Burada fare tümörü ksenogreft modellerinde antikorların in vivo lokalizasyonunu incelemek için bir protokol sayılmaktadır.
Monoklonal antikorlar kanser hücrelerini ortadan kaldırmak için değişken bağımsız mekanizmalar tarafından çalışan yüksek afiniteli çok fonksiyonlu ilaçlardır. Son birkaç on yıl içinde, antikor-ilaç konjugeler alanı, bispesifik antikorlar, şimerik antijen reseptörleri (CAR) ve kanser immünoterapi temel ve terapötik araştırmaların en umut verici alan olarak ortaya çıkmıştır. Bir atılım hızında lösemi ve melanom bağışıklık kontrol noktası reseptörleri ve CAR-T hücreleri hedefleyen çok sayıda başarılı insan çalışmaları ile, antikor mühendisliği varyasyonları türetilen onkolojik terapötikler için son derece heyecan verici bir kez. Ne yazık ki, antikor ve CAR bazlı terapötik önemli ölçüde çok sayıda da tümör yatağında bağışıklık efektörü hücrelerin sınırlı durumu nedeniyle katı kanserlerin insan çalışmalarda hayal kırıklığı kanıtlamıştır. Daha da önemlisi, tümörler dışındaki dokularda terapötik antikorların nonspesifik dağılımı da klinik etkinlik eksikliğine katkıda, ilişkili toksisite ve klinik yetmezlik. Preklinik çalışmaların insan klinik izlerine sadık çevirisi farelertümörü ksenogreft etkinliği ve güvenlik çalışmalarına dayandığı için, burada tümörün ve terapötik antikorların genel doku dağılımının test edilmesi için bir yöntem vurgulanmaktadır. Bu protein-A saflaştırılmış antikor yakın Kızılötesi floresan boya ile etiketlenmesi ile elde edilir tümör taşıyan farelerin canlı görüntüleme takip.
FDA ilk monoklonal antikor hedefleyen CD3 onayladı (OKT3, Muromonab) içinde 1 ,2. O zamandan beri önümüzdeki yirmi yıl için, bağışıklık kontrol noktası inhibitörleri karşı antikorların ezici başarısı nedeniyle antikor mühendisliği alanında hızlı bir patlama olmuştur3. Bağışıklık sisteminin dolaylı aktivasyonu yanında, antikorlar doğrudan bağışıklık efektörü hücreleri meşgul etmek için kanser hücrelerinin bayrak hedeflenmektedir, ölüm reseptör agonist yoluyla sitotoksisite tetiklemek, blok tümör hücre sağkalım sinyali, obstrüktif anjiyogenez (kan damarlarının büyümesi), kısıtlama bağışıklık kontrol noktası düzenleyicileri, konjuge ajanlar olarak radyoizopes, kemoterapi ilaçları ve siRNA teslim2. Buna ek olarak, hasta türetilmiş T-hücreleri ve NK hücreleri (CAR-T ve CAR-NK) yüzeyinde çeşitli antikorların tek zincir değişken parçaları (scFv) incelenmesi hücre tabanlı tedaviler için klinik araştırmaların hızlı büyüyen bir alandır4.
Tümör hücrelerini ifade eden antijene seçicilik sağlayan antikor bazlı ilaçların aşırı yüksek yakınlığı onu çekici bir ajan haline getirir. Aynı şekilde, terapötik bir antikor hedefli doğum ve tümör tutma (veya kimyasal bir ilaç) toksisite üzerinde etkinliğini dengelemek için anahtardır. Bu nedenle, içeren ancak bispesifik5 ve üç spesifik antikorlar6 ile sınırlı değildir protein mühendisliği tabanlı stratejiler çok sayıda önemli ölçüde intravenöz (IV) enjekte terapötik tümör retansiyonu optimize tümör retansiyonu geliştirmek için yararlanılmaktadır5,7. Burada, potansiyel olarak etkili anti-kanser antikorlarının tümör ve doku dağılımını ele almak için basit bir floresan tabanlı yöntemi tanımlıyoruz.
Hayvan dokuları görünür spektrumda heyecanlandığında otomatik floresana sahip olduğundan, antikorlar başlangıçta kızılötesi boyanın yakınında (örneğin, IRDye 800CW) etiketlenmiştir. Kavram araştırmaları için folat reseptör alfa-1 (FOLR1) farletuzumab denilen antikor ve onun türevi olarak adlandırılan Bispesifik çapa Sitotoksisite aktivatör (BaCa)7 antikor bu co-targets FOLR1 ve ölüm reseptör-5 (DR5)8 bir rekombinant antikor kullandık. FOLR1 yumurtalık ve TNBC kanser hücrelerinde, tümör ksenogreftlerinde ve hasta tümörlerinde iyi tanımlanmış aşırı ekspres hedef reseptördür9. Özellikle, klinik yumurtalık ve meme kanserleri için bağışıklık efektörü hücreleri ve antikor ilaç konjugeler (ADC) meşgul antikor tabanlı yaklaşımlar kullanarak FOLR1 yararlanmak için birden fazla çaba vardır10,11.
Bu yöntem de, biz klonlanmış, ifade ve klinik anti-FOLR1 (farletuzumab) cho ifade sistemi kullanarak diğer kontrol antikorları ile birlikte saflaştırılmış. IgG1 isotipi ve abagovomab12 adı verilen klinik anti-idiyotip-16 antikor negatif kontrol olarak kullanıldı. Protein-A arınmasını takiben, endike antikorlar IRDye 800CW ile etiketlendi ve yumurtalık tümörü ksenogreftleri taşıyan veya stably transfected insan FOLR1 gösteren çıplak farelerin kuyruk damarına uygulandı. Antikor lokalizasyonu canlı görüntüleme ile birden fazla farklı zaman noktalarında in vivo görüntüleme spektrumu kullanılarak izlendi7. Bu yöntem ışık emisyonsağlamak için herhangi bir genetik modifikasyon veya substrat enjeksiyon gerektirmez ve önemli ölçüde daha hızlı, maliyet etkin ve verimlidir. Aşağıda açıklanan genel klonlama, ifade, saflaştırma ve etiketleme protokolü, ağır ve hafif zincir dizileri mevcutsa herhangi bir klinik ve klinik olmayan antikora uygulanabilir.
Anti-kanser terapötik ajan selektif ve tümör dokusu özel teslimat belirli bir hedefli tedavinin etkinliğini ve güvenliğini ölçmek içinanahtardır 13. Burada klinik, farletuzumab ve klinik olmayan BaCa antikorlarının ayrıntılı doku ve tümör dağılımını araştırmak için hızlı ve etkili bir yaklaşım tanımladık. Açıklanan yaklaşım yeni üretilen herhangi bir antikor için geçerlidir ve tümör / organ dağılımı özellikleri için klinik olarak etkili bir antikor (i…
The authors have nothing to disclose.
Biz Virginia Üniversitesi Kanser Merkezi Çekirdek Görüntüleme Tesisi, Biyomoleküler Analiz Tesisi, Gelişmiş Mikroskopi Tesisi ve Yardım için Core Vivarium Tesisi müteşekkiriz. J. T-S Yumurtalık Kanseri Akademisi (OCA-DoD) erken kariyer araştırmacısı. Bu çalışma NCI/NIH hibe (R01CA233752) j. T-S, ABD DoD Meme Kanseri Araştırma Programı (BCRP) atılım seviye-1 ödülü J. T-S (BC17097) ve U.S. DoD Yumurtalık Kanseri Araştırma Programı (OCRP) finansman ödülü (OC180412) J. T-S destek
FreeStyle CHO media | Gibco Life Technologies | Cat # 12651-014 | |
Anti-Anti (100X) | Gibco Life Technologies | Cat # 15240-062 | |
Anti-Clumping Agent | Gibco Life Technologies | Cat # 01-0057DG | |
BD Insulin Syringe | BD BioSciences | Cat #329420 | |
Caliper IVIS Spectrum | PerkinElmer | Cat #124262 | |
CHO CD EfficientFeed B | Gibco Life Technologies | Cat #A10240-01 | |
Corning 500 mL DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) | Corning | Cat # 10-13-CV | |
Corning 500 mL RPMI 1640 | Corning | Cat # 10-040-CV | |
Cy5 conjugated Anti-Human IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | Cat # 709-175-149 | |
GlutaMax-I (100X) | Gibco Life Technologies | Cat # 35050-061 | |
HiPure Plasmid Maxiprep kit | Invitrogen | Cat # K21007 | |
HiTrap MabSelect SuRe Column | GE Healthcare | Cat # 11-0034-93 | |
Infusion | Takara BioScience | STO344 | |
IRDye 800CW NHS Ester | LI-COR | Cat # 929-70020 | |
Isoflurane, USP | Covetrus | Cat # 11695-6777-2 | |
Lubricant Eye Ointment | Refresh Lacri-Lube | Cat #4089 | |
Matrigel | Corning | Cat # 354234 | |
PEI transfection reagent | Thermo Fisher | Cat # BMS1003A | |
Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes | Thermo Scientific | Cat # 66333 | |
Steritop Vacuum Filters | Millipore Express | Cat #S2GPT02RE | |
Trypsin-EDTA | Gibco Life Technologies | Cat # 15400-054 | |
Experimental Models: Cell lines | |||
Human: OVCAR-3 | American Type Culture Collection | ATCC HTB-161 | |
Human: CHO-K cells | Stable transformed in our lab | ATCC CCL-61 | |
Mouse: 4T1 | Kind gift from Dr. Chip Landen, UVA | ||
Mouse: MC38 | Kind gift from Dr. Suzanne Ostrand-Rosenberg, UMBC | Authenticated by STR profiling | |
Mouse: MC38 hFOLR1 | Generated in our laboratory (This paper) | ||
Experimental Models: Animal | |||
Mice: athymic Nude Foxn1nu/Foxn1+ | Envigo | Multiple Orders | |
Mice: NOD.Cg Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ | Jackson Laboratory | Multiple Orders |