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Genetics

Ferramenta de peixe de DNA Multicolor 3D para estudar arquitetura nuclear em células primárias humanas

Published: January 25, 2020
doi:
10.3791/60712
, , ,
1Istituto Nazionale di Genetica Molecolare “Romeo ed Enrica Invernizzi”, INGM

Summary

O DNA 3D multicolor FISH representa uma ferramenta para visualizar loci múltiplogenômico dentro de núcleos preservados em 3D, definindo inequivocamente suas interações recíprocas e localização dentro do espaço nuclear em um único nível celular. Aqui, um protocolo passo a passo é descrito para um amplo espectro de células primárias humanas.

Abstract

Uma questão importante na biologia celular é a organização genômica dentro do espaço nuclear e como a arquitetura da cromatina pode influenciar processos como expressão genética, identidade celular e diferenciação. Muitas abordagens desenvolvidas para estudar a arquitetura 3D do genoma podem ser divididas em duas categorias complementares: tecnologias baseadas em captura de conformação cromossa (C-technologies) e imagem. Enquanto o primeiro é baseado na captura da conformação cromossomo e interações de DNA proximal em uma população de células fixas, este último, baseado na fluorescência de DNA na hibridização situ (FISH) em núcleos preservados em 3D, permite a visualização contemporânea de loci múltiplo em um único nível celular (multicolor), examinando suas interações e distribuição dentro do núcleo (3D multicolor DNA FISH). A técnica do DNA 3D multicolor FISH tem uma limitação de visualizar apenas alguns loci pré-determinados, não permitindo uma análise abrangente da arquitetura nuclear. No entanto, dada a robustez de seus resultados, o DNA FISH multicolorido 3D em combinação com microscopia 3D e reconstrução de imagens é um método possível para validar resultados baseados em tecnologia C e estudar inequivocamente a posição e organização de loci específico em um único nível celular. Aqui, propomos um método passo a passo de Peixe sna multicolorido 3D adequado para uma ampla gama de células primárias humanas e discutimos todas as ações práticas, passos cruciais, noções de imagem 3D e análise de dados necessárias para obter uma multicolor 3D bem sucedida e informativa Peixe de DNA em diferentes contextos biológicos.

Introduction

Os eucalitos mais altos precisam condensar sistematicamente e compactar uma enorme quantidade de informações genéticas no espaço 3D do núcleo1,2,3,4. Hoje, sabemos que o genoma é espacialmente encomendado em compartimentos e domínios topologicamente associados5 e que os múltiplos níveis de dobramento de DNA geram contatos entre diferentes regiões genômicas que podem envolver a formação de loop de cromromatina6,7. O looping dinâmico 3D da cromromatina pode influenciar muitos processos biológicos diferentes, como transcrição8,9, diferenciação e desenvolvimento10,11, reparação de DNA12,13, enquanto suas perturbações estão envolvidas em várias doenças14,15,16 e defeitos de desenvolvimento15,17,18.

Muitas abordagens foram desenvolvidas para estudar a organização do genoma 3D. Tecnologias baseadas em conformação cromossa (c-technologies, 3C, 4C, 5C, Hi-C e derivados) foram desenvolvidas para estudar a organização do genoma em células fixas3,4,19,20. Tais abordagens baseiam-se na capacidade de capturar as frequências de contato entre loci genômico na proximidade física. C-tecnologias, dependendo de sua complexidade, capturam a organização global do genoma 3D e a topologia nuclear de uma população celular3,4,19,20. No entanto, as interações 3D são dinâmicas no tempo e no espaço, altamente variáveis entre células individuais que consistem em interações multiplex, e são extensivamente heterogênitas21,22.

Fluorescência de DNA multicolor 3D na hibridização situ (FISH) é uma técnica que permite a visualização de loci genômico específico em um único nível celular, permitindo a investigação direta da arquitetura nuclear 3D de forma complementar às tecnologias C. Representa uma tecnologia atualmente usada para validar inequivocamente os resultados C. O DNA FISH 3D multicolor usa sondas com rótulo fluorescente complementares aos loci genômicos de interesses. O uso de diferentes fluoroforóres e equipamentos adequados de microscopia permitem a visualização contemporânea de múltiplos alvos dentro do espaço nuclear23,24. Nos últimos anos, o FISH tem sido combinado com os avanços tecnológicos na microscopia para obter a visualização de estruturas em escala fina em alta resolução25,26 ou com abordagens CRISPR-Cas para a visualização dos ácidos nucleicos em imagens vivas27,28. Apesar da ampla adoção, a abordagem 3D multicolor DNA FISH ainda é considerada difícil em muitos laboratórios porque o material biológico utilizado deve ser adaptado.

Aqui, fornecemos um protocolo abrangente para peixes de DNA multicoloridos 3D (da preparação celular/sonda à análise de dados) aplicável a uma ampla gama de células primárias humanas, permitindo a visualização de múltiplos loci genômicos e preservando a estrutura 3D de núcleos. Para estudar a arquitetura nuclear, a estrutura 3D dos núcleos deve ser preservada. Por essa razão, contrastando com outros protocolos existentes29,30,31, evitamos o uso de um gradiente de álcool e o armazenamento dos comprovantes de cobertura no álcool que podem afetar a estrutura de cromatina32. O método é adaptado a partir de protocolos de Peixe sna 3D preservados24,33 a serem aplicados a uma ampla gama de células primárias humanas, tanto ex vivo isoladas quanto cultizadas in vitro. Existem parâmetros de permeabilização e desproteína para diferentes características citológicas e citológicas nucleares (por exemplo, diferentes graus de compactação nuclear, abundância de citoesqueleto)34. Esses parâmetros são geralmente descritos em outros protocolos24,33, sem fornecer uma clara discriminação do procedimento dentro de diferentes tipos de células. Além disso, desenvolvemos uma ferramenta específica chamada NuCLεD (localizador de contatos nucleares em 3D)16, fornecendo princípios para análise de dados que melhorarão a proximidade 3D entre diferentes loci e sua distribuição topológica nuclear dentro do espaço nuclear de forma automatizada.

Protocol

1. Procedimentos de preparação e rotulagem de sondas de DNA com tradução de nick Cromossomos artificiais bacterianos purificados e limpos (BACs), plasmídeos ou produtos PCR com kits específicos (Tabela de Materiais),resuspendem no ddH2O, verifiquem por eletroforese em gel de agarose e quantificar. Realize a tradução de nick em 1,5-2 μg de DNA a partir da etapa 1.1 em um volume final de 50 μL misturando todos os reagentes em um tubo de DNA de baixa ligação de 0,5…

Representative Results

O método de DNA 3D multicolorido FISH descrito neste artigo permite a visualização contemporânea de diferentes loci genômicos dentro de núcleos 3D preservados (Figura 1B). Este protocolo permite a medição de distâncias entre alelos, e diferentes loci genômicos para avaliar sua proximidade espacial, e avaliar sua localização dentro do espaço nuclear (por exemplo, a distância loci do centroide ou da periferia dos núcleos)16. No entanto, e…

Discussion

O método atual descreve um protocolo passo a passo para executar peixes de DNA multicoloridos 3D em uma ampla gama de células primárias humanas. Embora o DNA FISH seja uma tecnologia em grande uso, o Peixe de DNA multicolorido 3D em núcleos interfásicos 3D preservados ainda é difícil de executar em muitos laboratórios, principalmente devido às características das amostras utilizadas23,24.

A tradução de nick de sonda é um p…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores reconhecem a assistência técnica do INM Imaging Facility (Istituto Nazionale di Genetica Molecolare “Romeo ed Enrica Invernizzi” (INGM), Milão, Itália), em particular C. Cordiglieri, para assistência durante imagens 3D multicolor DNA FISH Aquisição. Este trabalho tem sido apoiado pelas seguintes subvenções ao B.B.: Programa principal italiano epigen, Associação Française contre les Myopathies (AFM-Telethon, grant nr 18754) e Giovani Ricercatori, Ministério da Saúde italiano (GR-2011-02349383). Este trabalho tem sido apoiado pela seguinte concessão ao F.M.: Fondazione Cariplo (Bando Giovani, bolsa nR 2018-0321).

Materials

24-well plates Thermo Fisher Scientific 142475
6-well plates Thermo Fisher Scientific 140675
Anti-Digoxigenin 488 DBA DI7488
b-Mercaptoethanol Sigma M3148
bFGF PeproTech 100-18B
Biotin 11 d-UTP Thermo Fisher Scientific R0081
BSA (bovine serum albumine) Sigma A7030
Coverlsips Marienfeld 117500
CY3 d-UTP GE Healthcare PA53022
DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole) Thermo Fisher Scientific D21490
Deoxyribonucleic acids single strand from salmon testes Sigma D7656
Dextran sulfate (powder) Santa Cruz sc-203917A
Digoxigenin 11 d-UTP Roche 11093088910
DMEM Thermo Fisher Scientific 21969-035 500mL
DNA polymerase I Thermo Fisher Scientific 18010-017
DNase I Sigma AMPD1
dNTPs (C-G-A-T) Euroclone BL0423A/C/G
EGF Sigma E9644.2MG
Ethanol Sigma 02860-1L
FBS Hyclone Thermo Fisher Scientific SH30109
Formaldehyde solution Sigma F8775-25mL
Formamide Sigma F9037
Glutammine Thermo Fisher Scientific 25030-024 100mL
Glycerol Sigma G5516-100mL
Glycogen Thermo Fisher Scientific AM9510
HCl Sigma 30721
Human Cot-1 DNA Thermo Fisher Scientific 15279-001
Insulin Human Sigma I9278-5 mL
MgCl2 Sigma 63069
NaAc (Sodium Acetate, pH 5.2, 3 M) Sigma S2889
NaCl Sigma S9888
Paraformaldehyde Sigma 158127-25G
PBS (phosphate-buffered saline) Sigma P4417
Pennycillin/Streptavidin Thermo Fisher Scientific 15070-063 100mL
Pepsin Biorad P6887
PhasePrep BAC DNA Kit Sigma NA0100-1KT
Poly-L-lysine solution Sigma P8920
ProLong Diamond Antifade Mountant Thermo Fisher Scientific P36970
PureLink Quick Gel Extraction & PCR Purification Combo Kit Thermo Fisher Scientific K220001
PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit Thermo Fisher Scientific K210010
RNAse cocktail Thermo Fisher Scientific AM2288
Rubbercement Bostik
Slides VWR 631-0114
Streptavidina Alexa fluor 647 Thermo Fisher Scientific S21374
Tri-Sodium Citrate Sigma 1110379026
Tris-HCl Sigma T3253-500g
Triton X-100 Sigma T8787-250mL
TWEEN 20 Sigma P9416-100mL
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References

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3D Multicolor DNA FISHNuclear ArchitectureGenomic LociChromosome CaptureNick TranslationProbe PrecipitationCell FixationPermeabilizationRNAse Treatment

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Marasca, F., Cortesi, A., Manganaro, L., Bodega, B. 3D Multicolor DNA FISH Tool to Study Nuclear Architecture in Human Primary Cells. J. Vis. Exp. (155), e60712, doi:10.3791/60712 (2020).
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