Summary

Analysere tumor- og vevsfordeling av målantigenspesifikt terapeutisk antistoff

Published: May 16, 2020
doi:

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å studere in vivo lokalisering av antistoffer i mus tumor xenograft modeller.

Abstract

Monoklonale antistoffer er multifunksjonelle legemidler med høy affinitet som virker ved variable uavhengige mekanismer for å eliminere kreftceller. I løpet av de siste tiårene har feltet antistoff-medikamentkonjugater, bispesifikke antistoffer, kimeriske antigenreseptorer (CAR) og kreftimmunterapi dukket opp som det mest lovende området for grunnleggende og terapeutiske undersøkelser. Med mange vellykkede menneskelige studier rettet mot immun kontrollpunkt reseptorer og CAR-T celler i leukemi og melanom i et gjennombrudd tempo, Det er svært spennende tider for onkologiske terapier avledet fra varianter av antistoff engineering. Dessverre har et betydelig stort antall antistoff- og CAR-baserte terapeutiske midler også vist seg skuffende i menneskelige studier av fast kreft på grunn av begrenset tilgjengelighet av immuneffektorceller i tumorsengen. Viktigere, uspesifikk fordeling av terapeutiske antistoffer i vev annet enn svulster bidrar også til mangel på klinisk effekt, assosiert toksisitet og klinisk svikt. Som trofast oversettelse av prekliniske studier til menneskelige kliniske stier er svært avhengig av mus tumor xenograft effekt og sikkerhetsstudier, her fremhever vi en metode for å teste svulsten og generell vevfordeling av terapeutiske antistoffer. Dette oppnås ved å merke protein-A renset antistoff med nær infrarød fluorescerende fargestoff etterfulgt av levende avbildning av tumorbærende mus.

Introduction

FDA godkjente det første monoklonale antistoffet rettet mot CD3 (OKT3, Muromonab) i 19861,2. Siden da i de neste tjue årene har det vært en rask eksplosjon innen antistoffteknikk på grunn av den overveldende suksessen til antistoffer mot immunkontrollpunkthemmere3. Ved siden av indirekte aktivering av immunsystemet, antistoffer blir rettet mot å direkte flagge kreftceller for å nøyaktig engasjere immun effektorceller, utløse cytotoksisitet via død reseptoragonist, blokkere tumorcelle overlevelse signalering, hindre angiogenese (vekst av blodkar), begrense immun kontrollpunkt regulatorer, levere radioisotoper, kjemoterapi narkotika og siRNA som en konjugert agenter2. I tillegg er det å studere enkeltkjedevariable fragmenter (scFv) av ulike antistoffer på overflaten av pasientavledede T-celler og NK-celler (CAR-T og CAR-NK) et raskt voksende område av kliniske undersøkelser for cellebaserteterapier 4.

Den ultrahøye affiniteten til antistoffbaserte legemidler som gir selektivitet til antigen som uttrykker tumorceller, gjør det til et attraktivt middel. Likeledes, målrettet levering og tumor oppbevaring av et terapeutisk antistoff (eller et kjemisk stoff) er nøkkelen til å balansere effekten over toksisitet. Derfor utnyttes et stort antall proteiningeniørbaserte strategier som inkluderer, men ikke er begrenset til bispesifikke5 og trispesifikkeantistoffer 6 for å forbedre ivrig optimalisert tumorretensjon av intravenøst (IV) injiserte terapeutiskemidler 5,7. Her beskriver vi en enkel fluorescensbasert metode for å håndtere tumor- og vevsfordelingen av potensielt effektive anti-kreftantistoffer.

Fordi dyrevev har autofluorescen når de er begeistret i synlig spektrum, ble antistoffene opprinnelig merket med nær infrarød fargestoff (f.eks. IRDye 800CW). For bevis på konseptundersøkelser har vi benyttet folatreseptor alfa-1 (FOLR1) rettet mot antistoff kalt farletuzumab og dets derivat kalt Bispecific anchor Cytotoxicity activator (BaCa)7 antistoff som er rettet mot FOLR1 og dødreseptor-5 (DR5)8 i ett rekombinant antistoff. FOLR1 er en veldefinert overuttrykt målreseptor i eggstokkreftceller og TNBC kreftceller, tumor xenografts og pasientsvulster9. Spesielt er det flere anstrengelser for å klinisk utnytte FOLR1 ved hjelp av antistoffbaserte tilnærminger for å engasjere immuneffektorceller og antistoffkonjugater (ADC) for eggstokkreft og brystkreft10,11.

I dette metodepapiret klonet, uttrykte og renset vi klinisk anti-FOLR1 (farletuzumab) sammen med andre kontrollantistoffer ved hjelp av CHO-uttrykkssystemet. IgG1 isotype og et klinisk anti-idiotype mucin-16 antistoff kalt abagovomab12 ble brukt som negative kontroller. Etter protein-A rensing, indikerte antistoffer ble merket med IRDye 800CW og ble administrert inn i halen vene av nakne mus enten bærer ovarietumor xenografts eller stabilt transfected menneskelig FOLR1 uttrykker murine tykktarmskreft xenografts. Antistoff lokalisering ble sporet av live imaging ved hjelp av in vivo bildespekteret på flere forskjellige tidspunkter7. Denne metoden krever ingen genetisk modifikasjon eller injeksjon av substratet for å muliggjøre lysutslipp og er betydelig raskere, kostnadseffektiv og effektiv. Den generelle klonings-, uttrykks-, rense- og merkingsprotokollen beskrevet nedenfor kan brukes på ethvert klinisk og ikke-klinisk antistoff hvis tunge og lette kjedesekvenser er tilgjengelige.

Protocol

Alle prosedyrene som involverer dyr håndtering og tumor xenografts studier ble gjennomgått og godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) her ved University of Virginia og i samsvar med de relevante regulatoriske standarder 1. Uttrykk og rensing av antistoffer Vedlikehold av CHO-celler Grow CHO celler i FreeStyle CHO Media supplert med kommersielt tilgjengelig 1x glutamin supplement ved 37 ° C risting ved 130 rpm med 5% CO2 ved hjelp av avlan…

Representative Results

I den beskrevne metodikken klonet vi først antistoffer rettet mot folatreseptor alfa-1 (FOLR1) kalt farletuzumab, og et bispesifikt antistoff kalt BaCa bestående av farletuzumab og leksatumumab sammen med kontrollantistoffer som abagovomab (sekvenser gitt i supplerende fil 1). Detaljer om representative variable tunge (VH) og variable lys (VL) domener i DNA-kloner (pVH, pVL) er vist i figur 1A. For å bekrefte de positive klonene, utførte vi kolonien PCR ved hjelp av sign…

Discussion

Selektiv og tumorvev spesifikk levering av anti-kreft terapeutisk middel er nøkkelen til å måle effekt og sikkerhet av en gitt målrettet terapi13. Her har vi beskrevet en rask og effektiv tilnærming for å undersøke detaljert vev og tumorfordeling av klinisk, farletuzumab og et ikke-klinisk BaCa-antistoff. Den beskrevne tilnærmingen gjelder for ethvert nylig generert antistoff og kan brukes sammen med et klinisk effektivt antistoff (med ønskede egenskaper) for sine tumor / organfordelingse…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi er takknemlige til University of Virginia Cancer Center Core Imaging Facility, Biomolecular Analysis Facility, Advanced Microscopy Facility og Core Vivarium Facility for Assistance. J. T-S er en tidlig karriere etterforsker av Ovarian Cancer Academy (OCA-DoD). Dette arbeidet ble støttet av NCI/NIH stipend (R01CA233752) til J. T-S, US DoD Breast Cancer Research Program (BCRP) gjennombrudd nivå-1 award til J. T-S (BC17097) og US DoD Ovarian Cancer Research Program (OCRP) finansiering award (OC180412) til J. T-S

Materials

FreeStyle CHO media Gibco Life Technologies Cat # 12651-014
Anti-Anti (100X) Gibco Life Technologies Cat # 15240-062
Anti-Clumping Agent Gibco Life Technologies Cat # 01-0057DG
BD Insulin Syringe BD BioSciences Cat #329420
Caliper IVIS Spectrum PerkinElmer Cat #124262
CHO CD EfficientFeed B Gibco Life Technologies Cat #A10240-01
Corning 500 mL DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) Corning Cat # 10-13-CV
Corning 500 mL RPMI 1640 Corning Cat # 10-040-CV
Cy5 conjugated Anti-Human IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch Cat # 709-175-149
GlutaMax-I (100X) Gibco Life Technologies Cat # 35050-061
HiPure Plasmid Maxiprep kit Invitrogen Cat # K21007
HiTrap MabSelect SuRe Column GE Healthcare Cat # 11-0034-93
Infusion Takara BioScience STO344
IRDye 800CW NHS Ester LI-COR Cat # 929-70020
Isoflurane, USP Covetrus Cat # 11695-6777-2
Lubricant Eye Ointment Refresh Lacri-Lube Cat #4089
Matrigel Corning Cat # 354234
PEI transfection reagent Thermo Fisher Cat # BMS1003A
Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes Thermo Scientific Cat # 66333
Steritop Vacuum Filters Millipore Express Cat #S2GPT02RE
Trypsin-EDTA Gibco Life Technologies Cat # 15400-054
Experimental Models: Cell lines
Human: OVCAR-3 American Type Culture Collection ATCC HTB-161
Human: CHO-K cells Stable transformed in our lab ATCC CCL-61
Mouse: 4T1 Kind gift from Dr. Chip Landen, UVA
Mouse: MC38 Kind gift from Dr. Suzanne Ostrand-Rosenberg, UMBC Authenticated by STR profiling
Mouse: MC38 hFOLR1 Generated in our laboratory (This paper)
Experimental Models: Animal
Mice: athymic Nude Foxn1nu/Foxn1+ Envigo Multiple Orders
Mice: NOD.Cg Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ Jackson Laboratory Multiple Orders

References

  1. Takahashi, K. Muromonab CD3 (Orthoclone OKT3). Journal of Toxicological Sciences. 20, 483-484 (1995).
  2. Tushir-Singh, J. Antibody-siRNA conjugates: drugging the undruggable for anti-leukemic therapy. Expert Opinion in Biological Therapy. 17, 325-338 (2017).
  3. Gravitz, L. Cancer immunotherapy. Nature. 504, 1 (2013).
  4. Pagel, J. M., West, H. J. Chimeric Antigen Receptor (CAR) T-Cell Therapy. JAMA Oncology. 3, 1595 (2017).
  5. Brinkmann, U., Kontermann, R. E. The making of bispecific antibodies. MAbs. 9, 182-212 (2017).
  6. Runcie, K., Budman, D. R., John, V., Seetharamu, N. Bi-specific and tri-specific antibodies- the next big thing in solid tumor therapeutics. Molecular Medicine. 24, 50 (2018).
  7. Shivange, G., et al. A Single-Agent Dual-Specificity Targeting of FOLR1 and DR5 as an Effective Strategy for Ovarian Cancer. Cancer Cell. 34, 331-345 (2018).
  8. Wajant, H. Molecular Mode of Action of TRAIL Receptor Agonists-Common Principles and Their Translational Exploitation. Cancers (Basel). 11 (7), 954 (2019).
  9. Necela, B. M., et al. Folate receptor-alpha (FOLR1) expression and function in triple negative tumors. PLoS One. 10, 0122209 (2015).
  10. Lin, J., et al. The antitumor activity of the human FOLR1-specific monoclonal antibody, farletuzumab, in an ovarian cancer mouse model is mediated by antibody-dependent cellular cytotoxicity. Cancer Biology Therapy. 14, 1032-1038 (2013).
  11. Chen, Y., Kim, M. T., Zheng, L., Deperalta, G., Jacobson, F. Structural Characterization of Cross-Linked Species in Trastuzumab Emtansine (Kadcyla). Bioconjugate Chemistry. 27, 2037-2047 (2016).
  12. Bauerschlag, D. O., et al. Anti-idiotypic antibody abagovomab in advanced ovarian cancer. Future Oncology. 4, 769-773 (2008).
  13. Narita, Y., Muro, K. Challenges in molecular targeted therapy for gastric cancer: considerations for efficacy and safety. Expert Opinion in Drug Safety. 16, 319-327 (2017).
  14. Jordan, N. V., et al. HER2 expression identifies dynamic functional states within circulating breast cancer cells. Nature. 537, 102-106 (2016).
  15. Fakih, M., Vincent, M. Adverse events associated with anti-EGFR therapies for the treatment of metastatic colorectal cancer. Current Oncology. 17, 18-30 (2010).
  16. Koba, W., Jelicks, L. A., Fine, E. J. MicroPET/SPECT/CT imaging of small animal models of disease. American Journal of Pathology. 182, 319-324 (2013).
  17. van der Wall, E. E. Cost analysis favours SPECT over PET and CTA for evaluation of coronary artery disease: the SPARC study. Netherland Heart Journal. 22, 257-258 (2014).
  18. Van Dort, M. E., Rehemtulla, A., Ross, B. D. PET and SPECT Imaging of Tumor Biology: New Approaches towards Oncology Drug Discovery and Development. Current Computer Aided Drug Design. 4, 46-53 (2008).
  19. Dua, P., Hawkins, E., van der Graaf, P. H. A Tutorial on Target-Mediated Drug Disposition (TMDD) Models. CPT Pharmacometrics and System Pharmacology. 4, 324-337 (2015).

Play Video

Cite This Article
Shivange, G., Mondal, T., Lyerly, E., Gatesman, J., Tushir-Singh, J. Analyzing Tumor and Tissue Distribution of Target Antigen Specific Therapeutic Antibody. J. Vis. Exp. (159), e60727, doi:10.3791/60727 (2020).

View Video