Analysera tumör och vävnad distribution av Target Antigen specifik terapeutisk antikropp
Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att studera in vivo lokalisering av antikroppar i möss tumör xenograft modeller.
Abstract
Monoklonala antikroppar är hög affinitet multifunktionella läkemedel som verkar genom variabel oberoende mekanismer för att eliminera cancerceller. Under de senaste decennierna har området antikropp-läkemedel konjugater, bispecifika antikroppar, chimära antigenreceptorer (CAR) och cancer immunterapi framträtt som det mest lovande området för grundläggande och terapeutiska undersökningar. Med många framgångsrika mänskliga försök riktade immun checkpoint receptorer och CAR-T-celler i leukemi och melanom i en genombrottstakt, är det mycket spännande tider för onkologiska therapeutics härrör från variationer av antikroppar engineering. Tyvärr har ett betydligt stort antal antikroppar och CAR-baserade therapeutics också visat sig vara en besvikelse i mänskliga prövningar av fasta cancerformer på grund av den begränsade tillgången på immuneffektorceller i tumörbädden. Viktigt, ospecifik fördelning av terapeutiska antikroppar i andra vävnader än tumörer bidrar också till bristen på klinisk effekt, associerad toxicitet och klinisk misslyckande. Som trogen översättning av prekliniska studier i mänskliga kliniska spår är starkt förlitat sig på möss tumör xenograft effekt och säkerhet studier, här vi belysa en metod för att testa tumör och allmänna vävnad distribution av terapeutiska antikroppar. Detta uppnås genom att märka proteinet-A renad antikropp med nära IR fluorescerande färgämne följt av levande avbildning av tumörbärande möss.
Introduction
FDA godkände den första monoklonala antikroppen inriktning CD3 (OKT3, Muromonab) i 19861,2. Sedan dess under de kommande tjugo åren har det skett en snabb explosion inom området för antikroppsteknik på grund av den överväldigande framgången för antikroppar mot immun kontrollpunktshämmare3. Bredvid indirekt aktivering av immunsystemet, antikroppar syftar till att direkt flagga cancerceller att exakt engagera immun effektorceller, utlösa cytotoxicitet via död receptogonist, blockera tumör cell överlevnad signalering, hindra angiogenes (tillväxt av blodkärl), begränsa immun checkpoint regulatorer, leverera radioisotoper, kemoterapi läkemedel och siRNA som en konjugerad agenter2. Dessutom är studera den enda kedjan variabel fragment (scFv) av olika antikroppar på ytan av patienten härrör T-celler och NK celler (CAR-T och CAR-NK) ett snabbt växande område av kliniska undersökningar för cell-baserade terapier4.
Den ultrahöga affiniteten av antikroppsbaserade läkemedel som ger selektivitet mot antigen som uttrycker tumörceller gör det till ett attraktivt medel. Likaså är riktad leverans och tumör lagring av en terapeutisk antikropp (eller ett kemiskt läkemedel) nyckeln till balans effekt över toxicitet. Därför är ett stort antal protein engineering baserade strategier som inkluderar men inte är begränsade till bispecifika5 och tri-specifika antikroppar6 utnyttjas för att avsevärt förstärka avidity optimerad tumörretention av intravenöst (IV) injicerade therapeutics5,7. Här beskriver vi en enkel fluorescens-baserad metod för att ta itu med tumör och vävnad distribution av potentiellt effektiva anti-cancer antikroppar.
Eftersom djurvävnader besitter auto-fluorescens när upphetsad i synligt spektrum, var antikropparna ursprungligen märkta med nära IR-färgämne (t.ex., IRDye 800CW). För proofs of concept investigations har vi utnyttjat folatreceptorn alpha-1 (FOLR1) med inriktning på antikropp som kallas farletuzumab och dess derivat som kallas Bispecific anchor Cytotoxicity activator (BaCa)7 antibody that co-targets FOLR1 and death receptor-5 (DR5)8 in one recombinant antibody. FOLR1 är en väldefinierad överuttryckt målreceptor i äggstocks- och TNBC-cancerceller, tumörxenografts och patienttumörer9. Noterbart är att det finns flera försök att kliniskt utnyttja FOLR1 med hjälp av antikroppsbaserade metoder för att engagera immuneffektorceller och antikroppar läkemedel konjugater (ADC) för äggstockscancer och bröstcancer10,11.
I detta metoder papper, vi klonade, uttryckt och renade kliniska anti-FOLR1 (farletuzumab) tillsammans med andra kontroll antikroppar med hjälp av CHO uttryck system. IgG1 isotype och en klinisk anti-idiotype mucin-16 antikroppar kallas abagovomab12 användes som negativa kontroller. Efter protein-A rening, indikerade antikroppar var märkt med IRDye 800CW och administrerades i svansen ven av nakna möss antingen med äggstockscancer tumör xenografts eller stably transfected mänskliga FOLR1 uttrycker murine kolon cancer xenografts. Antikroppslokalisationen spårades av live avbildning med hjälp av in vivo imaging spektrum vid flera olika tidpunkter7. Denna metod kräver inte någon genetisk modifiering eller injektion av substratet för att möjliggöra ljusemission och är betydligt snabbare, kostnadseffektiv och effektiv. Det allmänna klonings-, uttrycks-, renings- och märkningsprotokollet som beskrivs nedan kan tillämpas på vilken klinisk och icke-klinisk antikropp som helst om tung- och lätta kedjesekvenser finns tillgängliga.
Protocol
Representative Results
Discussion
Selektiv och tumörvävnad specifik leverans av anti-cancer terapeutiska agent är nyckeln till att mäta effekt och säkerhet av en viss riktad terapi13. Här har vi beskrivit ett snabbt och effektivt tillvägagångssätt för att undersöka den detaljerade vävnads- och tumörfördelningen av klinisk, farletuzumab och en nonklinisk BaCa-antikropp. Det beskrivna tillvägagångssättet är tillämpligt på någon nygenererad antikropp och kan användas tillsammans med en kliniskt effektiv antikrop…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi är tacksamma för University of Virginia Cancer Center Core Imaging Facility, Biomolecular Analysis Facility, Advanced Microscopy Facility och Core Vivarium Facility for Assistance. J. T-S är en tidig karriär utredare av äggstockscancer Academy (OCA-DoD). Detta arbete stöddes av NCI / NIH bidrag (R01CA233752) till J. T-S, US DoD Breast Cancer Research Program (BCRP) genombrott nivå-1 tilldelning till J. T-S (BC17097) och US DoD Äggstockscancer Research Program (OCRP) finansiering tilldelning (OC180412) till J. T-S
Materials
| FreeStyle CHO media | Gibco Life Technologies | Cat # 12651-014 | |
| Anti-Anti (100X) | Gibco Life Technologies | Cat # 15240-062 | |
| Anti-Clumping Agent | Gibco Life Technologies | Cat # 01-0057DG | |
| BD Insulin Syringe | BD BioSciences | Cat #329420 | |
| Caliper IVIS Spectrum | PerkinElmer | Cat #124262 | |
| CHO CD EfficientFeed B | Gibco Life Technologies | Cat #A10240-01 | |
| Corning 500 mL DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) | Corning | Cat # 10-13-CV | |
| Corning 500 mL RPMI 1640 | Corning | Cat # 10-040-CV | |
| Cy5 conjugated Anti-Human IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | Cat # 709-175-149 | |
| GlutaMax-I (100X) | Gibco Life Technologies | Cat # 35050-061 | |
| HiPure Plasmid Maxiprep kit | Invitrogen | Cat # K21007 | |
| HiTrap MabSelect SuRe Column | GE Healthcare | Cat # 11-0034-93 | |
| Infusion | Takara BioScience | STO344 | |
| IRDye 800CW NHS Ester | LI-COR | Cat # 929-70020 | |
| Isoflurane, USP | Covetrus | Cat # 11695-6777-2 | |
| Lubricant Eye Ointment | Refresh Lacri-Lube | Cat #4089 | |
| Matrigel | Corning | Cat # 354234 | |
| PEI transfection reagent | Thermo Fisher | Cat # BMS1003A | |
| Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes | Thermo Scientific | Cat # 66333 | |
| Steritop Vacuum Filters | Millipore Express | Cat #S2GPT02RE | |
| Trypsin-EDTA | Gibco Life Technologies | Cat # 15400-054 | |
| Experimental Models: Cell lines | |||
| Human: OVCAR-3 | American Type Culture Collection | ATCC HTB-161 | |
| Human: CHO-K cells | Stable transformed in our lab | ATCC CCL-61 | |
| Mouse: 4T1 | Kind gift from Dr. Chip Landen, UVA | ||
| Mouse: MC38 | Kind gift from Dr. Suzanne Ostrand-Rosenberg, UMBC | Authenticated by STR profiling | |
| Mouse: MC38 hFOLR1 | Generated in our laboratory (This paper) | ||
| Experimental Models: Animal | |||
| Mice: athymic Nude Foxn1nu/Foxn1+ | Envigo | Multiple Orders | |
| Mice: NOD.Cg Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ | Jackson Laboratory | Multiple Orders |
References
- Takahashi, K. Muromonab CD3 (Orthoclone OKT3). Journal of Toxicological Sciences. 20, 483-484 (1995).
- Tushir-Singh, J. Antibody-siRNA conjugates: drugging the undruggable for anti-leukemic therapy. Expert Opinion in Biological Therapy. 17, 325-338 (2017).
- Gravitz, L. Cancer immunotherapy. Nature. 504, 1 (2013).
- Pagel, J. M., West, H. J. Chimeric Antigen Receptor (CAR) T-Cell Therapy. JAMA Oncology. 3, 1595 (2017).
- Brinkmann, U., Kontermann, R. E. The making of bispecific antibodies. MAbs. 9, 182-212 (2017).
- Runcie, K., Budman, D. R., John, V., Seetharamu, N. Bi-specific and tri-specific antibodies- the next big thing in solid tumor therapeutics. Molecular Medicine. 24, 50 (2018).
- Shivange, G., et al. A Single-Agent Dual-Specificity Targeting of FOLR1 and DR5 as an Effective Strategy for Ovarian Cancer. Cancer Cell. 34, 331-345 (2018).
- Wajant, H. Molecular Mode of Action of TRAIL Receptor Agonists-Common Principles and Their Translational Exploitation. Cancers (Basel). 11 (7), 954 (2019).
- Necela, B. M., et al. Folate receptor-alpha (FOLR1) expression and function in triple negative tumors. PLoS One. 10, 0122209 (2015).
- Lin, J., et al. The antitumor activity of the human FOLR1-specific monoclonal antibody, farletuzumab, in an ovarian cancer mouse model is mediated by antibody-dependent cellular cytotoxicity. Cancer Biology Therapy. 14, 1032-1038 (2013).
- Chen, Y., Kim, M. T., Zheng, L., Deperalta, G., Jacobson, F. Structural Characterization of Cross-Linked Species in Trastuzumab Emtansine (Kadcyla). Bioconjugate Chemistry. 27, 2037-2047 (2016).
- Bauerschlag, D. O., et al. Anti-idiotypic antibody abagovomab in advanced ovarian cancer. Future Oncology. 4, 769-773 (2008).
- Narita, Y., Muro, K. Challenges in molecular targeted therapy for gastric cancer: considerations for efficacy and safety. Expert Opinion in Drug Safety. 16, 319-327 (2017).
- Jordan, N. V., et al. HER2 expression identifies dynamic functional states within circulating breast cancer cells. Nature. 537, 102-106 (2016).
- Fakih, M., Vincent, M. Adverse events associated with anti-EGFR therapies for the treatment of metastatic colorectal cancer. Current Oncology. 17, 18-30 (2010).
- Koba, W., Jelicks, L. A., Fine, E. J. MicroPET/SPECT/CT imaging of small animal models of disease. American Journal of Pathology. 182, 319-324 (2013).
- van der Wall, E. E. Cost analysis favours SPECT over PET and CTA for evaluation of coronary artery disease: the SPARC study. Netherland Heart Journal. 22, 257-258 (2014).
- Van Dort, M. E., Rehemtulla, A., Ross, B. D. PET and SPECT Imaging of Tumor Biology: New Approaches towards Oncology Drug Discovery and Development. Current Computer Aided Drug Design. 4, 46-53 (2008).
- Dua, P., Hawkins, E., van der Graaf, P. H. A Tutorial on Target-Mediated Drug Disposition (TMDD) Models. CPT Pharmacometrics and System Pharmacology. 4, 324-337 (2015).
