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Genetics

Herramienta 3D Multicolor DNA FISH para estudiar la arquitectura nuclear en células primarias humanas

Published: January 25, 2020
doi:
10.3791/60712
, , ,
1Istituto Nazionale di Genetica Molecolare “Romeo ed Enrica Invernizzi”, INGM

Summary

3D multicolor DNA FISH representa una herramienta para visualizar múltiples loci genómicos dentro de núcleos conservados 3D, definiendo inequívocamente sus interacciones recíprocas y localización dentro del espacio nuclear a un solo nivel de célula. Aquí, se describe un protocolo paso a paso para un amplio espectro de células primarias humanas.

Abstract

Una de las principales preguntas en la biología celular es la organización genómica dentro del espacio nuclear y cómo la arquitectura de la cromatina puede influir en procesos como la expresión génica, la identidad celular y la diferenciación. Muchos enfoques desarrollados para estudiar la arquitectura 3D del genoma se pueden dividir en dos categorías complementarias: tecnologías basadas en la captura de conformación cromosómica (tecnologías C) e imágenes. Mientras que el primero se basa en la captura de la conformación cromosómica y las interacciones proximales del ADN en una población de células fijas, la segunda, basada en la hibridación in situ por fluorescencia del ADN (FISH) en núcleos conservados en 3D, permite la visualización contemporánea de múltiples loci a un solo nivel de célula (multicolor), examinando sus interacciones y distribución dentro del núcleo (3D multicolor DNA FISH). La técnica del ADN multicolor 3D FISH tiene una limitación de visualizar sólo unos pocos loci predeterminados, no permitiendo un análisis exhaustivo de la arquitectura nuclear. Sin embargo, dada la solidez de sus resultados, 3D multicolor DNA FISH en combinación con la microscopía 3D y la reconstrucción de imágenes es un método posible para validar los resultados basados en la tecnología C y para estudiar inequívocamente la posición y organización de loci específicos a un solo nivel de célula. Aquí, proponemos un método paso a paso de 3D multicolor DNA FISH adecuado para una amplia gama de células primarias humanas y discutimos todas las acciones prácticas, pasos cruciales, nociones de imagen 3D y análisis de datos necesarios para obtener un multicolor 3D exitoso e informativo DNA FISH dentro de diferentes contextos biológicos.

Introduction

Los eucariotas más altos necesitan condensar y compactar sistemáticamente una enorme cantidad de información genética en el espacio 3D minuto del núcleo1,2,3,4. Hoy en día, sabemos que el genoma está ordenado espacialmente en compartimentos y dominios topológicamente asociados5 y que los múltiples niveles de plegado de ADN generan contactos entre diferentes regiones genómicas que pueden implicar la formación de bucles de cromatina6,7. El bucle dinámico 3D de la cromatina puede influir en muchos procesos biológicos diferentes como la transcripción8,9,la diferenciación y desarrollo10,11, la reparación del ADN12,13, mientras que sus perturbaciones están implicadas en diversas enfermedades14,15,16 y defectos de desarrollo15,17,18.

Se han desarrollado muchos enfoques para estudiar la organización del genoma 3D. Se han desarrollado tecnologías basadas en la captura de conformación cromosómica (tecnologías C, 3C, 4C, 5C, Hi-C y derivados) para estudiar la organización del genoma en células fijas3,4,19,20. Estos enfoques se basan en la capacidad de capturar las frecuencias de contacto entre loci genómicos en proximidad física. Las tecnologías C, dependiendo de su complejidad, capturan la organización mundial del genoma 3D y la topología nuclear de una población celular3,4,19,20. Sin embargo, las interacciones 3D son dinámicas en el tiempo y el espacio, altamente variables entre las células individuales que consisten en interacciones multiplex, y son ampliamente heterogéneas21,22.

La hibridación in situ de la fluorescencia del ADN multicolor 3D (FISH) es una técnica que permite la visualización de loci genólicos específicos a un nivel de célula única, permitiendo la investigación directa de la arquitectura nuclear 3D de manera complementaria a las tecnologías C. Representa una tecnología utilizada actualmente para validar inequívocamente los resultados C. 3D multicolor DNA FISH utiliza sondas etiquetadas fluorescentmente complementarias a los loci genómicos de los intereses. El uso de diferentes fluoróforos y equipos de microscopía adecuados permiten la visualización contemporánea de múltiples objetivos dentro del espacio nuclear23,24. En los últimos años, FISH se ha combinado con los avances tecnológicos en microscopía para obtener la visualización de estructuras de escala fina a alta resolución25,26 o con enfoques CRISPR-Cas para la visualización de los ácidos nucleicos en imágenes en vivo27,28. A pesar de la amplia adopción, el enfoque 3D multicolor DNA FISH todavía se considera difícil en muchos laboratorios porque el material biológico utilizado debe adaptarse.

Aquí, proporcionamos un protocolo integral para el ADN 3D multicolor FISH (desde la preparación de células/sondas hasta el análisis de datos) aplicable a una amplia gama de células primarias humanas, permitiendo la visualización de múltiples loci genómicos y preservando la estructura 3D de los núcleos. Para estudiar la arquitectura nuclear, se debe preservar la estructura 3D de los núcleos. Por esta razón, contrastando con otros protocolos existentes29,30,31,evitamos el uso de un gradiente alcohólico y el almacenamiento de los cubreobjetos en alcohol que puede afectar a la estructura de la cromatina32. El método se adapta a partir de los protocolos FISH de ADN 3D conservados24,33 para aplicarse a una amplia gama de células primarias humanas, tanto aisladas ex vivo o cultivadas in vitro. Existen parámetros de permeabilización y desproteinización para diferentes morfologías nucleares y características citológicas (por ejemplo, diferentes grados de compactación nuclear, abundancia de citoesqueleto)34. Estos parámetros se describen generalmente en otros protocolos24,33, sin proporcionar una clara discriminación del procedimiento dentro de diferentes tipos de células. Además, desarrollamos una herramienta específica llamada NuCL-D (localizador de contactos nucleares en 3D)16,proporcionando principios para el análisis de datos que mejorarán la proximidad 3D entre diferentes loci y su distribución topológica nuclear dentro del espacio nuclear de forma automatizada.

Protocol

1. Procedimientos de preparación y etiquetado de la sonda de ADN con traducción de nick Purificar y limpiar cromosomas artificiales bacterianos (BAC), plásmidos o productos PCR con kits específicos(Tabla de materiales),resuspender en ddH2O, comprobar por electroforesis en un gel de agarosa y cuantificar. Realice la traducción de nicks en 1,5 x 2 g de ADN a partir del paso 1.1 en un volumen final de 50 l mezclando todos los reactivos en un tubo de ADN de unión baja de …

Representative Results

El método de ADN multicolor 3D FISH descrito en este artículo permite la visualización contemporánea de diferentes loci genómicos dentro de los núcleos 3D conservados(Figura 1B). Este protocolo permite medir las distancias entre los alelos y los diferentes loci genómicos para evaluar su proximidad espacial, y evaluar su ubicación dentro del espacio nuclear (por ejemplo, la distancia de loci desde el centroide o la periferia de los núcleos)16….

Discussion

El método actual describe un protocolo paso a paso para realizar ADN FISH multicolor 3D en una amplia gama de células primarias humanas. Aunque DNA FISH es una tecnología de uso amplio, el ADN 3D multicolor FISH en núcleos interfásicos 3D conservados sigue siendo difícil de realizar en muchos laboratorios, principalmente debido a las características de las muestras utilizadas23,24.

La traducción de nick de sonda es un paso fund…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores reconocen la asistencia técnica del INGM Imaging Facility (Istituto Nazionale di Genetica Molecolare “Romeo ed Enrica Invernizzi” (INGM), Milán, Italia), en particular C. Cordiglieri, para la asistencia durante las imágenes 3D multicolor DNA FISH Adquisición. Este trabajo ha sido apoyado por las siguientes subvenciones a B.B.: el programa insignia italiano EPIGEN, la Asociación Francesa contre les Myopathies (AFM-Telethon, grant nr 18754) y Giovani Ricercatori, Ministerio de Salud de Italia (GR-2011-02349383). Este trabajo ha sido apoyado por la siguiente subvención a F.M.: Fondazione Cariplo (Bando Giovani, grant nr 2018-0321).

Materials

24-well plates Thermo Fisher Scientific 142475
6-well plates Thermo Fisher Scientific 140675
Anti-Digoxigenin 488 DBA DI7488
b-Mercaptoethanol Sigma M3148
bFGF PeproTech 100-18B
Biotin 11 d-UTP Thermo Fisher Scientific R0081
BSA (bovine serum albumine) Sigma A7030
Coverlsips Marienfeld 117500
CY3 d-UTP GE Healthcare PA53022
DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole) Thermo Fisher Scientific D21490
Deoxyribonucleic acids single strand from salmon testes Sigma D7656
Dextran sulfate (powder) Santa Cruz sc-203917A
Digoxigenin 11 d-UTP Roche 11093088910
DMEM Thermo Fisher Scientific 21969-035 500mL
DNA polymerase I Thermo Fisher Scientific 18010-017
DNase I Sigma AMPD1
dNTPs (C-G-A-T) Euroclone BL0423A/C/G
EGF Sigma E9644.2MG
Ethanol Sigma 02860-1L
FBS Hyclone Thermo Fisher Scientific SH30109
Formaldehyde solution Sigma F8775-25mL
Formamide Sigma F9037
Glutammine Thermo Fisher Scientific 25030-024 100mL
Glycerol Sigma G5516-100mL
Glycogen Thermo Fisher Scientific AM9510
HCl Sigma 30721
Human Cot-1 DNA Thermo Fisher Scientific 15279-001
Insulin Human Sigma I9278-5 mL
MgCl2 Sigma 63069
NaAc (Sodium Acetate, pH 5.2, 3 M) Sigma S2889
NaCl Sigma S9888
Paraformaldehyde Sigma 158127-25G
PBS (phosphate-buffered saline) Sigma P4417
Pennycillin/Streptavidin Thermo Fisher Scientific 15070-063 100mL
Pepsin Biorad P6887
PhasePrep BAC DNA Kit Sigma NA0100-1KT
Poly-L-lysine solution Sigma P8920
ProLong Diamond Antifade Mountant Thermo Fisher Scientific P36970
PureLink Quick Gel Extraction & PCR Purification Combo Kit Thermo Fisher Scientific K220001
PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit Thermo Fisher Scientific K210010
RNAse cocktail Thermo Fisher Scientific AM2288
Rubbercement Bostik
Slides VWR 631-0114
Streptavidina Alexa fluor 647 Thermo Fisher Scientific S21374
Tri-Sodium Citrate Sigma 1110379026
Tris-HCl Sigma T3253-500g
Triton X-100 Sigma T8787-250mL
TWEEN 20 Sigma P9416-100mL
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References

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3D Multicolor DNA FISHNuclear ArchitectureGenomic LociChromosome CaptureNick TranslationProbe PrecipitationCell FixationPermeabilizationRNAse Treatment

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Marasca, F., Cortesi, A., Manganaro, L., Bodega, B. 3D Multicolor DNA FISH Tool to Study Nuclear Architecture in Human Primary Cells. J. Vis. Exp. (155), e60712, doi:10.3791/60712 (2020).
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