JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Genetics

3D Multicolor DNA FISH Tool to Study Nuclear Architecture in Human Primary Cells 3D Multicolor DNA FISH Tool to Study Nuclear Architecture in Human Primary Cells 3D Multicolor DNA FISH Tool to Study Nuclear Architecture in Human Primary Cells 3D

Published: January 25, 2020
doi:
10.3791/60712
, , ,
1Istituto Nazionale di Genetica Molecolare “Romeo ed Enrica Invernizzi”, INGM

Summary

3D multicolor DNA FISH representerar ett verktyg för att visualisera flera genomiska loci inom 3D bevarade kärnor, entydigt definiera deras ömsesidiga interaktioner och lokalisering inom kärnområdet på en enda cell nivå. Här beskrivs ett steg för steg protokoll för ett brett spektrum av mänskliga primära celler.

Abstract

En viktig fråga inom cellbiologi är genomisk organisation inom kärnområdet och hur kromatinarkitekturen kan påverka processer som genuttryck, cellidentitet och differentiering. Många metoder som utvecklats för att studera 3D-arkitekturen i genomet kan delas in i två kompletterande kategorier: kromosomkonformation fånga baserad teknik (C-teknik) och avbildning. Medan den förstnämnda bygger på att fånga kromosomkonformisering och proximala DNA-interaktioner i en population av fasta celler, möjliggör den senare, baserad på DNA-fluorescens in situ-hybridisering (FISH) på 3D-konserverad kärnor, samtida visualisering av flera lokpå en enda cellnivå (multicolor), undersöka deras interaktioner och distribution inom kärnan (3D multicolor DNA FISH). Tekniken för 3D multicolor DNA FISH har en begränsning av att visualisera endast ett fåtal förutbestämda lok, inte tillåter en omfattande analys av kärnarkitekturen. Med tanke på robustheten i dess resultat är 3D multicolor DNA FISH i kombination med 3D-mikroskopi och bildrekonstruktion en möjlig metod för att validera C-teknikbaserade resultat och att entydigt studera position och organisation av specifika loki på en enda cellnivå. Här föreslår vi en steg för steg metod för 3D multicolor DNA FISH lämplig för ett brett spektrum av mänskliga primära celler och diskutera alla praktiska åtgärder, avgörande steg, föreställningar om 3D-bildframställning och dataanalys som behövs för att få en framgångsrik och informativ 3D multicolor DNA FISH i olika biologiska sammanhang.

Introduction

Högre eukaryoter måste systematiskt kondensera och komprimera en enorm mängd genetisk information i minuten 3D-rymden av kärnan1,2,3,4. Idag vet vi att genomet är rumsligt beställt i fack och topologiskt associerade domäner5 och att de många nivåerna av DNA-vikning generera kontakter mellan olika genomiska regioner som kan innebära kromatin loop formation6,7. Den dynamiska 3D-loopning av kromatin kan påverka många olika biologiska processer såsom transkription8,9, differentiering och utveckling10,11 , DNA reparation12,13, medan dess störning är inblandade i olika sjukdomar14,15,16 och utvecklingsdefekter15,17,18.

Många metoder har utvecklats för att studera 3D-genomorganisationen. Kromosomkonformation capture-baserad teknik (C-teknik, 3C, 4C, 5C, Hi-C och derivat) har utvecklats för att studera genomorganisation i fasta celler3,4,19,20. Sådana metoder bygger på förmågan att fånga kontaktfrekvenserna mellan genomisk loci i fysisk närhet. C-teknik, beroende på deras komplexitet, fånga den globala 3D-genomorganisationen och kärntopologi av en cellpopulation3,4,19,20. Ändå är 3D-interaktioner dynamiska i tid och rum, mycket varierande mellan enskilda celler som består av multiplexinteraktioner och är i stor utsträckning heterogena21,22.

3D multicolor DNA fluorescens in situ hybridisering (FISH) är en teknik som möjliggör visualisering av specifika genomiska lokus på en enda cell nivå, vilket möjliggör direkt undersökning av 3D nukleär arkitektur på ett kompletterande sätt till C-teknik. Det representerar en teknik som för närvarande används för att entydigt validera C-resultat. 3D multicolor DNA FISH använder fluorescerande märkta sonder som kompletterar den genomiska loci av intressen. Användningen av olika fluoroforer och lämplig mikroskopiutrustning möjliggör modern visualisering av flera mål inom kärnområdet23,24. Under de senaste åren har FISH kombinerats med tekniska framsteg inom mikroskopi för att få visualisering av finskaliga strukturer med hög upplösning25,26 eller med CRISPR-Cas metoder för visualisering av nukleinsyror i levande bildbehandling27,28. Trots bred användning anses 3D multicolor DNA FISH-metoden fortfarande vara svår i många laboratorier eftersom det biologiska material som används måste anpassas.

Här tillhandahåller vi ett omfattande protokoll för 3D multicolor DNA FISH (från cell / sond förberedelse till dataanalys) gäller för ett brett spektrum av mänskliga primära celler, vilket möjliggör visualisering av flera genomiska loci och bevara 3D-strukturen av kärnor. För att studera kärnarkitektur måste kärnkärnans 3D-struktur bevaras. Av denna anledning, kontrasterande från andra befintliga protokoll29,30,31,undviker vi användning av en alkoholgradient och lagring av täckslips i alkohol som kan påverka kromatin struktur32. Metoden är anpassad från konserverade 3D DNA FISH protokoll24,33 som skall tillämpas på ett brett spektrum av mänskliga primära celler, både isolerade ex vivo eller odlade in vitro. Det finns permeabiliserings- och deproteiniseringsparametrar för olika nukleärmorfologi och cytologiska egenskaper (t.ex. olika grader av kärnpackning, cytoskelettförekomst)34. Dessa parametrar beskrivs ofta allmänt i andra protokoll24,33, utan att ge en tydlig diskriminering av förfarandet inom olika celltyper. Dessutom utvecklade vi ett specifikt verktyg som heter NuCLεD (nukleära kontakter locator i 3D)16, som ger principer för dataanalys som kommer att förbättra 3D-närheten mellan olika lokoch deras nukleära topologiska distribution inom kärnområdet på ett automatiserat sätt.

Protocol

1. Förfaranden och märkning av DNA-sond med nicköversättning Rena och rena bakteriella konstgjorda kromosomer (BACs), plasmider eller PCR-produkter med specifika satser (Materialförteckning), omfördelning i ddH2O, kontrollera genom elektrofores på en agarosgel och kvantifiering. Utför nicköversättning på 1,5−2 μg DNA från steg 1.1 i en slutlig volym på 50 μL genom att blanda alla reagenser i ett 0,5 ml lågbindande DNA-rör enligt tabell 1….

Representative Results

Metoden för 3D multicolor DNA FISH beskrivs i denna artikel tillåter samtida visualisering av olika genomiska loci inom konserverad 3D-kärnor(figur 1B). Detta protokoll tillåter mätning av avstånd mellan alllerar och olika genomisk lokus för att utvärdera deras rumsliga närhet och att bedöma deras läge inom kärnområdet (t.ex. lokavstånd från centroid eller periferin av kärnorna)16. Det finns dock många viktiga steg som måste ställas…

Discussion

Den nuvarande metoden beskriver ett steg för steg protokoll för att utföra 3D multicolor DNA FISH på ett brett spektrum av mänskliga primära celler. Även om DNA FISH är en teknik i stor användning, 3D multicolor DNA FISH på konserverad 3D interfas kärnor är fortfarande svårt att utföra i många laboratorier, främst på grund av egenskaperna hos de prover som används23,24.

Sond nick översättning är ett grundläggande …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Författarna erkänner det tekniska biståndet av INGM Imaging Facility (Istituto Nazionale di Genetica Molecolare “Romeo ed Enrica Invernizzi” (INGM), Milano, Italien), särskilt C. Cordiglieri, för hjälp under 3D multicolor DNA FISH bilder Förvärv. Detta arbete har stötts av följande bidrag till B.B.: EPIGEN italienska flaggskeppsprogram, Association Française contre les Myopathies (AFM-Telethon, grant nr 18754) och Giovani Ricercatori, italienska hälsoministeriet (GR-2011-02349383). Detta arbete har fått stöd av följande bidrag till M.M.: Fondazione Cariplo (Bando Giovani, grant nr 2018-0321).

Materials

24-well plates Thermo Fisher Scientific 142475
6-well plates Thermo Fisher Scientific 140675
Anti-Digoxigenin 488 DBA DI7488
b-Mercaptoethanol Sigma M3148
bFGF PeproTech 100-18B
Biotin 11 d-UTP Thermo Fisher Scientific R0081
BSA (bovine serum albumine) Sigma A7030
Coverlsips Marienfeld 117500
CY3 d-UTP GE Healthcare PA53022
DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole) Thermo Fisher Scientific D21490
Deoxyribonucleic acids single strand from salmon testes Sigma D7656
Dextran sulfate (powder) Santa Cruz sc-203917A
Digoxigenin 11 d-UTP Roche 11093088910
DMEM Thermo Fisher Scientific 21969-035 500mL
DNA polymerase I Thermo Fisher Scientific 18010-017
DNase I Sigma AMPD1
dNTPs (C-G-A-T) Euroclone BL0423A/C/G
EGF Sigma E9644.2MG
Ethanol Sigma 02860-1L
FBS Hyclone Thermo Fisher Scientific SH30109
Formaldehyde solution Sigma F8775-25mL
Formamide Sigma F9037
Glutammine Thermo Fisher Scientific 25030-024 100mL
Glycerol Sigma G5516-100mL
Glycogen Thermo Fisher Scientific AM9510
HCl Sigma 30721
Human Cot-1 DNA Thermo Fisher Scientific 15279-001
Insulin Human Sigma I9278-5 mL
MgCl2 Sigma 63069
NaAc (Sodium Acetate, pH 5.2, 3 M) Sigma S2889
NaCl Sigma S9888
Paraformaldehyde Sigma 158127-25G
PBS (phosphate-buffered saline) Sigma P4417
Pennycillin/Streptavidin Thermo Fisher Scientific 15070-063 100mL
Pepsin Biorad P6887
PhasePrep BAC DNA Kit Sigma NA0100-1KT
Poly-L-lysine solution Sigma P8920
ProLong Diamond Antifade Mountant Thermo Fisher Scientific P36970
PureLink Quick Gel Extraction & PCR Purification Combo Kit Thermo Fisher Scientific K220001
PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit Thermo Fisher Scientific K210010
RNAse cocktail Thermo Fisher Scientific AM2288
Rubbercement Bostik
Slides VWR 631-0114
Streptavidina Alexa fluor 647 Thermo Fisher Scientific S21374
Tri-Sodium Citrate Sigma 1110379026
Tris-HCl Sigma T3253-500g
Triton X-100 Sigma T8787-250mL
TWEEN 20 Sigma P9416-100mL
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cremer, T., Cremer, C. Chromosome territories, nuclear architecture and gene regulation in mammalian cells. Nature Reviews: Genetics. 2 (4), 292-301 (2001).
  2. Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 326 (5950), 289-293 (2009).
  3. Schmitt, A. D., Hu, M., Ren, B. Genome-wide mapping and analysis of chromosome architecture. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 17 (12), 743-755 (2016).
  4. Bonev, B., Cavalli, G. Organization and function of the 3D genome. Nature Reviews: Genetics. 17 (12), 772 (2016).
  5. van Steensel, B., Furlong, E. E. M. The role of transcription in shaping the spatial organization of the genome. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 20 (6), 327-337 (2019).
  6. Rajarajan, P., Gil, S. E., Brennand, K. J., Akbarian, S. Spatial genome organization and cognition. Nature Reviews: Neuroscience. 17 (11), 681-691 (2016).
  7. Pombo, A., Dillon, N. Three-dimensional genome architecture: players and mechanisms. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 16 (4), 245-257 (2015).
  8. Fanucchi, S., Shibayama, Y., Burd, S., Weinberg, M. S., Mhlanga, M. M. Chromosomal contact permits transcription between coregulated genes. Cell. 155 (3), 606-620 (2013).
  9. Therizols, P., et al. Chromatin decondensation is sufficient to alter nuclear organization in embryonic stem cells. Science. 346 (6214), 1238-1242 (2014).
  10. Gonzalez-Sandoval, A., et al. Perinuclear Anchoring of H3K9-Methylated Chromatin Stabilizes Induced Cell Fate in C. elegans Embryos. Cell. 163 (6), 1333-1347 (2015).
  11. Hubner, B., et al. Remodeling of nuclear landscapes during human myelopoietic cell differentiation maintains co-aligned active and inactive nuclear compartments. Epigenetics Chromatin. 8, 47 (2015).
  12. Aymard, F., et al. Genome-wide mapping of long-range contacts unveils clustering of DNA double-strand breaks at damaged active genes. Nature Structural & Molecular Biology. 24 (4), 353-361 (2017).
  13. Sellou, H., et al. The poly(ADP-ribose)-dependent chromatin remodeler Alc1 induces local chromatin relaxation upon DNA damage. Molecular Biology of the Cell. 27 (24), 3791-3799 (2016).
  14. Krijger, P. H., de Laat, W. Regulation of disease-associated gene expression in the 3D genome. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 17 (12), 771-782 (2016).
  15. Lupianez, D. G., Spielmann, M., Mundlos, S. Breaking TADs: How Alterations of Chromatin Domains Result in Disease. Trends in Genetics. 32 (4), 225-237 (2016).
  16. Cortesi, A., et al. 4q-D4Z4 chromatin architecture regulates the transcription of muscle atrophic genes in facioscapulohumeral muscular dystrophy. Genome Research. 29 (6), 883-895 (2019).
  17. Woltering, J. M., Noordermeer, D., Leleu, M., Duboule, D. Conservation and divergence of regulatory strategies at Hox Loci and the origin of tetrapod digits. PLoS Biology. 12 (1), 1001773 (2014).
  18. Woltering, J. M., Duboule, D. Tetrapod axial evolution and developmental constraints; Empirical underpinning by a mouse model. Mechanisms of Development. 138, 64-72 (2015).
  19. de Laat, W., Dekker, J. 3C-based technologies to study the shape of the genome. Methods. 58 (3), 189-191 (2012).
  20. Denker, A., de Laat, W. The second decade of 3C technologies: detailed insights into nuclear organization. Genes & Development. 30 (12), 1357-1382 (2016).
  21. Finn, E. H., et al. Extensive Heterogeneity and Intrinsic Variation in Spatial Genome Organization. Cell. 176 (6), 1502-1515 (2019).
  22. Zheng, M., et al. Multiplex chromatin interactions with single-molecule precision. Nature. 566 (7745), 558-562 (2019).
  23. Solovei, I. Fluorescence in situ hybridization (FISH) on tissue cryosections. Methods in Molecular Biology. 659, 71-82 (2010).
  24. Cremer, M., et al. Multicolor 3D fluorescence in situ hybridization for imaging interphase chromosomes. Methods in Molecular Biology. 463, 205-239 (2008).
  25. Legant, W. R., et al. High-density three-dimensional localization microscopy across large volumes. Nature Methods. 13 (4), 359-365 (2016).
  26. Jungmann, R., et al. Quantitative super-resolution imaging with qPAINT. Nature Methods. 13 (5), 439-442 (2016).
  27. Chen, B., et al. Dynamic imaging of genomic loci in living human cells by an optimized CRISPR/Cas system. Cell. 155 (7), 1479-1491 (2013).
  28. Nelles, D. A., et al. Programmable RNA Tracking in Live Cells with CRISPR/Cas9. Cell. 165 (2), 488-496 (2016).
  29. Byron, M., Hall, L. L., Lawrence, J. B. A multifaceted FISH approach to study endogenous RNAs and DNAs in native nuclear and cell structures. Current Protocol of Human Genetics. , 15 (2013).
  30. Chaumeil, J., Augui, S., Chow, J. C., Heard, E. Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation. Methods in Molecular Biology. 463, 297-308 (2008).
  31. Takizawa, T., Gudla, P. R., Guo, L., Lockett, S., Misteli, T. Allele-specific nuclear positioning of the monoallelically expressed astrocyte marker GFAP. Genes & Development. 22 (4), 489-498 (2008).
  32. Kraus, F., et al. Quantitative 3D structured illumination microscopy of nuclear structures. Nature Protocols. 12 (5), 1011-1028 (2017).
  33. Solovei, I., Cremer, M. 3D-FISH on cultured cells combined with immunostaining. Methods in Molecular Biology. 659, 117-126 (2010).
  34. Skinner, B. M., Johnson, E. E. Nuclear morphologies: their diversity and functional relevance. Chromosoma. 126 (2), 195-212 (2017).
  35. Schoenfelder, S., et al. The pluripotent regulatory circuitry connecting promoters to their long-range interacting elements. Genome Research. 25 (4), 582-597 (2015).
  36. Lubeck, E., Cai, L. Single-cell systems biology by super-resolution imaging and combinatorial labeling. Nature Methods. 9 (7), 743-748 (2012).
  37. Beliveau, B. J., et al. Single-molecule super-resolution imaging of chromosomes and in situ haplotype visualization using Oligopaint FISH probes. Nature Communication. 6, 7147 (2015).
  38. Beliveau, B. J., et al. Versatile design and synthesis platform for visualizing genomes with Oligopaint FISH probes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (52), 21301-21306 (2012).
  39. Samacoits, A., et al. A computational framework to study sub-cellular RNA localization. Nature Communication. 9 (1), 4584 (2018).
  40. Cardozo Gizzi, A. M., et al. Microscopy-Based Chromosome Conformation Capture Enables Simultaneous Visualization of Genome Organization and Transcription in Intact Organisms. Molecular Cell. 74 (1), 212-222 (2019).
  41. Mateo, L. J., et al. Visualizing DNA folding and RNA in embryos at single-cell resolution. Nature. 568 (7750), 49-54 (2019).
  42. Nir, G., et al. Walking along chromosomes with super-resolution imaging, contact maps, and integrative modeling. PLoS Genetics. 14 (12), 1007872 (2018).
  43. Bintu, B., et al. Super-resolution chromatin tracing reveals domains and cooperative interactions in single cells. Science. 362 (6413), (2018).

Tags

3D Multicolor DNA FISHNuclear ArchitectureGenomic LociChromosome CaptureNick TranslationProbe PrecipitationCell FixationPermeabilizationRNAse Treatment

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Marasca, F., Cortesi, A., Manganaro, L., Bodega, B. 3D Multicolor DNA FISH Tool to Study Nuclear Architecture in Human Primary Cells. J. Vis. Exp. (155), e60712, doi:10.3791/60712 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image