Oprettelse af kemisk induceret protein denne systemer med ønsket affinitet og specificitet for en given lille molekyle ligand ville have mange biologiske sensing og aktuering applikationer. Her beskriver vi en effektiv, generaliserbar metode til de Novo engineering af kemisk inducerede denne systemer via det trinvise valg af et Phage-vist kombinatorisk enkelt domæne antistof bibliotek.
Protein denne begivenheder, der kun forekommer i nærværelse af en lille molekyle ligand muliggøre udviklingen af små-molekyle biosensorer til dissektion og manipulation af biologiske veje. I øjeblikket er kun et begrænset antal kemisk induceret denne (CID) systemer findes og ingeniør nye med den ønskede følsomhed og selektivitet for specifikke små-molekyle ligander fortsat en udfordring inden for protein teknik. Vi her beskrive en høj gennemstrømning screeningmetode, combinatoriske binders-enabled svalg af CID (kombinerer-CID), for de Novo engineering af CID-systemer, der gælder for et stort udvalg af ligands. Denne metode bruger to-trins udvælgelse af en Phage-viste kombinatoriske nanobody bibliotek for at opnå 1) “anker bindemidler”, der først binder sig til en ligand af interesse og derefter 2) “dimerization bindere”, der kun binder sig til anker bindemiddel-ligand komplekser. For at vælge anker bindere screenes et kombinatorisk bibliotek med mere end 109 komplementære NANOKROPPE (CdR)-randomiserede nanopartikler med et biotinyleret ligand, og hits valideres med den ikke-mærkede ligand med bio-Layer INTERFEROMETRI (bli). For at opnå denne bindere, er nanobody Library screenet med anker binder-ligand komplekser som mål for positiv screening og ubundne anker bindere for negativ screening. KOMBINERER-CID er bredt anvendelig til udvalgte CID bindere med andre immunglobulin, ikke-immunglobulin, eller beregningsmæssigt designede stilladser til at skabe biosensorer til in vitro og in vivo påvisning af narkotika, metabolitter, signalering molekyler, etc.
CID systemer, hvor to proteiner kun dimerisere i nærværelse af et lille molekyle ligand (figur 1), tilbyder alsidige værktøjer til dissekere og manipulere metaboliske, signalering, og andre biologiske veje1. De har demonstreret potentialet i biologisk aktivering, såsom Drug-kontrollerede t-celle Activation2 og apoptose3,4, for at forbedre sikkerheden og effekten af adoptivt celleterapi. Derudover, de giver en ny metode til in vivo eller in vitro påvisning af små-molekyle mål. For eksempel kan CID proteiner være genetisk smeltet sammen med fluorescens reporter-systemer (f. eks. fluorescens resonans energioverførsel (FRET)5 og cirkulært permuterede fluorescerende proteiner)6 for Real-Time in vivo målinger eller fungere som affinitets reagenser til sandwich enzym-forbundet immunosorbent assay (ELISA)-lignende assays.
På trods af deres brede applikationer, skabe nye CID-systemer, der kan styres af en given lille molekyle ligand har store udfordringer. Etablerede protein binder teknik metoder, herunder dyre immunisering7, in vitro udvælgelse8,9, og Computational protein design10 kan generere ligand bindende proteiner, der fungerer via binære protein-ligand interaktioner. Men, disse metoder har svært ved at skabe en ligand-induceret ternære CID kompleks. Nogle metoder skabe CID ved kemisk forbinder to ligander, der selvstændigt binder sig til de samme eller forskellige proteiner11,12,13,14,15,16 eller stole på at vælge bindemiddel proteiner såsom antistoffer rettet mod præ eksisterende lille molekyle-protein komplekser17,18, og dermed har et begrænset valg af ligander.
Vi har for nylig udviklet en combinatoriske binders-eNABLED svalg af CID (kombinerer-CID) metode til de Novo engineering af CID Systems19. Denne metode kan opnå den høje specificitet af ligand-induceret denne (f. eks. en anker-denne bindemiddel dissociation konstant, Kd (uden ligand)/Kd (med ligand) > 1.000). Den denne specificitet opnås ved hjælp af anker bindemidler med fleksible bindingssteder, der kan indføre konformationelle ændringer på ligand binding, hvilket giver et grundlag for udvælgelsen af konformationelt selektive bindemidler kun anerkender ligand-bundne anker bindemidler. Vi demonstrerede et proof-of-princip ved at skabe cannabidiol (CBD)-inducerede Heterodimere af nanokroppe, et 12 – 15 kDa funktionelt antistof fragment fra brug bestående af et universelt stillads og tre fleksible CdR loops (figur 2)20, som kan danne en bindende lomme med tilpasningsdygtige størrelser til små molekyle epitoper21,22 Især bør in vitro-udvælgelsen af et kombinatorisk protein bibliotek være omkostningseffektiv og generaliserbar for CID-teknik, fordi det samme højkvalitets bibliotek kan anvendes til forskellige ligands.
I denne protokol og video fokuserer vi på at beskrive to-trins in vitro udvælgelse og validering af anker (figur 3A) og denne bindere (figur 3B) ved at screene det kombinatoriske nanobody bibliotek med en mangfoldighed højere end 109 ved hjælp af CBD som et mål, men protokollen bør gælde for andre protein biblioteker eller små-molekyle mål. Screeningen af CID bindere tager normalt 6 – 10 uger (figur 4).
Det er afgørende at vælge de korrekte koncentrationer af input fagtypning biblioteker til forskellige runder af biopanning. Vi startede typisk fra et input bibliotek af ~ 1012-1013 fagtypning partikler med en mangfoldighed > 109, så ~ 100-1000 eksemplarer af hver fagtypning klon, der skal præsenteres i pull-down assay. Hvis fagtypning koncentrationen i en bindende analyse er for høj eller lav, vil sandsynligheden for ikke-specifik binding eller tab af positive kloner stige. Det anker…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af University of Washington Innovation Award (til L.G.), et tilskud fra de amerikanske National Institutes of Health (1R35GM128918 til L.G.), og en Startup fond af University of Washington (til L.G.). H.J. blev støttet af en Washington Research Foundation bachelor Fellowship. K.W. blev støttet af et bachelor stipendium fra University of Washington Institute for protein design.
1-Step Ultra TMB ELISA substrate solution | Thermo Fisher Scientific | 34029 | |
Agar | Thermo Fisher Scientific | BP1423-2 | |
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter unit (3 kDa cutoff) | Millipore | UFC900324 | |
Ampicillin | Thermo Fisher Scientific | BP1760-25 | |
Bio-Rad Protein Assay Kit II | Bio-Rad | 5000002 | |
BirA biotin-protein ligase standard reaction kit | Avidity | BirA500 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153-50G | |
Casein | Sigma-Aldrich | C7078-1KG | |
CM13 Helper phage | Antibody Design Labs | PH020L | |
D-(+)-Glucose monohydrate | Alfa Aesar | A11090 | |
Dynabeads M-280 Streptavidin | Thermo Fisher Scientific | 11205D | |
DynaMag-2 Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
EDTA | Thermo Fisher Scientific | BP120-1 | |
Fast DNA Ladder | New England Biolabs | N3238S | |
FastDigest BglI | Thermo Fisher Scientific | FD0074 | |
Glycerol | Thermo Fisher Scientific | BP229-1 | |
HiLoad 16/600 Superdex 200 pg | GE Healthcare | 28989335 | |
HiPrep 26/10 Desalting Column | GE Healthcare | 17508701 | |
HisTrap-FF-1ml | GE Healthcare | 11000458 | |
Imidazole | Alfa Aesar | 161-0718 | |
IPTG | Thermo Fisher Scientific | 34060 | |
Kanamycin | Thermo Fisher Scientific | BP906-5 | |
M13 Major Coat Protein Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-53004 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S3014-500G | |
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
Nunc 96-Well Polypropylene DeepWell Storage Plates | Thermo Fisher Scientific | 260251 | |
Nunc MaxiSorp | Thermo Fisher Scientific | 44-2404-21 | |
Octet RED96 | ForteBio | N/A | |
pADL-23c Phagemid Vector | Antibody Design Labs | PD0111 | |
PEG-6000 | Sigma-Aldrich | 81260-1KG | |
Platinum SuperFi DNA Polymerase | Invitrogen | 12351010 | |
PureLink PCR Purification Kit | Thermo Fisher Scientific | K310001 | |
QIAprep Spin M13 Kit | Qiagen | 27704 | |
Recovery Medium | Lucigen | 80026-1 | |
SpectraMax Plus 384 | Molecular Devices | N/A | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389-1KG | |
Super Streptavidin (SSA) Biosensors | ForteBio | 18-5057 | |
Superdex 75 increase 10/300 GL Column | GE Healthcare | 28-9909-44 | |
T4 DNA Ligase | Thermo Fisher Scientific | 15224-025 | |
TG1 Electrocompetent Cells | Lucigen | 60502-1 | |
Triethylamine | Sigma-Aldrich | 471283-100mL | |
Trizma Base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
Tryptone | Thermo Fisher Scientific | BP9726-5 | |
Tween 20 | Thermo Fisher Scientific | BP337-500 | |
Yeast Extract | Thermo Fisher Scientific | BP1422-2 | |
Zeba Spin Desalting Column | Thermo Fisher Scientific | 89882 |