Her presenterer vi en protokoll for å studere in vivo lokalisering av antistoffer i mus tumor xenograft modeller.
Monoklonale antistoffer er multifunksjonelle legemidler med høy affinitet som virker ved variable uavhengige mekanismer for å eliminere kreftceller. I løpet av de siste tiårene har feltet antistoff-medikamentkonjugater, bispesifikke antistoffer, kimeriske antigenreseptorer (CAR) og kreftimmunterapi dukket opp som det mest lovende området for grunnleggende og terapeutiske undersøkelser. Med mange vellykkede menneskelige studier rettet mot immun kontrollpunkt reseptorer og CAR-T celler i leukemi og melanom i et gjennombrudd tempo, Det er svært spennende tider for onkologiske terapier avledet fra varianter av antistoff engineering. Dessverre har et betydelig stort antall antistoff- og CAR-baserte terapeutiske midler også vist seg skuffende i menneskelige studier av fast kreft på grunn av begrenset tilgjengelighet av immuneffektorceller i tumorsengen. Viktigere, uspesifikk fordeling av terapeutiske antistoffer i vev annet enn svulster bidrar også til mangel på klinisk effekt, assosiert toksisitet og klinisk svikt. Som trofast oversettelse av prekliniske studier til menneskelige kliniske stier er svært avhengig av mus tumor xenograft effekt og sikkerhetsstudier, her fremhever vi en metode for å teste svulsten og generell vevfordeling av terapeutiske antistoffer. Dette oppnås ved å merke protein-A renset antistoff med nær infrarød fluorescerende fargestoff etterfulgt av levende avbildning av tumorbærende mus.
FDA godkjente det første monoklonale antistoffet rettet mot CD3 (OKT3, Muromonab) i 19861,2. Siden da i de neste tjue årene har det vært en rask eksplosjon innen antistoffteknikk på grunn av den overveldende suksessen til antistoffer mot immunkontrollpunkthemmere3. Ved siden av indirekte aktivering av immunsystemet, antistoffer blir rettet mot å direkte flagge kreftceller for å nøyaktig engasjere immun effektorceller, utløse cytotoksisitet via død reseptoragonist, blokkere tumorcelle overlevelse signalering, hindre angiogenese (vekst av blodkar), begrense immun kontrollpunkt regulatorer, levere radioisotoper, kjemoterapi narkotika og siRNA som en konjugert agenter2. I tillegg er det å studere enkeltkjedevariable fragmenter (scFv) av ulike antistoffer på overflaten av pasientavledede T-celler og NK-celler (CAR-T og CAR-NK) et raskt voksende område av kliniske undersøkelser for cellebaserteterapier 4.
Den ultrahøye affiniteten til antistoffbaserte legemidler som gir selektivitet til antigen som uttrykker tumorceller, gjør det til et attraktivt middel. Likeledes, målrettet levering og tumor oppbevaring av et terapeutisk antistoff (eller et kjemisk stoff) er nøkkelen til å balansere effekten over toksisitet. Derfor utnyttes et stort antall proteiningeniørbaserte strategier som inkluderer, men ikke er begrenset til bispesifikke5 og trispesifikkeantistoffer 6 for å forbedre ivrig optimalisert tumorretensjon av intravenøst (IV) injiserte terapeutiskemidler 5,7. Her beskriver vi en enkel fluorescensbasert metode for å håndtere tumor- og vevsfordelingen av potensielt effektive anti-kreftantistoffer.
Fordi dyrevev har autofluorescen når de er begeistret i synlig spektrum, ble antistoffene opprinnelig merket med nær infrarød fargestoff (f.eks. IRDye 800CW). For bevis på konseptundersøkelser har vi benyttet folatreseptor alfa-1 (FOLR1) rettet mot antistoff kalt farletuzumab og dets derivat kalt Bispecific anchor Cytotoxicity activator (BaCa)7 antistoff som er rettet mot FOLR1 og dødreseptor-5 (DR5)8 i ett rekombinant antistoff. FOLR1 er en veldefinert overuttrykt målreseptor i eggstokkreftceller og TNBC kreftceller, tumor xenografts og pasientsvulster9. Spesielt er det flere anstrengelser for å klinisk utnytte FOLR1 ved hjelp av antistoffbaserte tilnærminger for å engasjere immuneffektorceller og antistoffkonjugater (ADC) for eggstokkreft og brystkreft10,11.
I dette metodepapiret klonet, uttrykte og renset vi klinisk anti-FOLR1 (farletuzumab) sammen med andre kontrollantistoffer ved hjelp av CHO-uttrykkssystemet. IgG1 isotype og et klinisk anti-idiotype mucin-16 antistoff kalt abagovomab12 ble brukt som negative kontroller. Etter protein-A rensing, indikerte antistoffer ble merket med IRDye 800CW og ble administrert inn i halen vene av nakne mus enten bærer ovarietumor xenografts eller stabilt transfected menneskelig FOLR1 uttrykker murine tykktarmskreft xenografts. Antistoff lokalisering ble sporet av live imaging ved hjelp av in vivo bildespekteret på flere forskjellige tidspunkter7. Denne metoden krever ingen genetisk modifikasjon eller injeksjon av substratet for å muliggjøre lysutslipp og er betydelig raskere, kostnadseffektiv og effektiv. Den generelle klonings-, uttrykks-, rense- og merkingsprotokollen beskrevet nedenfor kan brukes på ethvert klinisk og ikke-klinisk antistoff hvis tunge og lette kjedesekvenser er tilgjengelige.
Selektiv og tumorvev spesifikk levering av anti-kreft terapeutisk middel er nøkkelen til å måle effekt og sikkerhet av en gitt målrettet terapi13. Her har vi beskrevet en rask og effektiv tilnærming for å undersøke detaljert vev og tumorfordeling av klinisk, farletuzumab og et ikke-klinisk BaCa-antistoff. Den beskrevne tilnærmingen gjelder for ethvert nylig generert antistoff og kan brukes sammen med et klinisk effektivt antistoff (med ønskede egenskaper) for sine tumor / organfordelingse…
The authors have nothing to disclose.
Vi er takknemlige til University of Virginia Cancer Center Core Imaging Facility, Biomolecular Analysis Facility, Advanced Microscopy Facility og Core Vivarium Facility for Assistance. J. T-S er en tidlig karriere etterforsker av Ovarian Cancer Academy (OCA-DoD). Dette arbeidet ble støttet av NCI/NIH stipend (R01CA233752) til J. T-S, US DoD Breast Cancer Research Program (BCRP) gjennombrudd nivå-1 award til J. T-S (BC17097) og US DoD Ovarian Cancer Research Program (OCRP) finansiering award (OC180412) til J. T-S
FreeStyle CHO media | Gibco Life Technologies | Cat # 12651-014 | |
Anti-Anti (100X) | Gibco Life Technologies | Cat # 15240-062 | |
Anti-Clumping Agent | Gibco Life Technologies | Cat # 01-0057DG | |
BD Insulin Syringe | BD BioSciences | Cat #329420 | |
Caliper IVIS Spectrum | PerkinElmer | Cat #124262 | |
CHO CD EfficientFeed B | Gibco Life Technologies | Cat #A10240-01 | |
Corning 500 mL DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) | Corning | Cat # 10-13-CV | |
Corning 500 mL RPMI 1640 | Corning | Cat # 10-040-CV | |
Cy5 conjugated Anti-Human IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | Cat # 709-175-149 | |
GlutaMax-I (100X) | Gibco Life Technologies | Cat # 35050-061 | |
HiPure Plasmid Maxiprep kit | Invitrogen | Cat # K21007 | |
HiTrap MabSelect SuRe Column | GE Healthcare | Cat # 11-0034-93 | |
Infusion | Takara BioScience | STO344 | |
IRDye 800CW NHS Ester | LI-COR | Cat # 929-70020 | |
Isoflurane, USP | Covetrus | Cat # 11695-6777-2 | |
Lubricant Eye Ointment | Refresh Lacri-Lube | Cat #4089 | |
Matrigel | Corning | Cat # 354234 | |
PEI transfection reagent | Thermo Fisher | Cat # BMS1003A | |
Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes | Thermo Scientific | Cat # 66333 | |
Steritop Vacuum Filters | Millipore Express | Cat #S2GPT02RE | |
Trypsin-EDTA | Gibco Life Technologies | Cat # 15400-054 | |
Experimental Models: Cell lines | |||
Human: OVCAR-3 | American Type Culture Collection | ATCC HTB-161 | |
Human: CHO-K cells | Stable transformed in our lab | ATCC CCL-61 | |
Mouse: 4T1 | Kind gift from Dr. Chip Landen, UVA | ||
Mouse: MC38 | Kind gift from Dr. Suzanne Ostrand-Rosenberg, UMBC | Authenticated by STR profiling | |
Mouse: MC38 hFOLR1 | Generated in our laboratory (This paper) | ||
Experimental Models: Animal | |||
Mice: athymic Nude Foxn1nu/Foxn1+ | Envigo | Multiple Orders | |
Mice: NOD.Cg Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ | Jackson Laboratory | Multiple Orders |