Analysere tumor- og vevsfordeling av målantigenspesifikt terapeutisk antistoff

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å studere in vivo lokalisering av antistoffer i mus tumor xenograft modeller.

Abstract

Monoklonale antistoffer er multifunksjonelle legemidler med høy affinitet som virker ved variable uavhengige mekanismer for å eliminere kreftceller. I løpet av de siste tiårene har feltet antistoff-medikamentkonjugater, bispesifikke antistoffer, kimeriske antigenreseptorer (CAR) og kreftimmunterapi dukket opp som det mest lovende området for grunnleggende og terapeutiske undersøkelser. Med mange vellykkede menneskelige studier rettet mot immun kontrollpunkt reseptorer og CAR-T celler i leukemi og melanom i et gjennombrudd tempo, Det er svært spennende tider for onkologiske terapier avledet fra varianter av antistoff engineering. Dessverre har et betydelig stort antall antistoff- og CAR-baserte terapeutiske midler også vist seg skuffende i menneskelige studier av fast kreft på grunn av begrenset tilgjengelighet av immuneffektorceller i tumorsengen. Viktigere, uspesifikk fordeling av terapeutiske antistoffer i vev annet enn svulster bidrar også til mangel på klinisk effekt, assosiert toksisitet og klinisk svikt. Som trofast oversettelse av prekliniske studier til menneskelige kliniske stier er svært avhengig av mus tumor xenograft effekt og sikkerhetsstudier, her fremhever vi en metode for å teste svulsten og generell vevfordeling av terapeutiske antistoffer. Dette oppnås ved å merke protein-A renset antistoff med nær infrarød fluorescerende fargestoff etterfulgt av levende avbildning av tumorbærende mus.

Introduction

FDA godkjente det første monoklonale antistoffet rettet mot CD3 (OKT3, Muromonab) i 1986^1,2. Siden da i de neste tjue årene har det vært en rask eksplosjon innen antistoffteknikk på grunn av den overveldende suksessen til antistoffer mot immunkontrollpunkthemmere³. Ved siden av indirekte aktivering av immunsystemet, antistoffer blir rettet mot å direkte flagge kreftceller for å nøyaktig engasjere immun effektorceller, utløse cytotoksisitet via død reseptoragonist, blokkere tumorcelle overlevelse signalering, hindre angiogenese (vekst av blodkar), begrense immun kontrollpunkt regulatorer, levere radioisotoper, kjemoterapi narkotika og siRNA som en konjugert agenter². I tillegg er det å studere enkeltkjedevariable fragmenter (scFv) av ulike antistoffer på overflaten av pasientavledede T-celler og NK-celler (CAR-T og CAR-NK) et raskt voksende område av kliniske undersøkelser for cellebaserte^{terapier 4}.

Den ultrahøye affiniteten til antistoffbaserte legemidler som gir selektivitet til antigen som uttrykker tumorceller, gjør det til et attraktivt middel. Likeledes, målrettet levering og tumor oppbevaring av et terapeutisk antistoff (eller et kjemisk stoff) er nøkkelen til å balansere effekten over toksisitet. Derfor utnyttes et stort antall proteiningeniørbaserte strategier som inkluderer, men ikke er begrenset til bispesifikke⁵ og trispesifikke^{antistoffer 6} for å forbedre ivrig optimalisert tumorretensjon av intravenøst (IV) injiserte terapeutiske^{midler 5,7}. Her beskriver vi en enkel fluorescensbasert metode for å håndtere tumor- og vevsfordelingen av potensielt effektive anti-kreftantistoffer.

Fordi dyrevev har autofluorescen når de er begeistret i synlig spektrum, ble antistoffene opprinnelig merket med nær infrarød fargestoff (f.eks. IRDye 800CW). For bevis på konseptundersøkelser har vi benyttet folatreseptor alfa-1 (FOLR1) rettet mot antistoff kalt farletuzumab og dets derivat kalt Bispecific anchor Cytotoxicity activator (BaCa)⁷ antistoff som er rettet mot FOLR1 og dødreseptor-5 (DR5)⁸ i ett rekombinant antistoff. FOLR1 er en veldefinert overuttrykt målreseptor i eggstokkreftceller og TNBC kreftceller, tumor xenografts og pasientsvulster⁹. Spesielt er det flere anstrengelser for å klinisk utnytte FOLR1 ved hjelp av antistoffbaserte tilnærminger for å engasjere immuneffektorceller og antistoffkonjugater (ADC) for eggstokkreft og brystkreft^10,11.

I dette metodepapiret klonet, uttrykte og renset vi klinisk anti-FOLR1 (farletuzumab) sammen med andre kontrollantistoffer ved hjelp av CHO-uttrykkssystemet. IgG1 isotype og et klinisk anti-idiotype mucin-16 antistoff kalt abagovomab¹² ble brukt som negative kontroller. Etter protein-A rensing, indikerte antistoffer ble merket med IRDye 800CW og ble administrert inn i halen vene av nakne mus enten bærer ovarietumor xenografts eller stabilt transfected menneskelig FOLR1 uttrykker murine tykktarmskreft xenografts. Antistoff lokalisering ble sporet av live imaging ved hjelp av in vivo bildespekteret på flere forskjellige tidspunkter⁷. Denne metoden krever ingen genetisk modifikasjon eller injeksjon av substratet for å muliggjøre lysutslipp og er betydelig raskere, kostnadseffektiv og effektiv. Den generelle klonings-, uttrykks-, rense- og merkingsprotokollen beskrevet nedenfor kan brukes på ethvert klinisk og ikke-klinisk antistoff hvis tunge og lette kjedesekvenser er tilgjengelige.

Protocol

Alle prosedyrene som involverer dyr håndtering og tumor xenografts studier ble gjennomgått og godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) her ved University of Virginia og i samsvar med de relevante regulatoriske standarder 1. Uttrykk og rensing av antistoffer Vedlikehold av CHO-celler Grow CHO celler i FreeStyle CHO Media supplert med kommersielt tilgjengelig 1x glutamin supplement ved 37 ° C risting ved 130 rpm med 5% CO2 ved hjelp av avlan…

Representative Results

I den beskrevne metodikken klonet vi først antistoffer rettet mot folatreseptor alfa-1 (FOLR1) kalt farletuzumab, og et bispesifikt antistoff kalt BaCa bestående av farletuzumab og leksatumumab sammen med kontrollantistoffer som abagovomab (sekvenser gitt i supplerende fil 1). Detaljer om representative variable tunge (VH) og variable lys (VL) domener i DNA-kloner (pVH, pVL) er vist i figur 1A. For å bekrefte de positive klonene, utførte vi kolonien PCR ved hjelp av sign…

Discussion

Selektiv og tumorvev spesifikk levering av anti-kreft terapeutisk middel er nøkkelen til å måle effekt og sikkerhet av en gitt målrettet terapi¹³. Her har vi beskrevet en rask og effektiv tilnærming for å undersøke detaljert vev og tumorfordeling av klinisk, farletuzumab og et ikke-klinisk BaCa-antistoff. Den beskrevne tilnærmingen gjelder for ethvert nylig generert antistoff og kan brukes sammen med et klinisk effektivt antistoff (med ønskede egenskaper) for sine tumor / organfordelingse…

Materials

FreeStyle CHO media	Gibco Life Technologies	Cat # 12651-014
Anti-Anti (100X)	Gibco Life Technologies	Cat # 15240-062
Anti-Clumping Agent	Gibco Life Technologies	Cat # 01-0057DG
BD Insulin Syringe	BD BioSciences	Cat #329420
Caliper IVIS Spectrum	PerkinElmer	Cat #124262
CHO CD EfficientFeed B	Gibco Life Technologies	Cat #A10240-01
Corning 500 mL DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium)	Corning	Cat # 10-13-CV
Corning 500 mL RPMI 1640	Corning	Cat # 10-040-CV
Cy5 conjugated Anti-Human IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	Cat # 709-175-149
GlutaMax-I (100X)	Gibco Life Technologies	Cat # 35050-061
HiPure Plasmid Maxiprep kit	Invitrogen	Cat # K21007
HiTrap MabSelect SuRe Column	GE Healthcare	Cat # 11-0034-93
Infusion	Takara BioScience	STO344
IRDye 800CW NHS Ester	LI-COR	Cat # 929-70020
Isoflurane, USP	Covetrus	Cat # 11695-6777-2
Lubricant Eye Ointment	Refresh Lacri-Lube	Cat #4089
Matrigel	Corning	Cat # 354234
PEI transfection reagent	Thermo Fisher	Cat # BMS1003A
Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes	Thermo Scientific	Cat # 66333
Steritop Vacuum Filters	Millipore Express	Cat #S2GPT02RE
Trypsin-EDTA	Gibco Life Technologies	Cat # 15400-054
Experimental Models: Cell lines
Human: OVCAR-3	American Type Culture Collection	ATCC HTB-161
Human: CHO-K cells	Stable transformed in our lab	ATCC CCL-61
Mouse: 4T1	Kind gift from Dr. Chip Landen, UVA
Mouse: MC38	Kind gift from Dr. Suzanne Ostrand-Rosenberg, UMBC	Authenticated by STR profiling
Mouse: MC38 hFOLR1	Generated in our laboratory (This paper)
Experimental Models: Animal
Mice: athymic Nude Foxn1nu/Foxn1+	Envigo	Multiple Orders
Mice: NOD.Cg Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ	Jackson Laboratory	Multiple Orders