNTPs (C-G-A-T) | Euroclone | BL0423A/C/G | |
| EGF | Sigma | E9644.2MG | |
| Ethanol | Sigma | 02860-1L | |
| FBS Hyclone | Thermo Fisher Scientific | SH30109 | |
| Formaldehyde solution | Sigma | F8775-25mL | |
| Formamide | Sigma | F9037 | |
| Glutammine | Thermo Fisher Scientific | 25030-024 100mL | |
| Glycerol | Sigma | G5516-100mL | |
| Glycogen | Thermo Fisher Scientific | AM9510 | |
| HCl | Sigma | 30721 | |
| Human Cot-1 DNA | Thermo Fisher Scientific | 15279-001 | |
| Insulin Human | Sigma | I9278-5 mL | |
| MgCl2 | Sigma | 63069 | |
| NaAc (Sodium Acetate, pH 5.2, 3 M) | Sigma | S2889 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127-25G | |
| PBS (phosphate-buffered saline) | Sigma | P4417 | |
| Pennycillin/Streptavidin | Thermo Fisher Scientific | 15070-063 100mL | |
| Pepsin | Biorad | P6887 | |
| PhasePrep BAC DNA Kit | Sigma | NA0100-1KT | |
| Poly-L-lysine solution | Sigma | P8920 | |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36970 | |
| PureLink Quick Gel Extraction & PCR Purification Combo Kit | Thermo Fisher Scientific | K220001 | |
| PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit | Thermo Fisher Scientific | K210010 | |
| RNAse cocktail | Thermo Fisher Scientific | AM2288 | |
| Rubbercement | Bostik | ||
| Slides | VWR | 631-0114 | |
| Streptavidina Alexa fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | S21374 | |
| Tri-Sodium Citrate | Sigma | 1110379026 | |
| Tris-HCl | Sigma | T3253-500g | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-250mL | |
| TWEEN 20 | Sigma | P9416-100mL |
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