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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

Analisi della distribuzione tumorale e tissutale dell'anticorpo terapeutico specifico dell'antigene bersaglio

Published: May 16, 2020 doi: 10.3791/60727
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,2, 3, 1,2
1Laboratory of Novel Biologics, University of Virginia School of Medicine, 2Department of Biochemistry and Molecular Genetics, UVA Cancer Center, University of Virginia School of Medicine, 3Center for Comparative Medicine, University of Virginia
* These authors contributed equally

Summary

Qui presentiamo un protocollo per studiare la localizzazione in vivo degli anticorpi nei modelli di xenograft tumorale dei topi.

Abstract

Gli anticorpi monoclonali sono farmaci multifunzionali ad alta affinità che funzionano con meccanismi indipendenti variabili per eliminare le cellule tumorali. Negli ultimi decenni, il campo dei coniugati anticorpo-farmaco, degli anticorpi bispecifici, dei recettori degli antigeni chimerici (CAR) e dell'immunoterapia oncologica è emerso come l'area più promettente delle indagini di base e terapeutiche. Con numerosi studi umani di successo che prendono di mira i recettori del checkpoint immunitario e le cellule CAR-T nella leucemia e nel melanoma a un ritmo rivoluzionario, è un momento molto emozionante per le terapie oncologiche derivate dalle variazioni dell'ingegneria degli anticorpi. Purtroppo, un numero significativamente elevato di anticorpi e terapie a base di CAR si sono dimostrati deludenti anche negli studi sull'uomo di tumori solidi a causa della limitata disponibilità di cellule dell'effettore immunitario nel letto tumorale. È importante sottolineare che anche la distribuzione aspecifica di anticorpi terapeutici in tessuti diversi dai tumori contribuisce alla mancanza di efficacia clinica, tossicità associata e insufficienza clinica. Poiché la fedele traduzione di studi preclinici su percorsi clinici umani è altamente basata sull'efficacia dello xenograft tumorale dei topi e sugli studi di sicurezza, qui evidenziamo un metodo per testare il tumore e la distribuzione generale dei tessuti degli anticorpi terapeutici. Ciò si ottiene etichettando l'anticorpo purificato proteina-A con colorante fluorescente vicino all'infrarosso seguito da immagini dal vivo di topi portanti di tumore.

Introduction

La FDA approvò il primo anticorpo monoclonale che prendeva di mira CD3 (OKT3, Muromonab) nel 19861,2. Da allora per i prossimi vent'anni, c'è stata una rapida esplosione nel campo dell'ingegneria degli anticorpi a causa del travolgente successo degli anticorpi contro gli inibitori del checkpointimmunitario 3. Oltre all'attivazione indiretta del sistema immunitario, gli anticorpi sono mirati a segnalare direttamente le cellule tumorali per coinvolgere con precisione le cellule dell'effettore immunitario, innescare la citotossicità attraverso l'agonista del recettore della morte, bloccare la segnalazione di sopravvivenza delle cellule tumorali, ostruire l'angiogenesi (crescita dei vasi sanguigni), vincolare i regolatori del checkpoint immunitario, fornire radioisotopi, farmaci chemioterapici e siRNA come agenti coniugati2. Inoltre, lo studio dei frammenti variabili a catena singola (scFv) di vari anticorpi sulla superficie delle cellule T derivate dal paziente e delle cellule NK (CAR-T e CAR-NK) è un'area in rapida crescita di indagini cliniche per terapie a base cellulare4.

L'altissima affinità dei farmaci a base di anticorpi che fornisce selettività all'antigene che esprime le cellule tumorali lo rende un agente attraente. Allo stesso modo, il parto mirato e la ritenzione tumorale di un anticorpo terapeutico (o di un farmaco chimico) è la chiave per bilanciare l'efficacia rispetto alla tossicità. Pertanto, un gran numero di strategie basate sull'ingegneria proteica che includono ma non sono limitate agli anticorpibispecifici 5 e trispecifici6 vengono sfruttati per migliorare significativamente la ritenzione tumorale ottimizzata dell'avidità delle terapie iniettate per via endovenosa (IV)5,7. Qui, descriviamo un semplice metodo basato sulla fluorescenza per affrontare la distribuzione tumorale e tissutale di anticorpi anti-cancro potenzialmente efficaci.

Poiché i tessuti animali possiedono autofluorescenza quando eccitati nello spettro visibile, gli anticorpi sono stati inizialmente etichettati con colorante vicino all'infrarosso (ad esempio, IRDye 800CW). Per prove di indagini concettuali, abbiamo fatto uso di anticorpi di targeting del recettore del folato alfa-1 (FOLR1) chiamati farletuzumab e del suo derivato chiamato anticorpo Cytotoxicity di ancoraggio bispecifico (BaCa)7 che copresi bersagli FOLR1 e recettore della morte-5 (DR5)8 in un anticorpo ricombinante. FOLR1 è un recettore bersaglio sovraespresso ben definito nelle cellule tumorali ovarico e TNBC, negli xenografti tumorali e nei tumori deipazienti 9. In particolare, ci sono molteplici sforzi per sfruttare clinicamente FOLR1 utilizzando approcci basati su anticorpi per coinvolgere cellule dell'effettore immunitario e coniugati di farmaci anticorpali (ADC) per tumori ovarico emammario 10,11.

In questo documento sui metodi, abbiamo clonato, espresso e purificato l'anti-FOLR1 clinico (farletuzumab) insieme ad altri anticorpi di controllo utilizzando il sistema di espressione CHO. L'isotipo IgG1 e un anticorpo clinico anti-idiotipo mucina-16 chiamato abagovomab12 sono stati utilizzati come controlli negativi. A seguito della purificazione proteina-A, gli anticorpi indicati sono stati etichettati con IRDye 800CW e sono stati somministrati nella vena di coda di topi nudi con xenografti tumorali ovarico o FOLR1 umano stabilmente trasfetto che esprime xenografti di cancro del colon murino. La localizzazione degli anticorpi è stata monitorata mediante imaging dal vivo utilizzando spettro di imaging in vivo in più punti di tempodiversi 7. Questo metodo non richiede alcuna modifica genetica o iniezione del substrato per consentire l'emissione luminosa ed è significativamente più veloce, conveniente ed efficiente. Il protocollo generale di clonazione, espressione, purificazione ed etichettatura descritto di seguito può essere applicato a qualsiasi anticorpo clinico e non clinico se sono disponibili sequenze di catene pesanti e leggere.

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Protocol

Tutte le procedure che coinvolgono la manipolazione degli animali e gli studi sugli xenografti tumorali sono state riviste e approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) qui all'Università della Virginia e conformi ai pertinenti standard normativi

1. Espressione e purificazione degli anticorpi

  1. Mantenimento delle celle CHO
    1. Far crescere le cellule CHO in FreeStyle CHO Media integrato con integratore di glutammina 1x disponibile in commercio a 37 °C tremando a 130 giri/min con 5% di CO2 utilizzando flaconi delong Erlenmeyer in vetro o monouso.
      NOTA: Si consiglia vivamente di utilizzare un pallone sconcertato con tappo ventilato per una maggiore agitazione e per migliorare il trasferimento di gas durante le condizioni di scuotimento. Significativamente ridotta la resa degli anticorpi è stata ottenuta con fiasche regolari (non sconcertate) a causa della limitata agitazione della coltura di sospensione.
    2. Mantenere il numero di cella compreso tra 1-5 x 106 celle/mL con >95% di vitalità cellulare. Se il numero di celle aumenta di oltre 5 x 106 celle/mL, dividere le celle. Non consente mai alle celle CHO di raggiungere meno di 0,2 x 106 celle/mL.
  2. Trasfezione di cellule CHO
    1. Far crescere le cellule CHO in 200 mL di supporti (2 x 106 celle/mL) in fiasche sconcertate delong Erlenmeyer.
      NOTA: Le colture di sospensione coltivate in fiasche sconcertate hanno sempre prodotto rese proteiche più elevate rispetto a quando coltivate in fiasche non sconcertate.
    2. In un tubo da 15 mL, prendi 5 ml di supporti CHO FreeStyle e aggiungi 50 μg di DNA clone VH e 75 μg di DNA clone VL. Vortice da mescolare bene.
    3. Incubare la miscela di DNA a temperatura ambiente per 5 minuti.
      NOTA: Un'incubazione più lunga riduce le rese proteiche.
    4. Aggiungere 750 μL di 1 mg/mL di polietileneimina (PEI) alla soluzione di DNA e vortice aggressivo la miscela per 30 s. Incubare a temperatura ambiente per ulteriori 5 minuti.
      NOTA: Il PEI deve essere reso fresco. Il ciclo di disgelo multiplo di PEI riduce significativamente la resa complessiva.
    5. Aggiungere l'intera miscela di DNA e PEI sulle cellule mentre si scuote manualmente il pallone. Incubare immediatamente i flaconi sconcertati delong Erlenmeyer con cellule a 37 °C che tremano a 130 giri/min.
  3. Espressione
    NOTA: L'anticorpo ha un peptide del segnale secretorio progettato fino all'estremità N-terminale, che aiuta gli anticorpi a essere secreti nel supporto.
    1. Far crescere le cellule trasfette a 37 °C, tremando a 130 giri/min il giorno 1.
    2. Il giorno 2, aggiungere 2 mL di 100x agente anti-grumo e 2 mL di soluzione antibatterica-antimicotica 100x. Spostare il pallone a temperatura più bassa (32-34 °C), con scuotimento a 130 giri/min.
    3. Ogni quinto giorno, aggiungere 10 mL di mangime Tryptone N1 e 2 mL di integratore di glutammina 100x.
    4. Continuare a contare le cellule ogni tre giorni usando l'emocitometro dopo aver macchiato un'aliquota di cellule con macchia blu tripano. Assicurarsi che la vitalità della cella rimanga al di sopra dell'80%.
    5. Il giorno 10 o 11, raccogliere il mezzo per la purificazione degli anticorpi. Ruotare la coltura a 3000 x g,4 °C per 40-60 min e quindi filtrare il supporto chiaro utilizzando filtri di bottiglia da 0,22 μM.
  4. Purificazione
    NOTA: La purificazione degli anticorpi viene eseguita utilizzando la colonna Protein-A disponibile in commercio (vedi Tabella dei materiali), utilizzando una pompa peristaltica.
    1. Equilibrare la colonna con due colonne di tampone di legame (20 mM di fosfato di sodio a pH 7.4).
    2. Passare il supporto filtrato contenente anticorpi (ottenuto nel passaggio 1.3.5) attraverso la colonna alla portata di 1 mL/min.
    3. Lavare la colonna con un volume di due colonne di buffer di associazione.
    4. Eludere l'anticorpo in frazioni di 500 μL utilizzando un tampone di eluizione di 5 mL (acetato di sodio da 30 mM a pH 3,4).
    5. Neutralizzare il pH dell'anticorpo eluitato aggiungendo 10 μL di tampone di neutralizzazione (3 M acetato di sodio a pH 9) per frazione.
      NOTA: La frazione numero 3-6 contiene la maggior parte dell'anticorpo. Si consiglia di mantenere tutte le frazioni nel caso in cui l'anticorpo sia eluitato in una frazione successiva al previsto.
    6. Misurare la concentrazione di anticorpi purificati utilizzando uno spettrofotometro selezionando il protocollo predefinito per IgG. La concentrazione finale dell'anticorpo si ottiene in mg/mL considerando il peso molecolare e il coefficiente di assorbimento.

2. Etichettatura fluorescente

NOTA: Gli anticorpi sono etichettati con il colorante infrarosso che contiene un gruppo reattivo estere NHS, che si accoppia alle proteine e forma un coniugato stabile. Questa reazione è sensibile al pH e funziona meglio a pH 8.5. I coniugati fluorescenti etichettati con il colorante mostrano un assorbimento massimo di 774 nm e un'emissione massima di 789 nm. pH 8.5 è fondamentale per una coniugazione efficace.

  1. Dializzare 0,5 mL dell'anticorpo utilizzando una cassetta di dialisi (0,1-0,5 mL) in 1 L di tampone di coniugazione (tampone fosfato da 50 mM a pH 8,5). Dopo 4 ore trasferire la cassetta di dialisi in tampone fresco e dializzare durante la notte.
  2. Impostare una reazione di coniugazione aggiungendo 0,03 mg di IRDye 800CW per 1 mg di anticorpo in un volume di reazione di 500 μL.
    NOTA: IRDye 800CW viene sciolto in DMSO ad una concentrazione di 10 mg/mL.
  3. Effettuare reazioni di etichettatura per 2 ore a 20 °C.
    NOTA: Aumentare il tempo oltre le 2 ore non migliora l'etichettatura.
  4. Purificare i coniugati etichettati per ampia dialisi contro 1x PBS.
  5. Stimare il grado di etichettatura misurando l'assorbanza del colorante a 780 nm e l'assorbanza della proteina a 280 nm. Il contributo colorante al segnale a 280 nm è del 3%.
  6. Calcola il rapporto colorante/proteina usando questa formula:
    Equation 1
    dove 0,03 è un fattore di correzione per l'assorbanza del colorante utilizzato a 280 nm (pari al 3,0 % della sua assorbanza a 780 nm), εDye e εProtein sono coefficienti di estinzione molare rispettivamente per il colorante e la proteina (anticorpo).
    NOTA: εDye è 270.000 M-1 cm-1 e εProtein è 203.000 M-1 cm-1 (per un tipico IgG) in miscela 1:1 di PBS: metanolo. Proteine diverse dall'IgG possono avere coefficienti di estinzione molare molto diversi. L'uso di un corretto coefficiente di estinzione per la proteina di interesse è essenziale per una determinazione accurata del rapporto D/P.
  7. Calcola la concentrazione finale di proteine usando questa formula:
    Equation 2
    NOTA: Confermare sempre l'efficacia legante l'antigene di anticorpi etichettati e non etichettati utilizzando ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) o citometria del flusso prima di procedere a studi in vivo.

3. Studi di xenograft di topo

  1. Preparazione di cellule tumorali per iniezione
    1. Far crescere le cellule OVCAR-3 in RPMI-1640 Medium, integrate con il 10% di FBS e 1x penicillina-streptomicina.
    2. Il giorno prima dell'iniezione, le cellule della sottocoltura in nuovi piatti di coltura da 100 mm con 10 mL di mezzo / piatto completo. Utilizzare il numero di cella di 0,5-1 x 106 celle/piatto.
    3. Incubare le colture a 37 °C di temperatura, 95% di umidità e 5% di CO2 per 20-24 ore.
    4. Il giorno dell'iniezione, rimuovere il mezzo di crescita dai piatti di coltura. Risciacquare accuratamente lo strato cellulare con ca2+/Mg2+ dulbecco libero dulbecco tamponato di fosfato (DPBS) per rimuovere cellule morte, detriti cellulari e tutte le tracce di siero, che possono interferire nell'azione della tripsina.
    5. Tripinare le cellule aggiungendo 1,0-1,5 mL di soluzione di Tripina-EDTA ad ogni piatto e cercare di diffondere la soluzione inclinando il piatto tutto intorno seguito da incubazione a 37 °C per 5-10 min.
      NOTA: Osservare le cellule al microscopio invertito per controllare lo stato effettivo di tripsicinazione. Sotto la tripsicinazione si traduce in un minor numero di distacco cellulare dalla superficie del piatto di coltura, la tripsininazione induce stress cellulare. Quindi, una corretta tripinazione è importante.
    6. Aggiungere 1,0-1,5 mL di mezzo di crescita completo a ogni piatto per interrompere l'azione della tripina, dopo di che sospendere le celle tubazionando delicatamente.
      NOTA: La pipettazione delicata è importante per mantenere la salute delle cellule.
    7. Raccogliere la sospensione cellulare in un tubo conico da 15 ml e girare a 250 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.
    8. Raccogliere il pellet di cella dopo aver rimosso il supernatante e lavare le cellule sospendendo il pellet in 1x DPBS.
    9. Ruotare la sospensione cellulare a bassa velocità 250 x g per 5 minuti.
    10. Aggiungere 500 μL di DPBS e sospendere di nuovo le celle mediante pipettazione delicata per ottenere sospensioni a cella singola.
    11. Contare le celle utilizzando emocitometro o contatore di celle automatizzato.
      NOTA: Per una migliore precisione, ripetere il conteggio per tre volte e prendere una media.
    12. Regolare il volume in modo tale che la densità finale delle celle sia di 1 x 108 celle/mL.
  2. Iniezione sottocutanea di cellule per sviluppare xenografti di topo
    NOTA: Tutte le procedure devono essere fatte in un armadio di sicurezza BSL2. Athymic Nude Foxn1nu/Foxn1+ topi sono stati utilizzati nello studio attuale.
    1. Prendere 50 μL della sospensione cellulare in un tubo da 1,5 ml e mescolare con 50 μL di mezzo a matrice di membrana basale.
      NOTA: Il mezzo a matrice di membrana basale tende a formare uno stato simile a un gel a temperatura ambiente, quindi mantieni attentamente le cellule e la miscela media della matrice sul ghiaccio. Si consiglia di tenere tubi, punte e siringhe in frigo e quindi trasferire sul ghiaccio prima dell'iniezione animale.
    2. Agitare la miscela per evitare qualsiasi raggruppamento cellulare. Quindi, prendere questi 100 μL della miscela media a matrice di sospensione cellulare che contiene 5 x 106 cellule, in una siringa da 1 cc.
    3. Sollevare delicatamente la pelle dell'animale per separare la pelle dallo strato muscolare sottostante e iniettare lentamente la sospensione cellulare (100 μL) sotto la pelle (5 x 106 cellule), con un ago da 26 G. Attendere alcuni secondi prima di eserti l'ago, in modo che il mezzo della matrice del seminterrato possa formare la struttura semi-solida del gel insieme alle cellule sotto la pelle, impedendo alla miscela di uscire dal sito di iniezione.
      NOTA: Le cellule devono essere testate prima dell'iniezione per qualsiasi contaminazione che possa danneggiare topi immunodifesa. Durante l'iniezione non mettere l'ago troppo in profondità nella pelle in quanto ciò potrebbe formare il tumore più profondo del previsto.
    4. Tenere l'animale in una gabbia sterile e osservare per circa 20 minuti.
    5. Osservare i topi per 2-3 settimane e consentire al tumore di crescere fino a 500 mm3 dimensioni.

4. Localizzazione degli anticorpi utilizzando un sistema di imaging in vivo

NOTA: Le apparecchiature di imaging in vivo (vedi Tabella dei materiali)utilizzate in questo esperimento utilizzano una serie di filtri ad alta efficienza e algoritmi spettrali di non miscelazione per la visualizzazione non invasiva e il monitoraggio dell'attività cellulare e genetica all'interno di un organismo vivente in tempo reale. Il sistema fornisce sia capacità di monitoraggio della fluorescenza che della bioluminescenza.

  1. Iniettare 25 μg di anticorpo etichettato colorante attraverso la vena della coda.
    1. Anestetizzare i topi che portano il tumore usando il 2% di isoflurane. Verificare la mancanza di risposta ai riflessi del pedale.
    2. Una volta che i topi smettono di muoversi, dilatare la vena laterale della coda applicando acqua di verme.
    3. Iniettare 25 μg (in 100 μL) di anticorpo etichettato utilizzando una siringa per insulina da 1 cc con un ago da 26 G.
    4. Allo stesso modo, come controllo negativo, etichettare e iniettare l'anticorpo isotipo IgG1 non specifico che non si rivolge alle cellule tumorali.
  2. Eseguire immagini dal vivo in vivo dopo 8, 24, 48 ore, ecc. di iniezioni di anticorpi.
    1. Nel software associato fare clic su Inizializza nel pannello di controllo e verificare che la temperatura dello stadio sia di 37 °C.
    2. Accendere l'alimentazione dell'ossigeno, tutte le pompe del sistema di anestesia, l'alimentazione di gas isoflurane alla camera anestetica e impostare la valvola del vaporizzatore di isoflurane al 2%.
    3. Trasferire i topi nella camera anestetica e attendere che i topi siano completamente anestetizzati. Applicare l'unguento lubrificante per gli occhi per evitare l'asciugatura degli occhi.
    4. Passare al pannello di controllo, impostare l'imaging a fluorescenza tramite l'opzione Creazione guidata imaging e selezionare l'eccitazione a 773 nm e l'emissione a 792 nm.
      NOTA: le impostazioni di esposizione automatica predefinite forniscono una buona immagine fluorescente. Tuttavia, le preferenze di esposizione automatica possono essere modificate in base alle esigenze.
    5. Trasferire i topi anestetizzati nella camera di imaging e assemblarli sul campo di imaging usando il cono del naso. La fase di imaging offre la possibilità di ospitare 5 topi alla volta.
      NOTA: avere topi di controllo con immagini insieme ai topi di prova per avere una quantità simile di esposizione e altre impostazioni durante l'analisi.
    6. Una volta che tutto è pronto, selezionare l'opzione Acquisisci sul pannello di controllo per l'acquisizione dell'immagine.
    7. Con le impostazioni di esposizione automatica il sistema genera l'immagine entro un minuto. L'immagine generata è la sovrapposizione di fluorescenza su immagine fotografica con intensità di fluorescenza ottica visualizzata in unità di conteggi o fotoni, o in termini di efficienza.
    8. Dopo aver acquisito l'immagine, trasferire i topi dalla camera di imaging alla loro gabbia e osservare per il loro recupero per 1-2 minuti.
  3. Ottimizzare ulteriormente l'immagine con gli strumenti e le funzioni forniti all'interno del software per l'analisi delle immagini. Gli strumenti di analisi delle immagini si trovano nella barra dei menu e nella tavolozza degli strumenti.
    1. In Regolazione immagine regolarela luminosità, il contrasto o l'opacità e selezionare la scala dei colori.
    2. Utilizzare gli strumenti roi per specificare una regione di interesse (ROI) in un'immagine ottica e misurare l'intensità del segnale all'interno del ROI. Se necessario, esportare i dati del segnale quantificati in un software di foglio di calcolo e tracciare i dati.
    3. Per gli studi di follow-up, analizzare le necrosi dei topi di vari tessuti (ad esempio fegato, polmone, cuore, rene, milza, cervello, ecc.) fianco a fianco per una distribuzione dettagliata non specifica di anticorpi etichettati fluorescentmente.
      NOTA: I dati possono essere ulteriormente supportati con ELISA specifica del tessuto utilizzando antigene (FOLR1 in questo caso) in 96 saggi.

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Representative Results

Nella metodologia descritta, prima abbiamo clonato anticorpi mirati al recettore del folato alfa-1 (FOLR1) chiamato farletuzumab, e un anticorpo bispecifico chiamato BaCa costituito da farletuzumab e lexatumumab insieme a anticorpi di controllo come abagovomab (sequenze fornite nel file complementare 1). I dettagli dei domini rappresentativi della variabile pesante (VH) e della luce variabile (VL) nei cloni di DNA (pVH, pVL) sono mostrati nella figura 1A. Per confermare i cloni positivi, abbiamo effettuato la PCR colonia utilizzando peptide di segnale in avanti (SP For) e primer CK Rev / CH3 Rev (sequenze fornite nel file supplementare 1). I risultati rappresentativi della PCR colonia confermano le dimensioni previste delle catene leggere e pesanti (Figura 1C). Anche i cloni di anticorpi positivi sono stati confermati utilizzando il sequenziamento di Sanger. A seguito della confermata clonazione del DNA pVH e pVL, le trasfette sono state effettuate utilizzando colture di sospensione CHO, seguite da purificazioni dell'affinità delle colonne proteina-A degli anticorpi a 4 °C (vedi figura 1B e protocollo per le fasi di dettaglio).

I risultati rappresentativi del farletuzumab purificato insieme ad altri controlli IgG1 (ad eccezione degli anticorpi BaCa eseguiti su SDS PAGE non riducenti e riducenti sono mostrati nella figura 2A. Come evidente, la catena pesante e leggera produceva bande da 50 e 25 KDa dopo la riduzione. Questo è stato seguito da una conferma vincolante degli anticorpi contro le proteine native sulla superficie cellulare. Il legame rappresentativo di farletuzumab con folr1 umano sulla superficie delle cellule OVCAR3 è mostrato utilizzando la citometria del flusso (Figura 2B).

Successivamente gli anticorpi etichettati fluorescentmente sono stati iniettati nella vena della coda in animali innestati con FOLR1 che esprimeva tumori (Figura 3). Gli animali sono stati immagini dal vivo in più punti di tempo usando IVIS. I dati confermano l'arricchimento selettivo degli anticorpi FOLR1 e BaCa nei tumori FOLR1+ (Figura 4 e Figura 5). È importante sottolineare che gli anticorpi di controllo (negativi per l'antigene tumorale) non si sono localizzare nei tumori.

Figure 1
Figura 1: Schema della clonazione, dell'espressione e della purificazione degli anticorpi.
(A) Mostra lo schema dettagliato dei vettori a catena pesanti (pVH) e leggeri (pVL). (B) il vettore pVH che trasporta una sequenza di dominio variabile di una catena pesante IgG1 e un vettore pVL che trasporta una sequenza di dominio variabile di una catena di luce sono stati mescolati insieme (rapporto 1:2) insieme ai reagenti di trasfezione (come mirus o PEI) prima di aggiungere alla coltura di sospensione delle celle CHO o HEK. Le cellule sono state alimentate con mangime supplementare il giorno successivo e le colture sono state monitorate per altri 10 giorni con alimentazione intermittente. Al giorno 11, le cellule venivano raccolte attraverso filtri PES da 0,2 μm seguiti da cromatografia di affinità usando proteina-A. Gli anticorpi purificati sono stati successivamente analizzati per % monomero (FPLC), attività di legame (ELISA o SPR) e legame con l'antigene bersaglio (FACS) sulle cellule vive. Gli anticorpi possono anche essere controllati per saggi in vivo (ad esempio, inibizione della crescita cellulare, test di vitalità cellulare o inibizione della fosforilazione intermedia di segnalazione, ecc.). Gli anticorpi possono anche essere coniugati con coloranti far-red ad esempio IRDye 800CW per l'imaging in vivo. ± IRDye 800CW deve essere testato per attività precedenti agli studi di distribuzione di tumori e tessuti. (C) Gel di agarosio della PCR colonia che confermano le dimensioni dei cloni pesanti positivi (1,4 Kb) e a catena leggera (0,8 Kb). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Un saggio di riduzione a base di gel per confermare l'integrità degli anticorpi.
(A) Quattro diversi anticorpi IgG1 (schema mostrato in alto) sono stati aggiunti ± agente riducente (come BME o DTT) a 95°C per 10 minuti. Gli anticorpi sono stati successivamente caricati su un gel SDS-PAGE al 10% seguito dalla colorazione e dall'imaging delle proteine. L'immagine gel a sinistra e a destra mostra chiaramente l'anticorpo intatto e due polipeptidi separati (~ 50 KDa e ~ 25 KDa) rispettivamente. Vedere anche mappe vettoriali pVH e pVL (Figura 1) che trasportano cDNA corrispondente ai domini VH/VL, CH1/CK, CH2 e CH3. (B) Conferma citometrica del flusso di farletuzumab senza etichetta e IRDye 800CW con etichetta farletuzumab che si lega al FOLR1 nativo sulle cellule tumorali ovariane. Non riducente = Anticorpo eseguito su gel con colorante non riducente, Reducing = Anticorpo eseguito su gel con colorante riducente, HC = Catena pesante, LC = Catena leggera, VL = Dominio variabile della catena leggera, VH = Dominio variabile della catena pesante, CK = Catena Kappa Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Schema sperimentale della generazione tumorale e dei trattamenti anticorpali.
Ceppi di topi di 6-8 settimane come: Immunodeficiente nudo atimico / NSG / Immunocompetente C57BL / 6 o Topi Balb / C potrebbero essere facilmente innestati con cellule tumorali tramite tumori sottocutanei (SQ). Studi simili potrebbero essere effettuati utilizzando tumori del grasso mammario e intraperitoneale (IP). 3-4 settimane dopo (tumore ~ 200 mm3), ai topi è stato iniettato un IRDye etichettato anticorpi indicati che erano ± selettivi contro il recettore sovraespresso dal tumore. Questo è stato seguito da immagini in vivo in vivo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Imaging vivo in vivo di topi umani contenenti tumore OVCAR3.
Selezionati casualmente da 6 a 8 settimane (Età) e 20-25 grammi (Peso) atimico senza peli Nude Foxn1nu/ Foxn1+ (Envigo) sono stati innestati con FOLR1+ tumori ovarico (cellule OVCAR-3). Dopo 3 settimane con evidenti tumori, i topi sono stati iniettati alla vena della coda con IRDye 800CW etichettato controllo IgG1, abagovomab (anticorpo anti-idiota CA-125), farletuzumab (anticorpo anti-FOLR1) e BaCa (anticorpo anti-FOLR1-DR5) seguito da imaging vivo nei momenti indicati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Imaging vivo in vivo di FOLR1 umano che esprime topi tumorali derivati da cellule MC38 murine.
(A) Selezionato casualmente da 6 a 8 settimane (età) e 20-25 g di NOD. Cg Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ o topi nudi sono stati iniettati sq con cellule MURINE MC38 che esprimono stabilmente folr1 umano. Dopo l'aspetto tumorale, i topi sono stati iniettati con irdye 800CW etichettato controllo IgG1, abagovomab (anticorpo anti-idiotipico CA-125), farletuzumab (anticorpo anti-FOLR1) e BaCa (anticorpo anti-FOLR1-DR5) seguito da imaging dal vivo in orari indicati. (B) Dopo 7 giorni gli animali sono stati eutanasiati e gli organi chiave isolati (come indicato) sono stati coniati insieme a tumori innestati per la distribuzione del segnale anticorpale relativo (IRDye 800CW). Come previsto, i tumori sono rimasti negativi con il segnale IRDye 800CW nel controllo IgG1 e l'anticorpo anti-idiota CA-125, gli animali iniettati abagovomab. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

File supplementare 1: Sequenze di tutti gli anticorpi e primer. Clicca qui per scaricare questo file.

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Discussion

L'erogazione selettiva e specifica del tessuto tumorale dell'agente terapeutico anti-cancro è la chiave per misurare l'efficacia e la sicurezza di una data terapiamirata 13. Qui abbiamo descritto un approccio rapido ed efficiente per indagare la distribuzione dettagliata dei tessuti e del tumore di anticorpi BaCa clinici, farletuzumab e non clinici. L'approccio descritto è applicabile a qualsiasi anticorpo appena generato e può essere utilizzato insieme a un anticorpo clinicamente efficace (con le qualità desiderate) per le sue proprietà di distribuzione tumorale / organo. Considerando che la maggior parte dei recettori bersaglio degli anticorpi (come HER2 nel cancro al seno) sono altamente sovraespressi nelle cellule tumorali (tessuti), nella maggior parte dei casi la loro espressione e funzione non ottimale è critica anche nei tipi cellulari diversi dalle celluletumorali 14. Ad esempio, una percentuale significativa di EGFR destinata agli anticorpi clinici nei pazienti con cancro del colon si accumula e causa tossicità al tessutocutaneo 15, un tessuto non canceroso la cui crescita e differenziazione richiedono la segnalazione e la funzione EGFR. Pertanto, crediamo fermamente che questo tipo di indagini preliminari sulla distribuzione dei tessuti in combinazione con epatototossicità e test istochimica tissutale in una coorte più ampia di animali siano fondamentali per valutare in modo completo la sicurezza e la vitalità terapeutica dell'anticorpo appena generato. Inoltre, studi di distribuzione tissutale descritti sarebbero altamente applicabili anche negli studi di xenograft dei topi immuno-competenti, se l'anticorpo appena generato manterrà la reattività incrociata all'antigene/recettore della controparte murina. Negli studi sigeneici sugli animali, insieme alla distribuzione del tumore e agli studi istochimica tissutale, l'analisi dettagliata della citochina nel sangue può essere utilizzata per rafforzare i dati di efficacia e sicurezza. Una caratteristica interessante dell'approccio descritto è che consente una quantificazione quasi accurata della distribuzione degli anticorpi se i dati sono ulteriormente supportati con ELISA (contro l'antigene bersaglio) dal tumore e altri lisati tissutali significativi (come fegato, cuore, polmone, milza, rene ecc.)7. Un'altra caratteristica importante del metodo descritto sulla tomografia computerizzata a emissione di fotoni singoli (chiamata SPECT) e sulla tomografia ad emissione di posizione (PET) è il rapportocosto/efficacia 16. Sia SPECT che PET sono molto costosi e fanno uso di traccianti radioattivi per l'imaging, rendendo l'intero processo ingombrante se si testa una grande coorte di animali17. Inoltre, le strutture di imaging SPECT e PET non sono molto standard nei laboratori e nei vivai per studiare piccoli modelli animali di malattie come i topi18.

Una limitazione con il metodo descritto per ottenere una quantificazione quasi accurata della distribuzione del tumore degli anticorpi è la dipendenza dal legame dell'antigene bersaglio ad alta affinità. È perché le interazioni antigene-anticorpo ad alta affinità possono comportare "disposizione del farmaco mediata dal bersaglio (TMDD)" da una maggiore endocitosi e chiusura ai lisosomi19. Pertanto, i risultati dell'approccio descritto varieranno a seconda del particolare recettore bersaglio in un particolare tipo di tumore. Pertanto, si consiglia vivamente di testare anticorpi/anticorpi etichettati in una grande coorte di animali con xenoinnesti tumorali generati con più di una linea o più linee cellulari tumorali con espressione variabile (eterogenea) del recettore dell'antigene bersaglio. Si raccomanda inoltre vivamente di utilizzare più di uno o più coloranti coniugati fluorescenti e ceppo di topi per gli studi proposti.

Considerando che anticorpi di piccole dimensioni come Fabs, scFvs, BiTes, DART, ecc. (privi di riciclaggio del recupero da parte del recettore neonatale Fc (FcRn) cancellano più rapidamente dai tumori (con il siero che mezze volte è da minuti a ore), si dovrebbe fare attenzione a confrontare i dati tra diversi tipi di tumore con espressione FcRn altamente variabile. Inoltre, le molecole più grandi (come gli anticorpi a doppia e trispecificità) che sono progettate con il dominio Fc per il riciclaggio del recupero hanno problemi di penetrazione dei tessuti / tumori. In questi scenari, l'approccio descritto non sarà adatto a confrontare la distribuzione tissutale / tumorale di anticorpi che differiscono significativamente nelle dimensioni6. In termini di significato, tuttavia, il tumore descritto e gli studi dettagliati sulla distribuzione dei tessuti insieme ai loro anticorpi monospecifici equivalenti fungerebbero da fattore chiave in un efficace design della piattaforma anticorpale duale e trispecifica. Infine, poiché una maggiore affinità e anticorpi ottimizzati per l'avidità hanno generalmente una distribuzione significativamente omogenea nei tumori, la selezione dell'epitopo tumorale bersaglio (priva di TMDD), l'affinità anticorpale complessiva e l'attività biologica in un particolare modello di cancro dovrebbero sempre essere considerate prima di concludere la penetrazione, la sicurezza e l'efficacia del tumore.

In sintesi, abbiamo descritto un metodo rapido e semplice per monitorare la distribuzione tumorale e tissutale degli anticorpi iniettati per via endovenosa. L'approccio descritto ha aggiunto il potenziale per analizzare i coniugati anticorpo-siRNA (dove il siRNA è etichettato), i coniugati anticorpo-farmaco (dove il farmaco è etichettato) e le anticorpi-nanoparticelle (dove i lipidi delle nanoparticelle sono etichettati con colorante fluorescente). Allo stesso modo, un residuo di cisteina progettato in modo univoco in un tumore mirato scFv (se etichettato fluorescentmente con chimica melamide) di cellule T del recettore dell'antigene chimerico (CAR-T) e CAR-NK sarà un approccio economico per analizzare la distribuzione tumorale / tissutale di queste terapie basate su cellule indipendentemente dalle strategie di segnali GFP / RFP basate sulla trasfezione virale.

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Disclosures

Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti.

Acknowledgments

Siamo grati all'University of Virginia Cancer Center Core Imaging Facility, alla Biomolecular Analysis Facility, all'Advanced Microscopy Facility e al Core Vivarium Facility for Assistance. J. T-S è uno dei primi investigatori in carriera della Ovarian Cancer Academy (OCA-DoD). Questo lavoro è stato supportato dalla sovvenzione NCI/NIH (R01CA233752) a J. T-S, U.S. DoD Breast Cancer Research Program (BCRP) premio rivoluzionario di livello 1 a J. T-S (BC17097) e U.S. DoD Ovarian Cancer Research Program (OCRP) premio di finanziamento (OC180412) a J. T-S

Materials

Name Company Catalog Number Comments
FreeStyle CHO media Gibco Life Technologies Cat # 12651-014
Anti-Anti (100X) Gibco Life Technologies Cat # 15240-062
Anti-Clumping Agent Gibco Life Technologies Cat # 01-0057DG
BD Insulin Syringe BD BioSciences Cat #329420
Caliper IVIS Spectrum PerkinElmer Cat #124262
CHO CD EfficientFeed B Gibco Life Technologies Cat #A10240-01
Corning 500 mL DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) Corning Cat # 10-13-CV
Corning 500 mL RPMI 1640 Corning Cat # 10-040-CV
Cy5 conjugated Anti-Human IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch Cat # 709-175-149
GlutaMax-I (100X) Gibco Life Technologies Cat # 35050-061
HiPure Plasmid Maxiprep kit Invitrogen Cat # K21007
HiTrap MabSelect SuRe Column GE Healthcare Cat # 11-0034-93
Infusion Takara BioScience STO344
IRDye 800CW NHS Ester LI-COR Cat # 929-70020
Isoflurane, USP Covetrus Cat # 11695-6777-2
Lubricant Eye Ointment Refresh Lacri-Lube Cat #4089
Matrigel Corning Cat # 354234
PEI transfection reagent Thermo Fisher Cat # BMS1003A
Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes Thermo Scientific Cat # 66333
Steritop Vacuum Filters Millipore Express Cat #S2GPT02RE
Trypsin-EDTA Gibco Life Technologies Cat # 15400-054
Experimental Models: Cell lines
Human: OVCAR-3 American Type Culture Collection ATCC HTB-161
Human: CHO-K cells Stable transformed in our lab ATCC CCL-61
Mouse: 4T1 Kind gift from Dr. Chip Landen, UVA
Mouse: MC38 Kind gift from Dr. Suzanne Ostrand-Rosenberg, UMBC Authenticated by STR profiling
Mouse: MC38 hFOLR1 Generated in our laboratory (This paper)
Experimental Models: Animal
Mice: athymic Nude Foxn1nu/Foxn1+ Envigo Multiple Orders
Mice: NOD.Cg Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ Jackson Laboratory Multiple Orders

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References

  1. Takahashi, K. Muromonab CD3 (Orthoclone OKT3). Journal of Toxicological Sciences. 20, 483-484 (1995).
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Ricerca sul cancro Numero 159 anticorpo farletuzumab anticorpi clinici xenograft di topo colorante a infrarossi imaging a fluorescenza arricchimento tumorale
Analisi della distribuzione tumorale e tissutale dell'anticorpo terapeutico specifico dell'antigene bersaglio
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Shivange, G., Mondal, T., Lyerly, E., Gatesman, J., Tushir-Singh, J. Analyzing Tumor and Tissue Distribution of Target Antigen Specific Therapeutic Antibody. J. Vis. Exp. (159), e60727, doi:10.3791/60727 (2020).

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