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Cancer Research

Analyse de la distribution des tumeurs et des tissus de l’anticorps thérapeutique spécifique à l’antigène cible

doi: 10.3791/60727 Published: May 16, 2020
* These authors contributed equally

Summary

Ici nous présentons un protocole pour étudier la localisation in vivo des anticorps dans les modèles de xénogreffe de tumeur de souris.

Abstract

Les anticorps monoclonaux sont des médicaments multifonctionnels à haute affinité qui fonctionnent par des mécanismes indépendants variables pour éliminer les cellules cancéreuses. Au cours des dernières décennies, le domaine des anticorps conjugués, des anticorps bispécifiques, des récepteurs d’antigène chimérique (RCA) et de l’immunothérapie contre le cancer est devenu le domaine le plus prometteur des investigations fondamentales et thérapeutiques. Avec de nombreux essais humains réussis ciblant les récepteurs des points de contrôle immunitaires et les cellules CAR-T dans la leucémie et le mélanome à un rythme révolutionnaire, c’est une période très excitante pour les thérapeutiques oncologiques dérivées de variations de l’ingénierie des anticorps. Malheureusement, un nombre significativement élevé d’anticorps et de thérapies basées sur la RCA se sont également avérés décevants dans les essais humains des cancers solides en raison de la disponibilité limitée des cellules immunisées d’effecteur dans le lit de tumeur. Fait important, la distribution non spécifique d’anticorps thérapeutiques dans des tissus autres que les tumeurs contribue également au manque d’efficacité clinique, à la toxicité associée et à l’échec clinique. Comme la traduction fidèle des études précliniques dans les traînées cliniques humaines sont fortement comptées sur des souris tumeur xénogreffe efficacité et études d’innocuité, ici nous soulignons une méthode pour tester la tumeur et la distribution générale de tissu des anticorps thérapeutiques. Ceci est réalisé en étiquetant l’anticorps purifié de protéine-A avec le colorant fluorescent proche infrarouge suivi de l’imagerie vivante des souris porteuses de tumeur.

Introduction

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Fda a approuvé le premier anticorps monoclonal ciblant CD3 (OKT3, Muromonab) en 19861,2. Depuis lors, pendant les vingt prochaines années, il ya eu une explosion rapide dans le domaine de l’ingénierie des anticorps en raison du succès écrasant des anticorps contre les inhibiteurs du point decontrôle immunitaire 3. Outre l’activation indirecte du système immunitaire, les anticorps visent à signaler directement les cellules cancéreuses pour engager avec précision les cellules effectrices immunitaires, déclencher la cytotoxicité par l’intermédiaire de l’agoniste des récepteurs de la mort, bloquer la signalisation de survie des cellules tumorales, obstruer l’angiogenèse (croissance des vaisseaux sanguins), contraindre les régulateurs de contrôle immunitaires, délivrer des radioisotopes, des agents chimiothérapeutiques et de l’ARN comme agents conjugués2. En outre, l’étude des fragments variables à chaîne unique (scFv) de divers anticorps à la surface des cellules T dérivées du patient et des cellules NK (CAR-T et CAR-NK) est un domaine en croissance rapide des investigations cliniques pour les thérapies cellulaires4.

L’affinité ultra-élevée des médicaments à base d’anticorps qui fournit la sélectivité à l’antigène exprimant les cellules tumorales en fait un agent attrayant. De même, l’accouchement ciblé et la rétention tumorale d’un anticorps thérapeutique (ou d’un médicament chimique) est la clé pour équilibrer l’efficacité sur la toxicité. Par conséquent, un grand nombre de stratégies basées sur l’ingénierie protéique qui incluent mais ne sont pas limitées aux anticorps bispécifiques5 et tri-spécifiques6 sont exploitées pour augmenter sensiblement la conservation optimisée de tumeur d’avidité des thérapeutiques injectées par voie intraveineuse (IV)5,7. Ici, nous décrivons une méthode basée sur la fluorescence simple pour adresser la distribution de tumeur et de tissu des anticorps anticancéreux potentiellement efficaces.

Puisque les tissus animaux possèdent l’auto-fluorescence une fois excités dans le spectre visible, les anticorps ont été au commencement étiquetés avec le colorant infrarouge proche (par exemple, IRDye 800CW). Pour des preuves d’études de concept, nous avons utilisé le récepteur folique alpha-1 (FOLR1) ciblant l’anticorps appelé farletuzumab et son dérivé appelé activateur d’ancrage bispécifique Cytotoxicity (BaCa)7 qui co-cible FOLR1 et récepteur de la mort-5 (DR5)8 dans un anticorps recombinant. FOLR1 est un récepteur cible surexprimé bien défini dans les cellules cancéreuses ovariennes et TNBC, les xénogreffes tumorales et les tumeurs patientes9. Il y a notamment de multiples efforts pour exploiter cliniquement FOLR1 à l’aide d’approches à base d’anticorps pour engager les cellules effectrices immunitaires et les conjugués anticorps (ADC) pour les cancersde l’ovaire et du sein 10,11.

Dans cet article de méthodes, nous avons cloné, exprimé et purifié anti-FOLR1 clinique (farletuzumab) avec d’autres anticorps de contrôle utilisant le système d’expression de CHO. L’isotype IgG1 et un anticorps clinique anti-idiotype mucin-16 appelé abagovomab12 ont été utilisés comme témoins négatifs. Après purification de protéine-A, les anticorps indiqués ont été étiquetés avec IRDye 800CW et ont été administrés dans la veine de queue des souris nues portant des xénogreffes de tumeur ovarienne ou folr1 humain habilement transfected exprimant des xénogreffes de cancer du côlon murine. La localisation des anticorps a été suivie par imagerie en direct à l’aide du spectre d’imagerie in vivo à plusieurs momentsdifférents 7. Cette méthode ne nécessite aucune modification génétique ou injection du substrat pour permettre l’émission de lumière et est beaucoup plus rapide, rentable et efficace. Le protocole général de clonage, d’expression, de purification et d’étiquetage décrit ci-dessous peut être appliqué à n’importe quel anticorps clinique et nonclinique si des séquences de chaîne lourde et légère sont disponibles.

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Protocol

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Toutes les procédures concernant la manipulation des animaux et les études sur les xénogreffes tumorales ont été examinées et approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ici à l’Université de Virginie et conformes aux normes réglementaires pertinentes

1. Expression et purification des anticorps

  1. Entretien des cellules CHO
    1. Cultivez les cellules CHO dans FreeStyle CHO Media complétées par un supplément de glutamine 1x disponible dans le commerce à 37 °C secouant à 130 rpm avec 5% de CO2 à l’aide de flacons Erlenmeyer délongs en verre ou jetables.
      REMARQUE : Il est fortement recommandé d’utiliser un flacon dérouté avec bouchon ventilé pour augmenter l’agitation et pour améliorer le transfert de gaz pendant l’état de secousse. Un rendement d’anticorps significativement réduit a été obtenu avec des flacons réguliers (non déconcertés) en raison de l’agitation limitée de la culture de suspension.
    2. Maintenez le nombre de cellules entre 1-5 x 106 cellules/mL avec >95% viabilité cellulaire. Si le nombre de cellules augmente de plus de 5 x 106 cellules/mL, divisez les cellules. Ne permet jamais aux cellules CHO d’atteindre en dessous de 0,2 x10 6 cellules/mL.
  2. Transfection des cellules CHO
    1. Faire pousser les cellules CHO dans 200 mL de médias (2 x10 6 cellules/mL) dans des flacons délongés d’Erlenmeyer déconcertés.
      REMARQUE : Les cultures de suspension cultivées dans des flacons déconcertés ont toujours produit des rendements protéiques plus élevés que lorsqu’elles sont cultivées dans des flacons non déconcertés.
    2. Dans un tube de 15 mL, prendre 5 mL de supports CHO FreeStyle et ajouter 50 μg d’ADN clone VH et 75 μg d’ADN clone VL. Vortex pour bien mélanger.
    3. Incuber le mélange d’ADN à température ambiante pendant 5 min.
      REMARQUE : Une incubation plus longue réduit les rendements protéiques.
    4. Ajouter 750 μL de bouillon de polyéthylènemine de 1 mg/mL (Î.-P.-É.) à la solution d’ADN et vortexer agressivement le mélange pendant 30 s. Incuber à température ambiante pendant 5 min supplémentaires.
      REMARQUE : L’Île-du-Prince-Édouard doit être fraîche. Le cycle de dégel multiple de l’Île-du-Prince-Édouard réduit considérablement le rendement global.
    5. Ajouter tout le mélange d’ADN et d’Î.-P.-É. sur les cellules tout en secouant manuellement le flacon. Incubez immédiatement les flacons délongs d’Erlenmeyer déconcertés avec des cellules à 37 °C secouant à 130 rpm.
  3. Expression
    REMARQUE : L’anticorps a un peptide de signal sécrétaire conçu à son extrémité n-terminale, ce qui aide les anticorps à être sécrétés dans les médias.
    1. Faire pousser les cellules transfectées à 37 °C, avec des secousses à 130 rpm le jour 1.
    2. Le jour 2, ajouter 2 mL d’agent anti-agglutination 100x et 2 mL de solution antibactérienne-anticotique 100x. Déplacez le flacon à basse température (32-34 °C), avec des secousses à 130 rpm.
    3. Tous les cinq jours, ajouter 10 mL d’aliments Tryptone N1 et 2 mL de supplément de glutamine de 100 x.
    4. Continuez à compter les cellules tous les trois jours à l’aide de l’hémomètre après avoir souté un aliquot de cellules avec la tache bleue trypan. Assurez-vous que la viabilité de la cellule reste supérieure à 80 %.
    5. Le jour 10 ou 11, récolter le milieu pour la purification des anticorps. Faites tourner la culture à 3000 x g,4 °C pendant 40-60 min, puis filtrez le média clair à l’aide de filtres à bouteille de 0,22 μM.
  4. Purification
    REMARQUE : La purification des anticorps est effectuée à l’aide de la colonne Protein-A disponible dans le commerce (voir tableau des matériaux),à l’aide d’une pompe périssaliste.
    1. Equilibrer la colonne avec deux colonnes de volume de tampon liant (phosphate de sodium de 20 mM au pH 7,4).
    2. Passez les supports filtrés contenant des anticorps (obtenus à l’étape 1.3.5) à travers la colonne à la vitesse d’écoulement de 1 mL/min.
    3. Lavez la colonne avec un volume de deux colonnes de tampon de liaison.
    4. Elute l’anticorps en fractions de 500 μL à l’aide d’un tampon d’élitution de 5 mL (acétate de sodium de 30 mM au pH 3,4).
    5. Neutraliser le pH de l’anticorps éluté en ajoutant 10 μL de tampon de neutralisation (3 M d’acétate de sodium au pH 9) par fraction.
      REMARQUE : La fraction numéro 3-6 contient la majeure partie de l’anticorps. Il est conseillé de conserver toutes les fractions au cas où l’anticorps serait élucidé en une fraction plus tard que prévu.
    6. Mesurez la concentration d’anticorps purifié à l’aide d’un spectrophotomètre en sélectionnant le protocole par défaut pour IgG. La concentration finale de l’anticorps est obtenue en mg/mL en tenant compte du poids moléculaire et du coefficient d’absorption.

2. Étiquetage fluorescent

REMARQUE : Les anticorps sont étiquetés avec le colorant infrarouge qui contient un groupe réactif nhs ester, qui se couple avec les protéines et forme un conjugué stable. Cette réaction est sensible au pH et fonctionne mieux au pH 8.5. Les conjugués fluorescents étiquetés avec le colorant affichent un maximum d’absorption de 774 nm, et un maximum d’émission de 789 nm. le pH 8.5 est essentiel à une conjugaison efficace.

  1. Dialyze 0,5 mL de l’anticorps à l’aide d’une cassette de dialyse (0,1-0,5 mL) dans 1 L de tampon de conjugaison (tampon phosphate de 50 mM au pH 8,5). Après 4 h, transférer la cassette de dialyse dans un tampon frais et dialyser pendant la nuit.
  2. Configurer une réaction de conjugaison en ajoutant 0,03 mg d’IRDye 800CW par 1 mg d’anticorps dans un volume de réaction de 500 μL.
    REMARQUE : IRDye 800CW est dissous dans DMSO à une concentration de 10 mg/mL.
  3. Effectuer des réactions d’étiquetage de 2 h à 20 °C.
    REMARQUE : Augmenter le temps au-delà de 2 h n’améliore pas l’étiquetage.
  4. Purifier les conjugués étiquetés par dialyse étendue contre 1x PBS.
  5. Estimer le degré d’étiquetage en mesurant l’absorption du colorant à 780 nm et l’absorption de la protéine à 280 nm. La contribution de colorant au signal de 280 nm est de 3%.
  6. Calculez le rapport colorant/protéine à l’aide de cette formule :
    Equation 1
    où 0,03 est un facteur de correction pour l’absorption du colorant utilisé à 280 nm (égal à 3,0 % de son absorption à 780 nm), εColorant et protéine εsont des coefficients d’extinction molaire pour le colorant et la protéine (anticorps) respectivement.
    REMARQUE : εColorant est de 270 000 M-1 cm-1 et εLa protéine est de 203 000 M-1 cm-1 (pour un IgG typique) en 1:1 mélange de PBS : méthanol. Les protéines autres que l’IgG peuvent avoir des coefficients d’extinction molaire très différents. L’utilisation d’un coefficient d’extinction correct pour la protéine d’intérêt est essentielle pour déterminer avec précision le rapport D/P.
  7. Calculez la concentration finale de protéines à l’aide de cette formule :
    Equation 2
    REMARQUE : Confirmez toujours l’efficacité antigène-contraignante de l’anticorps étiqueté et non étiqueté utilisant ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) ou la cytométrie de flux avant de procéder à des études in vivo.

3. Études de xénogreffe de souris

  1. Préparation des cellules tumorales pour injection
    1. Cultiver des cellules OVCAR-3 dans RPMI-1640 Medium, complétées par 10% de FBS et 1x pénicilline-streptomycine.
    2. La veille de l’injection, les cellules de sous-culture dans de nouveaux plats de culture de 100 mm avec 10 mL de milieu complet / plat. Utilisez le numéro de cellule de 0,5-1 x 106 cellules/plat.
    3. Incuber les cultures à 37 °C de température, 95 % d’humidité et 5 % de CO2 pendant 20 à 24 h.
    4. Le jour de l’injection, retirer le milieu de croissance des plats de culture. Rincez soigneusement la couche cellulaire avec ca2+/Mg2+ saline tamponnée au phosphate (DPBS) de Dulbecco pour éliminer les cellules mortes, les débris cellulaires et toutes les traces de sérum, ce qui peut interférer dans l’action de la trypsine.
    5. Essayez de trypsiniser les cellules en ajoutant 1,0-1,5 mL de solution Trypsin-EDTA à chaque plat et essayez de répandre la solution en inclinant le plat tout autour suivi de l’incubation à 37 °C pendant 5-10 min.
      REMARQUE : Observez les cellules sous un microscope inversé pour vérifier l’état réel de la trypsinisation. Sous la trypsinization les résultats en nombre inférieur de détachement cellulaire de la surface du plat de culture, sur trypsinization induit le stress cellulaire. Donc, une bonne trypsinisation est importante.
    6. Ajouter 1,0-1,5 mL de milieu de croissance complet à chaque plat pour arrêter l’action de la trypsine, après que re-suspendre les cellules par pipetting doucement.
      REMARQUE : Le pipetage doux est important pour maintenir la santé cellulaire.
    7. Recueillir la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 mL et tourner à 250 x g pendant 5 min à température ambiante.
    8. Recueillir la pastille cellulaire après avoir enlevé le supernatant et laver les cellules en suspendant à nouveau la pastille en 1x DPBS.
    9. Faire tourner la suspension cellulaire à basse vitesse 250 x g pendant 5 min.
    10. Ajouter 500 μL de DPBS et re-suspendre les cellules par pipetting doux pour obtenir une suspension à cellule unique.
    11. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur cellulaire automatisé.
      REMARQUE : Pour une meilleure précision, répétez le comptage trois fois et prenez une moyenne.
    12. Ajustez le volume de manière à ce que la densité cellulaire finale soit de 1 x 108 cellules/mL.
  2. Injection sous-cutanée de cellules pour développer des xénogreffes de souris
    REMARQUE : Toutes les procédures doivent être effectuées dans une armoire de sécurité BSL2. Athymic Nude Foxn1nu/Foxn1+souris ont été utilisés dans l’étude actuelle.
    1. Prendre 50 μL de la suspension cellulaire dans un tube de 1,5 mL et mélanger avec 50 μL de membrane de sous-sol milieu matricielle.
      REMARQUE : Le milieu de matrice de membrane de sous-sol tend à former un gel comme l’état à la température ambiante, ainsi maintiennent soigneusement les cellules et le mélange moyen de matrice sur la glace. Il est conseillé de garder les tubes, les pointes et les seringues au réfrigérateur, puis de les transférer sur de la glace avant l’injection d’animaux.
    2. Agiter le mélange pour éviter toute agglutination cellulaire. Ensuite, prenez ce 100 μL du mélange moyen suspension-matrice cellulaire qui contient 5 x10 6 cellules, dans une seringue de 1 cc.
    3. Soulevez doucement la peau de l’animal pour séparer la peau de la couche musculaire sous-jacente et injectez lentement la suspension cellulaire (100 μL) sous la peau (5 x 106 cellules), avec une aiguille de 26 G. Attendez quelques secondes avant de sortir l’aiguille, de sorte que le milieu matricielle du sous-sol peut former le gel semi-solide comme la structure avec des cellules sous la peau, empêchant le mélange sortant du site d’injection.
      REMARQUE : Les cellules doivent être testées avant l’injection pour toute contamination qui pourrait nuire aux souris immunodéficientes. Lors de l’injection ne mettez pas l’aiguille trop profondément dans la peau car cela peut former la tumeur plus profonde que prévu.
    4. Gardez l’animal dans une cage stérile et observez pendant environ 20 minutes.
    5. Observez les souris pendant 2-3 semaines et permettez à la tumeur de grandir jusqu’à 500 mm3 taille.

4. Localisation des anticorps à l’aide d’un système d’imagerie in vivo

REMARQUE : L’équipement d’imagerie in vivo (voir tableau des matériaux)utilisé dans cette expérience utilise un ensemble de filtres à haut rendement et d’algorithmes spectraux de non-mélange pour la visualisation non invasive et le suivi de l’activité cellulaire et génétique au sein d’un organisme vivant en temps réel. Le système fournit à la fois la fluorescence et la capacité de surveillance de la bioluminescence.

  1. Injecter 25 μg d’anticorps étiquetés de colorant par veine de queue.
    1. Anesthésier la tumeur portant des souris à l’aide de 2% d’isoflurane. Vérifiez le manque de réponse aux réflexes de pédale.
    2. Une fois que les souris cessent de bouger, dilater la veine latérale de la queue en appliquant de l’eau de ver.
    3. Injecter 25 μg (en 100 μL) d’anticorps étiquetés à l’aide d’une seringue à insuline de 1 cc avec une aiguille de 26 G.
    4. De même, en tant que contrôle négatif, étiquetez et injectez l’anticorps isotype IgG1 non spécifique qui ne cible pas les cellules cancéreuses.
  2. Effectuer l’imagerie in vivo en direct après 8, 24, 48 h, etc. d’injections d’anticorps.
    1. Dans le logiciel associé, cliquez sur Initialize situé dans le panneau de commande et confirmez que la température de l’étape est de 37 °C.
    2. Allumez l’alimentation en oxygène, toutes les pompes sur le système d’anesthésie, l’approvisionnement en gaz isoflurane à la chambre anesthésique et réglez la valve vaporisateur isoflurane à 2%.
    3. Transférer les souris dans une chambre anesthésique et attendre que les souris soient complètement anesthésiées. Appliquer l’onguent lubrifiant pour les yeux pour éviter le séchage de leurs yeux.
    4. Rendez-vous sur le panneau contrôle,configurez l’imagerie par fluorescence grâce à l’option Imaging Wizard et sélectionnez l’excitation à 773 nm et l’émission à 792 nm.
      REMARQUE : Les paramètres d’exposition automatique par défaut fournissent une bonne image fluorescente. Toutefois, les préférences d’exposition automatique peuvent être modifiées en fonction des besoins.
    5. Transférez les souris anesthésiées dans la chambre d’imagerie et assemblez-les sur le champ d’imagerie à l’aide d’un cône nasal. L’étape d’imagerie offre la possibilité d’accueillir 5 souris à la fois.
      REMARQUE : Avoir des souris témoins photographiées avec les souris d’essai pour avoir une quantité similaire d’exposition et d’autres paramètres pendant l’analyse.
    6. Une fois que tout est prêt, sélectionnez l’option Acquérir sur le panneau de contrôle pour l’acquisition de l’image.
    7. Avec les paramètres Autoexposure, le système génère l’image en une minute. L’image générée est la superposition de fluorescence sur l’image photographique avec une intensité de fluorescence optique affichée en unités de dénombrements ou de photons, ou en termes d’efficacité.
    8. Après l’acquisition de l’image, transférer les souris de la chambre d’imagerie à leur cage et d’observer pour leur récupération pendant 1 à 2 min.
  3. Peaufiner davantage l’image avec les outils et les fonctions fournis dans le logiciel pour l’analyse d’images. Les outils d’analyse d’image sont dans la barre de menu et la palette d’outils.
    1. Sous Image Adjust, ajustez la luminosité, le contraste ou l’opacité et sélectionnez l’échelle de couleur.
    2. Utilisez les outils roi pour spécifier une région d’intérêt (ROI) dans une image optique et mesurer l’intensité du signal dans le roi. Si nécessaire, exportez les données de signal quantifiées vers un logiciel de feuille de calcul et tracez les données.
    3. Pour les études de suivi, analyser les autopsies de souris de divers tissus (p. ex., foie, poumon, cœur, rein, rate, cerveau, etc.) côte à côte pour une distribution détaillée non spécifique d’anticorps étiquetés fluorescents.
      REMARQUE : Les données peuvent être soutenues avec l’ELISA spécifique aux tissus en utilisant l’antigène (FOLR1 dans ce cas) dans 96 ainsi que des analyses.

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Representative Results

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Dans la méthodologie décrite, nous avons d’abord cloné des anticorps ciblant le récepteur folique alpha-1 (FOLR1) nommé farletuzumab, et un anticorps bispécifique appelé BaCa composé de farletuzumab et de lexatumumab ainsi que d’anticorps témoins tels que l’abagovomab (séquences fournies dans le fichier supplémentaire 1). Les détails des domaines représentant variable lourd (VH) et à lumière variable (VL) dans les clones d’ADN (pVH, pVL) sont indiqués dans la figure 1A. Pour confirmer les clones positifs, nous avons effectué la colonie PCR en utilisant peptide de signal vers l’avant (SP For) et CK Rev / CH3 Rev amorces (séquences fournies dans le fichier supplémentaire 1). Les résultats représentatifs du PCR de la colonie confirment la taille prévue des chaînes légères et lourdes(figure 1C). Des clones positifs d’anticorps ont également été confirmés à l’aide du séquençage Sanger. Après le clonage confirmé d’ADN de pVH et de pVL, des transfections ont été effectuées utilisant des cultures de suspension de CHO, suivies des purifications d’affinité de colonne de protéine-A des anticorps à 4 °C (voir figure 1B et protocole pour des étapes détaillées).

Les résultats représentatifs du farletuzumab purifié ainsi que d’autres IgG1 de contrôle (à l’exception de l’anticorps BaCa exécuté sur la page SDS non réducteuse et réducteuse sont indiqués dans la figure 2A. Comme il est évident, chaîne lourde et légère produit 50 et 25 bandes KDa après réduction. Ceci a été suivi par la confirmation contraignante des anticorps aux protéines indigènes sur la surface de cellules. La liaison de farletuzumab représentative à folr1 humain sur la surface des cellules OVCAR3 est montrée utilisant la cytométrie d’écoulement (figure 2B).

Les anticorps labellisés fluorescents ont ensuite été injectés dans la veine de la queue chez des animaux greffés avec folr1 exprimant des tumeurs (Figure 3). Les animaux ont été photographiés en direct à plusieurs moments à l’aide de l’IVIS. Les données confirment l’enrichissement sélectif des anticorps FOLR1 et BaCa dans les tumeurs FOLR1+ (figure 4 et figure 5). Les anticorps de contrôle important (négatifs pour l’antigène de tumeur) n’ont pas localisé dans les tumeurs.

Figure 1
Figure 1 : Schéma de clonage, d’expression et de purification d’anticorps.
(A) Montre le schéma de détail des vecteurs de chaîne lourds (pVH) et légers (pVL). (B) vecteur pVH portant la séquence de domaine variable d’une chaîne lourde IgG1 et vecteur pVL portant la séquence de domaine variable d’une chaîne légère ont été mélangés ensemble (rapport 1:2) avec des réagents de transfection (tels que mirus ou PEI) avant d’ajouter à la culture de suspension des cellules CHO ou HEK. Les cellules ont été alimentées avec l’alimentation supplémentaire le jour suivant et les cultures ont été surveillées pendant 10 jours additionnels avec l’alimentation intermittente. Au jour 11, les cellules ont été récoltées à travers des filtres PES de 0,2 μm suivis de la chromatographie par affinité à l’aide de protéines A. Les anticorps purifiés ont ensuite été analysés pour le % de monomère (FPLC), l’activité de liaison (ELISA ou SPR) et la liaison à l’antigène cible (FACS) sur les cellules vivantes. Les anticorps peuvent également être vérifiés pour détecter les analyses in vivo (p. ex., inhibition de la croissance cellulaire, analyses de viabilité cellulaire ou inhibition de la signalisation de la phosphorylation intermédiaire, etc.). Les anticorps peuvent également être conjugués à des teintures rouge lointain, par exemple IRDye 800CW pour l’imagerie in vivo. ± IRDye 800CW doivent être testés pour des activités antérieures aux études de distribution de tumeurs et de tissus. (C) Gels Agarose de la colonie PCR confirmant les tailles de positifs lourds (1,4 Kb) et la chaîne légère (0,8 Kb) clones. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Essai de réduction à base de gel pour confirmer l’intégrité des anticorps.
(A) Quatre anticorps IgG1 différents (schéma montré sur le dessus) ont été ajoutés ± agent réducteur (comme le BME ou la TNT) à 95 °C pendant 10 min. Les anticorps ont ensuite été chargés sur un gel SDS-PAGE de 10 %, suivi de la coloration et de l’imagerie protéiques. L’image de gel dans la gauche et la droite montrent clairement l’anticorps intact et deux polypeptides séparés (~50 KDa et ~25 KDa) respectivement. Veuillez également consulter les cartes vectorielles pVH et pVL (figure 1) portant de l’ADND correspondant aux domaines VH/VL, CH1/CK, CH2 et CH3. (B) Confirmation de cytométrie de flux de non étiquetés et IRDye 800CW étiqueté farletuzumab liaison à FOLR1 natif sur les cellules cancéreuses ovariennes. Non réductrice = Anticorps exécuté sur gel avec colorant non réductrice, Réduction = Anticorps exécuté sur gel avec colorant réductrice, HC = Chaîne lourde, LC = Chaîne légère, VL = Domaine variable de la chaîne de lumière, VH = Domaine variable de la chaîne lourde, CK = Chaîne Kappa Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Schéma expérimental de la génération de tumeurs et des traitements anticorps.
Les souches de souris âgées de 6 à 8 semaines telles que : Les souris immunodéficientes nues athymiques/NSG/Immunocompétent C57BL/6 ou Balb/C pourraient être facilement greffées avec des cellules tumorales par l’intermédiaire de tumeurs sous-cutanées (SQ). Des études similaires pourraient être menées à l’aide de tumeurs de graisse mammaire et intraperitoneal (IP). 3-4 semaines plus tard (tumeur ~200 mm3),des souris ont été IV injectées avec un IRDye étiqueté anticorps indiqués qui étaient ± sélectifs contre le récepteur tumeur-surexprimé. Ceci a été suivi par l’imagerie in vivo vivante. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Imagerie in vivo vivante de souris porteuses de tumeurs humaines OVCAR3.
Choisies au hasard de 6 à 8 semaines (âge) et de 20 à 25 grammes (poids) athymique sans poils Nude Foxn1nu/Foxn1+ (Envigo) ont été greffées avec FOLR1+ tumeurs ovariennes (cellules OVCAR-3). Après 3 semaines avec des tumeurs évidentes, les souris ont été injectées par veine de queue avec IRDye 800CW étiqueté contrôle IgG1, abagovomab (CA-125 anticorps anti-idiotypic), farletuzumab (anticorps anti-FOLR1) et BaCa (anticorps anti-FOLR1-DR5) suivi de l’imagerie en direct à des moments indiqués. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5 : Imagerie in vivo vivante de FOLR1 humain exprimant la tumeur dérivée de cellules mc38 murine portant des souris.
(A) Choisi au hasard 6 à 8 semaines (Âge) et 20-25 g NOD. Cg Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ ou souris nues ont été injectés SQ avec murine MC38 cellules exprimant habilement folr1 humain. Lors de l’apparition de tumeur, les souris ont été injectées par veine de queue avec IRDye 800CW étiqueté IgG1 contrôle, abagovomab (CA-125 anticorps anti-idiotypic), farletuzumab (anticorps anti-FOLR1) et BaCa (anticorps anti-FOLR1-DR5) suivie de l’imagerie en direct à des moments indiqués. (B) Après 7 jours les animaux ont été euthanasiés et les organes clés isolés (comme indiqué) ont été photographiés ensemble avec des tumeurs greffées pour la distribution relative de signal d’anticorps (IRDye 800CW). Comme prévu, les tumeurs sont restées négatives avec le signal IRDye 800CW dans le contrôle IgG1 et l’anticorps anti-idiotypic CA-125, les animaux injectés d’abagovomab. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Fichier supplémentaire 1 : Séquences de tous les anticorps et amorce. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

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La livraison sélective et spécifique de tissu de tumeur de l’agent thérapeutique anticancéreux est la clé pour mesurer l’efficacité et l’innocuité d’une thérapie cibléedonnée 13. Ici nous avons décrit une approche rapide et efficace pour étudier la distribution détaillée de tissu et de tumeur du clinicien, du farletuzumab et d’un anticorps nonclinique de BaCa. L’approche décrite est applicable à n’importe quel anticorps nouvellement généré et peut être employée aux côtés d’un anticorps médicalement efficace (avec les qualités désirées) pour ses propriétés de distribution de tumeur/organe. Considérant que la plupart des récepteurs cibles d’anticorps (tels que HER2 dans le cancer du sein) sont fortement surexprimés dans les cellules tumorales (tissus), dans la plupart des cas leur expression et fonction sous-optimales est également critique dans les types cellulaires autres que les cellulestumorales 14. Par exemple, une proportion significative d’EGFR ciblant les anticorps cliniques chez les patients atteints de cancer du côlon s’accumulent et causent une toxicité pour le tissucutané 15, un tissu non cancéreux dont la croissance et la différenciation nécessitent une signalisation et une fonction EGFR. Par conséquent, nous croyons fermement que ce genre d’investigations préliminaires de distribution de tissu en combinations avec l’hépatotoxicité et les essais d’histochimie de tissu dans une plus grande cohorte d’animaux sont essentiels pour évaluer globalement l’innocuité et la viabilité thérapeutique de l’anticorps nouvellement produit. En outre, les études décrites de distribution de tissu seraient également fortement applicables dans les études compétentes immunisées de xénogreffe de souris, si l’anticorps nouvellement produit maintient la réactivité croisée à l’antigène/récepteur de contrepartie murine. Dans les études syngénéiques sur les animaux, ainsi que la distribution des tumeurs et les études d’histochimie tissulaire, une analyse détaillée de la cytokine sanguine peut être utilisée pour renforcer les données sur l’efficacité et l’innocuité. Une caractéristique attrayante de l’approche décrite est qu’elle permet la quantitation presque précise de la distribution d’anticorps si les données sont en outre soutenues avec ELISA (contre l’antigène cible) de la tumeur et d’autres lysates significatifs de tissu (tels que le foie, le coeur, le poumon, la rate, le rein etc.)7. Une autre caractéristique importante de la méthode décrite par rapport à la tomographie calculée par émission de photons (appelée SPECT) et à la tomographie par émission de position (TEP) est larentabilité 16. Spect et PET sont très coûteux et fait usage de traceurs radioactifs pour l’imagerie, ce qui rend l’ensemble du processus lourd si l’essai d’une grande cohorted’animaux 17. En outre, les installations d’imagerie SPECT et PET ne sont pas très standard dans les laboratoires et les vivariums pour étudier les petits modèles animaux de maladies telles que lessouris 18.

Une limitation avec la méthode décrite pour réaliser une quantitation presque précise de la distribution de tumeur d’anticorps est la dépendance à la liaison d’antigène cible d’affinité élevée. C’est parce que les interactions d’antigène-anticorps d’affinité élevée peuvent avoir comme conséquence la « disposition de drogue cible-médiatisée (TMDD) » par l’endocytose accrue et le shuttling aux lysosomes19. Par conséquent, les résultats de l’approche décrite varieront selon le récepteur cible particulier dans un type particulier de tumeur. Ainsi, nous recommandons fortement de tester les anticorps/anticorps étiquetés dans une grande cohorte d’animaux avec des xénogreffes tumorales générées avec plus d’une lignée de cellules tumorales ayant l’expression variable (hétérogène) du récepteur cible d’antigène. Il est également fortement recommandé d’utiliser plus d’un colorant conjugué fluorescent (s) et des souches de souris pour les études proposées.

Considérant que les anticorps de petite taille tels que fabs, scFvs,, DARTs, etc. (manque de recyclage de récupération par récepteur néonatal fc (FcRn) effacer plus rapidement des tumeurs (avec sérum à mi-temps étant minutes à heures), il convient de prendre soin de comparer les données entre les différents types de tumeurs ayant une expression fcrn très variable. En outre, les molécules plus grandes (telles que les anticorps à double et trispécifique) qui sont conçues avec le domaine fc pour le recyclage de récupération ont des problèmes de pénétration des tissus et des tumeurs. Dans ces scénarios, l’approche décrite ne sera pas appropriée pour comparer la distribution tissulaire/tumorale des anticorps qui diffèrent considérablement dans lestailles 6. En termes d’importance cependant, la tumeur décrite et les études détaillées de distribution de tissu avec leurs anticorps monospécifiques de contrepartie serviraient de facteur clé dans une conception efficace de plate-forme d’anticorps de double et de trispecificity. Enfin, puisque les anticorps optimisés pour l’affinité et l’avidité ont généralement une distribution significativement homogène dans les tumeurs, la sélection de l’épitope tumoral cible (dépourvue de TMDD), l’affinité globale des anticorps et l’activité biologique dans un modèle de cancer particulier devraient toujours être prises en considération avant de conclure à la pénétration, à l’innocuité et à l’efficacité tumorales.

En résumé, nous avons décrit une méthode rapide et simple pour surveiller la distribution de tumeur et de tissu des anticorps injectés par voie intraveineuse. L’approche décrite a ajouté le potentiel d’analyser les conjugués anticorps-siRNA (où le siRNA est étiqueté), les conjugués anticorps-médicaments (où le médicament est étiqueté) et les anticorps-nanoparticules (où les lipides nanoparticules sont étiquetés avec du colorant fluorescent). De même, un résidu de cystéine conçu de façon unique dans une tumeur ciblant le scFv (s’il est étiqueté fluorescentement avec la chimie du mélamide) des cellules T du récepteur d’antigène chimérique (CAR-T) et du CAR-NK sera une approche rentable pour analyser la distribution tumorale/tissulaire de ces thérapies à base de cellules indépendamment des stratégies de signaux GFP/DP à base de transfection virale.

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Disclosures

Les auteurs n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Acknowledgments

Nous sommes reconnaissants à l’Université de Virginie Cancer Center Centre Centre d’imagerie de base, Biomolecular Analysis Facility, Advanced Microscopy Facility et le Core Vivarium Facility for Assistance. J. T-S est un chercheur en début de carrière de l’Ovarian Cancer Academy (OCA-DoD). Ces travaux ont été appuyés par la subvention de l’INFE/NIH (R01CA233752) à J. T-S, U.S. DoD Breast Cancer Research Program (BCRP) breakthrough level-1 award to J. T-S (BC17097) et U.S. DoD Ovarian Cancer Research Program (OCRP) funding award (OC180412) to J. T-S

Materials

Name Company Catalog Number Comments
FreeStyle CHO media Gibco Life Technologies Cat # 12651-014
Anti-Anti (100X) Gibco Life Technologies Cat # 15240-062
Anti-Clumping Agent Gibco Life Technologies Cat # 01-0057DG
BD Insulin Syringe BD BioSciences Cat #329420
Caliper IVIS Spectrum PerkinElmer Cat #124262
CHO CD EfficientFeed B Gibco Life Technologies Cat #A10240-01
Corning 500 mL DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) Corning Cat # 10-13-CV
Corning 500 mL RPMI 1640 Corning Cat # 10-040-CV
Cy5 conjugated Anti-Human IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch Cat # 709-175-149
GlutaMax-I (100X) Gibco Life Technologies Cat # 35050-061
HiPure Plasmid Maxiprep kit Invitrogen Cat # K21007
HiTrap MabSelect SuRe Column GE Healthcare Cat # 11-0034-93
Infusion Takara BioScience STO344
IRDye 800CW NHS Ester LI-COR Cat # 929-70020
Isoflurane, USP Covetrus Cat # 11695-6777-2
Lubricant Eye Ointment Refresh Lacri-Lube Cat #4089
Matrigel Corning Cat # 354234
PEI transfection reagent Thermo Fisher Cat # BMS1003A
Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes Thermo Scientific Cat # 66333
Steritop Vacuum Filters Millipore Express Cat #S2GPT02RE
Trypsin-EDTA Gibco Life Technologies Cat # 15400-054
Experimental Models: Cell lines
Human: OVCAR-3 American Type Culture Collection ATCC HTB-161
Human: CHO-K cells Stable transformed in our lab ATCC CCL-61
Mouse: 4T1 Kind gift from Dr. Chip Landen, UVA
Mouse: MC38 Kind gift from Dr. Suzanne Ostrand-Rosenberg, UMBC Authenticated by STR profiling
Mouse: MC38 hFOLR1 Generated in our laboratory (This paper)
Experimental Models: Animal
Mice: athymic Nude Foxn1nu/Foxn1+ Envigo Multiple Orders
Mice: NOD.Cg Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ Jackson Laboratory Multiple Orders

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References

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Analyse de la distribution des tumeurs et des tissus de l’anticorps thérapeutique spécifique à l’antigène cible
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Shivange, G., Mondal, T., Lyerly, E., Gatesman, J., Tushir-Singh, J. Analyzing Tumor and Tissue Distribution of Target Antigen Specific Therapeutic Antibody. J. Vis. Exp. (159), e60727, doi:10.3791/60727 (2020).More

Shivange, G., Mondal, T., Lyerly, E., Gatesman, J., Tushir-Singh, J. Analyzing Tumor and Tissue Distribution of Target Antigen Specific Therapeutic Antibody. J. Vis. Exp. (159), e60727, doi:10.3791/60727 (2020).

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