Summary
Het creëren van chemisch geïnduceerde eiwit door dimerisatie systemen met de gewenste affiniteit en specificiteit voor een bepaalde kleine molecule ligand zou veel biologische sensing en bediening toepassingen. Hier beschrijven we een efficiënte, generaliseerbare methode voor de Novo engineering van chemisch geïnduceerde door dimerisatie systemen via de stapsgewijze selectie van een Phage-weergegeven combinatorische single-Domain antilichamen bibliotheek.
Abstract
Eiwit door dimerisatie gebeurtenissen die alleen optreden in de aanwezigheid van een kleine molecule ligand maken de ontwikkeling van kleine-molecuul biosensoren voor de dissectie en manipulatie van biologische trajecten. Momenteel bestaat er slechts een beperkt aantal chemisch geïnduceerde door dimerisatie (CID)-systemen en worden nieuwe technieken met de gewenste gevoeligheid en selectiviteit voor specifieke kleine molecuul liganden een uitdaging op het gebied van proteïne-engineering. Hier beschrijven we een hoge doorvoer screeningsmethode, combinatorial binders-eingeschakeld sverkiezing van Cid (combineert-CID), voor de de Novo engineering van CID systemen toepasbaar op een grote verscheidenheid van liganden. Deze methode maakt gebruik van de tweestapsselectie van een Phage-weergegeven combinatoriale nanobody-bibliotheek om 1) "anker Binders" te verkrijgen die eerst binden aan een ligand van belang en vervolgens 2) "dimerization bindmiddelen" die alleen binden aan anker Binder-ligand complexen. Om anker binders te selecteren, wordt een combinatorische bibliotheek van meer dan 109 -gerandomiseerde nanolichamen gescreend met een biotinyleerd ligand en worden hits gevalideerd met de niet-gelabelde ligand door bio-Layer interferometrie (bli). Om bindmiddelen te verkrijgen, wordt de nanobody-bibliotheek gescreend met anker Binder-ligand-complexen als doelen voor positieve screening en de niet-afhankelijke anker Binders voor negatieve screening. COMBINEERT-CID is algemeen toepasbaar om CID binders te selecteren met andere immunoglobulin, niet-immunoglobulin, of computationeel ontworpen steigers om biosensoren te creëren voor in vitro en in vivo detectie van geneesmiddelen, metabolieten, signaal moleculen, enz.
Introduction
CID-systemen, waarin twee eiwitten alleen in de aanwezigheid van een klein-molecuul ligand (Figuur 1) dimeriseren, bieden veelzijdige gereedschappen voor het ontleden en manipuleren van metabole, signalering en andere biologische trajecten1. Ze hebben aangetoond dat het potentieel in biologische werking, zoals drug gecontroleerde t-cel activering2 en apoptosis3,4, voor het verbeteren van de veiligheid en werkzaamheid van adoptie t-cel therapie. Daarnaast bieden ze een nieuwe methodologie voor in vivo of in vitro detectie van kleine molecuul doelen. Zo kunnen Cid-eiwitten genetisch worden gefuseerd met fluorescentie reporter systemen (bijv. fluorescentie resonantie energie overdracht (fret)5 en circulair pergedempt fluorescerende eiwitten)6 voor real-time in vivo metingen, of dienen als affiniteits reagentia voor sandwich-enzym-linked immunosorbent assay (Elisa)-achtige assays.
Ondanks hun brede toepassingen, het creëren van nieuwe CID systemen die kunnen worden bestuurd door een bepaalde kleine-molecuul ligand heeft grote uitdagingen. Gevestigde eiwit Binder engineering methoden, waaronder de dierlijke immunisatie7, in vitro selectie8,9, en computationele eiwit ontwerp10 kunnen ligand bindende eiwitten die functioneren via binaire eiwit-ligand interacties te genereren. Echter, deze methoden hebben problemen met het creëren van een ligand-geïnduceerde ternaire Cid complex. Sommige methoden maken de Cid door het chemisch koppelen van twee liganden die onafhankelijk binden aan dezelfde of verschillende eiwitten11,12,13,14,15,16 of afhankelijk zijn van het selecteren van bindmiddel eiwitten zoals antilichamen gericht op bestaande kleine molecuul-eiwitcomplexen17,18, en hebben dus een beperkte keuze aan liganden.
Onlangs ontwikkelden we een combinatorial binders-eingeschakeld sverkiezing van de Cid (combineert-CID) methode voor de Novo engineering van CID Systems19. Deze methode kan de hoge specificiteit van ligand-geïnduceerde door dimerisatie verkrijgen (bijv. een anker-door dimerisatie Binder dissociatieconstante, kd (zonder ligand)/kd (met ligand) > 1.000). De door dimerisatie specificiteit wordt bereikt met behulp van anker Binders met flexibele bindingsplaatsen die conformationele veranderingen kunnen introduceren op ligand binding, die een basis bieden voor de selectie van conformationaal selectieve bindmiddelen die alleen ligand-gebonden anker binders herkennen. We toonden een proof-of-principe door het creëren van Cannabidiol (CBD)-geïnduceerde heterodimers van nanolichamen, een 12 – 15 kDa functionele antilichaam fragment van camelid bestaande uit een universele steiger en drie flexibele CDR loops (Figuur 2)20, die een bindende zak kan vormen met aanpasbare maten voor kleine-molecuul epitopen21,22. Met name de in vitro selectie van een combinatorische proteïne-bibliotheek moet kostenbesparend en generaliseerbaar zijn voor CID engineering omdat dezelfde hoogwaardige bibliotheek kan worden toegepast op verschillende liganden.
In dit protocol en deze video richten we ons op het beschrijven van de twee-stap in vitro selectie en validatie van anker (Figuur 3A) en door dimerisatie bindmiddelen (Figuur 3B) door de combinatoriale nanobody Library te screenen met een diversiteit hoger dan 109 met CBD als doel, maar het protocol moet toepasbaar zijn op andere eiwit bibliotheken of kleine molecuul doelen. De screening van CID binders duurt meestal 6 – 10 weken (Figuur 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. bibliotheek constructie
- Gebruik een synthetische combinatorische bibliotheek met één domein antilichamen met een diversiteit van ~ 1,23 – 7.14 x 109, zoals eerder beschreven19. Hoewel dit protocol geen bibliotheek constructie bevat, kan het worden toegepast op andere combinatorische Binder bibliotheken.
2. biotinylatie van ligand target of ligand
- Biotinylaat de geselecteerde ligand, bijvoorbeeld, CBD en tetrahydrocannabinol (THC)19, via verschillende chemische synthese strategieën, afhankelijk van de geschikte biotinylatie plaatsen van een doelwit.
3. anker Binder screenen
- Begin van selectie
- Begin elke selectieronde door het inoculeren van een enkele TG1-celkolonie, vers gekweekt in 6 mL 2YT bij 37 °C en 250 omwentelingen per minuut (rpm) tot een 600 nm (OD600) absorptie van ~ 0,5. Inincuberen van de cellen op ijs voor het gebruik in stap 3.5.1.
- Negatieve selectie met met biotine gebonden streptavidine kralen
- Bereid de "negatieve selectie kralen" door 300 μL streptavidin-gecoate magnetische parels te wassen met behulp van een magnetisch scheidings rek, 3x met 0,05% fosfaat-gebufferde zoutoplossing met tween-buffer (PBST, 1 x PBS met 0,05% vol/vol-tween 20%) en 2x met 1 x PBS.
- Respendeer de parels met 1 mL 1% caseïne in 1 x PBS (pH = 7,4) en verzadigde de kralen door 5x de gerapporteerde binding capaciteit met behulp van Biotinetoe te voegen. Incuberen bij kamertemperatuur (RT) op een rotator gedurende 1 uur.
- Was de kralen 5x met 0,05% PBST en 3x met 1 x PBS, voor een totaal van acht washes.
- Voeg ~ 1013 faag deeltjes toe in 1% caseïne/1% BSA in 1 x PBS (pH = 7,4) en incuberen bij RT op een rotator gedurende 1 uur.
- Na incubatie, verzamel de supernatant te gebruiken in stap 3.3.6.
- Positieve selectie met biotinyleerd ligand-gebonden streptavidine kralen
- Bereid de "positieve selectie kralen" met behulp van 1/2 het volume van de kralen gebruikt voor de "negatieve selectie kralen" na stappen 3.2.1.
- Resuspendeer de parels met 1 ml 1% caseïne in 1 × PBS, pH 7,4 en verzadigde de kralen door 5x de volledige bindingscapaciteit toe te voegen, berekend op basis van de handleiding met behulp van de biotinyleerd ligand van keuze. Incuberen bij RT op een rotator gedurende 1 uur.
- Was de kralen 5x met 0,05% PBST en 3x met 1 x PBS, voor een totaal van acht washes.
- Blokkeer de parels met 1 mL 1% caseïne/1% BSA in 1 x PBS (pH = 7,4) en incuberen bij RT op een rotator gedurende 1 uur om niet-specifieke binding tussen de Fagen en de streptavidine gecoate magnetische kralen te voorkomen.
- Was de streptavidin gecoate magnetische kralen 3x met behulp van 0,05% PBST en een keer met behulp van 1 x PBS, voor een totaal van vier washes.
- Regeert de met streptavidine gecoate magnetische parels met behulp van de niet-afhankelijke Fagen uit stap 3.2.5 en incuberen bij RT op een rotator gedurende 1 uur.
- Pak het supernatant uit zonder de magnetische kralen te storen. De niet-afhankelijke phages opslaan als invoer, te gebruiken in stap 3.5.1.
- Was de kralen 10x met behulp van 0,05% PBST en 5x met 1 x PBS. Tussen elke drie wast overbrengen ze naar een nieuwe buis om Fagen niet specifiek gebonden aan de buiswanden te voorkomen.
- Elutie van phage-getoonde nanolichamen
- Op een concurrerende manier de Fagen binden door toevoeging van 450 μL van de niet-biotinylated ligand, met behulp van een concentratie in het micromolaire bereik (bijv. 10 – 50 μM) en gedurende 30 minuten bij RT op een rotator incureren. De geselecteerde ligand concentratie voor het competitieve elutie van gebonden Fagen is afhankelijk van de gewenste KD van de "anker Binder". Ligand concentraties kunnen relatief hoog zijn in eerste selectie rondes en vervolgens afnemen in latere rondes.
- Vang de supernatant op en sla de elkende Fagen op als output, te gebruiken in stap 3.5.2.
- Input/output titraties en infectie
- Voor invoer titratie, bereid 10x seriële verdunningen in 1 x PBS tot 109-voudige met de ingang faag van stap 3.3.7. Gebruik de seriële verdunningen van 107– 109 om infecties te doen door het overbrengen van 10 μL-ingangs faag van elke verdunning naar 70 ΜL TG1 cellen (OD600 van ~ 0,5). Inbroed bij 37 °C gedurende 45 min, plaat de geïnfecteerde TG1 cellen op 3 90 mm 2YT-agar gerechten die 100 μg/mL ampicilyl en 2% (WT/vol) glucose bevatten, en incuberen 's nachts bij 37 °C. Vanaf de nachtelijke platen kan de faag-ingang als volgt worden berekend:
- Voor de uitvoer infectie en titratie, breng de eluteerde Fagen van stap 3.4.2 over naar 3 mL TG1 cellen (OD600 van ~ 0,5). Inincuberen in een waterbad van 37 °C gedurende 45 min. Bereid vervolgens 10x seriële verdunningen in 2YT tot 103-voudig, plaat elke verdunning op 90 mm 2yt-agar gerechten en inincuberen 's nachts bij 37 °c. Vanaf de nacht platen kan de faag-uitgang als volgt worden berekend:
- Verdeel de overgebleven geïnfecteerde TG1 cellen op 3 150 mm 2YT-agar platen met 100 μg/mL ampicilinyl en 2% (WT/vol) glucose. Incuberen de platen 's nachts bij 37 °C.
- Voor invoer titratie, bereid 10x seriële verdunningen in 1 x PBS tot 109-voudige met de ingang faag van stap 3.3.7. Gebruik de seriële verdunningen van 107– 109 om infecties te doen door het overbrengen van 10 μL-ingangs faag van elke verdunning naar 70 ΜL TG1 cellen (OD600 van ~ 0,5). Inbroed bij 37 °C gedurende 45 min, plaat de geïnfecteerde TG1 cellen op 3 90 mm 2YT-agar gerechten die 100 μg/mL ampicilyl en 2% (WT/vol) glucose bevatten, en incuberen 's nachts bij 37 °C. Vanaf de nachtelijke platen kan de faag-ingang als volgt worden berekend:
- Bibliotheek versterking en herstel voor verdere selectie rondes
- Voeg 3 mL 2YT per plaat toe, schrael met een steriele celscraper en verzamel alle cellen in een conische buis van 50 mL. Meng de verzamelde cellen met steriele glycerol (20% WT/vol eindconcentratie). Meet de OD600 van het mengsel en maak 3 – 5 voorraad aliquots. Bewaren bij-80 °C voor lange termijn opslag.
- Voor Faag-redding, Verdun het phagemid-bevattende TG1 bacteriële mengsel met behulp van 25 ml 2yt-media aangevuld met 2% glucose en 100 μg/ml ampicillaire tot een od600 van ~ 0,1. Kweekcellen bij 37 °C en 250 rpm tot een OD600 van ~ 0,5.
- Superinfect de cellen door CM13 helper faag toe te voegen bij 5 x 109 Pfu/ml en te incueren bij 37 °c en 250 rpm voor 45 min. De CM13 helper faag biedt vereiste faag Coat eiwitten voor de assemblage van complete faag partikels.
- Centrifugeer de kweek bij 8.000 x g gedurende 10 minuten om de glucose te verwijderen. Respendeer de cellen met 50 mL 2YT media aangevuld met 100 μg/mL ampicilinine en 50 μg/mL kanamycine en incuberen bij 25 °C en 250 rpm 's nachts.
- Centrifugeer de cellen van de nachtelijke kweek bij 9.000 x g, 4 °c gedurende 30 min. Breng supernatant over naar een nieuwe buis en neerslag Fagen in de supernatant met behulp van 1/5 volume Peg/NaCl oplossing (20% WT/vol polyethyleenglycol-6.000 en 2,5 M NaCl). Meng zachtjes en plaats het op ijs voor 1 uur.
- Verzamel faag deeltjes door centrifugeren met 12.000 x g bij 4 °c gedurende 30 min. regeer de pellets met 1 ml 1 x PBS en breng de suspensie over naar een micro centrifugebuis. Centrifugeer de buis bij 20.000 x g en 4 °c gedurende 10 minuten om rest bacteriën te verwijderen.
- Breng de supernatant over naar een nieuwe microcentrifuge buis zonder de bacteriële pellet te verstoren. Gebruik een 1:100 verdunning om de absorptie bij 269 nm en 320 nm te meten. Het totale aantal Fagen kan worden berekend met behulp van de volgende formule23:
- Store faag Library bij 4 °c voor kortstondig gebruik of met 25% glycerol bij-80 °c voor lange termijn opslag.
- Herhaal selectie rondes (stappen 3.1 – 3.6) voor 3 – 6 rondes of totdat de gewenste verrijking wordt waargenomen (Zie de resultaten sectie). Plaat en pick enkelvoudige klonen (deel 4) om hun affiniteit en specificiteit aan de ligand te karakteriseren (paragrafen 5 – 7).
4. enkelvoudige kloon isolatie
- Om individuele klonen uit een verrijkte subbibliotheek te isoleren, bereid u 10x seriële verdunningen van de Phage-geïnfecteerde TG1 cellen (stap 3.5.2). Plaat seriële verdunningen op 90 mm 2YT-agar schaaltjes met 100 μg/mL ampicilyl en 2% (WT/vol) glucose en incuberen bij 37 °C 's nachts.
- Van de nachtelijke platen, pick enkele kolonies in 250 μL van 2YT media aangevuld met 100 μg/mL ampicillaire per goed in steriele diep-goed platen en groeien bij 37 °C 's nachts.
- Uit de nachtelijke culturen, inoculeren 10 μL in 500 μL van verse 2YT media aangevuld met 100 μg/mL ampicillaire.
- Kweekcellen tot een od600 van ~ 0,5, voeg CM13 helper faag toe bij 5 x 109 Pfu/ml en incuberen bij 37 °c en 250 rpm voor 45 min.
- Voeg 500 μL van 2YT media toe, aangevuld met 100 μg/mL ampicilinine en 50 μg/mL kanamycin. Incuberen bij 25 °C en 250 rpm 's nachts.
- Centrifugeer de diepliggende platen van de nachtelijke culturen bij 3.000 x g gedurende 10 min. Verzamel de supernatant met de faag deeltjes zonder de celpellet te verstoren.
- Phage deeltjes kunnen worden gebruikt voor ELISA om de specificiteit van de geselecteerde klonen aan de ligand te bepalen. Biotine of een structureel homo van het doelwit kan worden gebruikt als een negatieve controle.
5. anker Binder valideren door ELISA
- Jas 96 goed ELISA-platen met 100 μL van 5 μg/mL streptavidine in de coating buffer (100 mM carbonaat buffer, pH = 8,6) bij 4 °C 's nachts.
- Was de ELISA-platen 3x met 0,05% PBST en voeg 100 μL van 1 μM biotinyated target toe aan de doel putjes. Voeg 100 μL van 1 μM biotine of doel homo toe aan de controle putten. Incuberen bij RT gedurende 1 uur.
- Was de platen 5x met 0,05% PBST en Blokkeer een niet-specifieke binding door 300 μL van 1% caseïne toe te voegen in 1 x PBS. Incuberen bij RT gedurende 1 uur.
- Was de Elisa-platen 3x met 0,05%-PBST en voeg de gezuiverde faag supernatant toe. Incuberen gedurende 1 uur bij RT.
- Was de ELISA-platen 10x met 0,05% PBST en voeg 100 μL mierikswortelperoxidase (HRP)-M13 Major Coat proteïne antilichaam (1:10000 verdunning met 1 x PBS met 1% caseïne). Incuberen bij RT gedurende 1 uur.
- Was de ELISA-platen 3x met 0,05% PBST en voeg 100 μL Tetramethylbenzidine (TMB) substraat toe. Inincuberen gedurende 10 min of totdat een zichtbare kleurverandering wordt waargenomen. Stop de reactie door toevoeging van 100 μL van 1 M HCl. Lees de plaat bij 450 nm op een spectrofotometer.
- Voor eiwit expressie en zuivering, kies de klonen met een hoge affiniteit en specificiteit voor het doel (zie discussie).
6. eiwit expressie, zuivering en biotinylatie
- Zoals eerder gemeld19, subkloon geselecteerd klonen uit sectie 5 en Express als C-Terminal avi-Tagged en zijn-Tagged nanolichamen.
- Express geselecteerde nanolichamen in het periplasme van E. coli WK6 cellen (meestal in 1 L cultuur), vrijkomen door osmotische shock, en zuiveren met behulp van een nikkel-NTA kolom (Zie tabel van de materialen).
- Wissel buffer met een ontdesalting kolom (1 x PBS met 5% glycerol; Zie tabel met materialen).
- Biotinylaat nanolichamen met behulp van een commerciële Kit (Zie tabel met materialen) voor verder gebruik.
7. anker Binder karakteriseren door BLI
- Analyseer de bindingsaffiniteit en kinetiek van geselecteerde anker binders door het immobiliseren van 200 nm biotinyleerd anker Binders op streptavidine biosensoren (Zie tabel met materialen) met bindende assay buffer (1 x PBS (pH = 7,4), 0,05% Tween 20, 0,2% BSA, 3% methanol).
- Bereken dissociatieconstanten (KD) van anker Binder-ligand interacties door steady-state analyse met behulp van data analysis software (Zie tabel van materialen). Verkregen KD -waarden variëren meestal van enkelvoudige tot dubbelcijferige micromolar.
8. dimerization Binder screening
Opmerking: de biopanning screening van "dimerization bindmiddelen" is vergelijkbaar met die van anker binders, met uitzondering van twee kritische stappen: 1) dimerization binders worden geselecteerd met behulp van een geselecteerde biotinyleerd anker Binder en de anker Binder-ligand complex voor de negatieve en positieve selecties, respectievelijk. 2) tijdens de elutie stap wordt 100 mM triethylamine gebruikt om positief geselecteerde Fagen te elueren die alleen waren gebonden aan het anker bindmiddel--ligand target complex. De 100 mM trimethylamine oplossing (pH = 11,5) wordt gebruikt om positieve klonen te elzen door de eiwit interacties te verstoren.
- Begin van selectie
- Begin elke selectieronde door het inoculeren van een enkele TG1 celkolonie, vers geteeld op een minimale media, in 6 mL 2YT bij 37 °C en 250 rpm tot een OD600 van ~ 0,5. Inincuberen van cellen op ijs.
- Verwijdering van negatief geselecteerde nanolichamen
- Bereid de "aftrekken buis" met behulp van 400 μL streptavidine gecoate magnetische kralen en volg stap 3,2. Echter, in plaats van verzachtend met biotine, voeg 5x de berekende volledige bindingscapaciteit toe met behulp van de geselecteerde biotinyleerd Anchor Binder en sla de niet-afhankelijke Fagen op die moeten worden gebruikt in stap 8.3.3.
- Selectie van positief geselecteerde nanolichamen
- Bereid de "Capture Tube" met behulp van 1/2 het volume van streptavidine gecoate magnetische kralen gebruikt voor de "aftrekken buis" en de volgende stappen 3.3.2 tot 3.3.3. Echter, in plaats van verzachtend met de biotinyleerd ligand, voegt u vijf maal de berekende volledige bindingscapaciteit toe met behulp van de geselecteerde biotinyleerd Anchor Binder.
- Om het anker Binder-ligand complex te vormen voor de positieve door dimerisatie Binder-selectie, voegt u een hoog genoeg concentratie van niet-biotinylated ligandtoe. Hierdoor kan de meeste streptavidin-gebonden anker binder het ligand-gebonden complex vormen.
- Volg de stappen 3.3.3 tot en met 3.3.8, met behulp van de niet-afhankelijke Fagen uit de "aftrekken buis".
- Elutie van positief geselecteerde nanolichamen
- Elzen de Fagen gebonden aan het anker Binder-ligand complex door toevoeging van 450 μL van 100 mM Triethylamine, en incuberen bij RT op een rotator gedurende 10 minuten.
- Verzamel de in concurrentie opge Fagen en volg de stappen 3.4.1 tot en met 3.4.2.
- Verdere rondes van door dimerisatie Binder selectie
- Volg de stappen 3,5 en 3,6 om de bibliotheek te versterken en terug te zetten om nog meer selectie rondes uit te voeren. Herhaal rondes van selectie voor 3 – 6 rondes of totdat de gewenste verrijking wordt waargenomen. Plaat en pick enkelvoudige klonen (zie punt 4) om hun affiniteit en specificiteit te karakteriseren voor het doelwit.
9. dimerization Binder karakterisering door ELISA
- Volg de stappen in sectie 4 om individuele klonen voor karakterisering via ELISA te isoleren.
- Voor het testen van de affiniteit van door dimerisatie Binder-bindmiddel naar de anker Binder-ligand complex, de Elisa-doelplaat met 100 μL van 100 nm biotinyleerd anker Binder. Na incubatie gedurende 1 uur, voeg 1 μM van het ligand-doel toe om het anker Binder-ligand complex te vormen.
- De bedieningsplaat moet worden gecoat met behulp van de biotinyleerd Anchor Binder alleen om klonen die ook kunnen binden aan de vrije anker Binder uit te schermen. Voeg 100 μL 100 nM biotinyleerd anker binder toe en inincuberen bij RT gedurende 1 uur.
- Volg de rubrieken 5.3 – 5.7.
10. dimerization Binder karakterisering door BLI
- De bindingsaffiniteit en kinetiek van door dimerisatie bindmiddelen voor het anker bindmiddel--ligand complex kunnen worden geanalyseerd door het immobiliseren van biotinyleerd door dimerisatie bindmiddelen op streptavidine (SA) biosensoren met de binding assay buffer en vervolgens worden getest met 1 μM anker Binder vooraf geëscaleerd met seriële verdunningen van de ligand. De kD, kaan, en koff van de interacties kunnen worden berekend met behulp van onze gerapporteerde methode19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We beschrijven de twee-stap in vitro selectie en validatie van anker-en door dimerisatie bindmiddelen door de combinatorische nanobody Library te screenen met een diversiteit hoger dan 109 met CBD als doel. Beoordeling van de verrijking van de faag biopanning tijdens de opeenvolgende selectie rondes voor zowel anker-als door dimerisatie bindmiddelen is belangrijk. Typische verrijking resultaten na 4 – 6 selectie rondes zoals weergegeven in afbeelding 5 zijn een goede indicatie dat er een hoge verhouding van potentiële hits in de subbibliotheken, zodat verdere selectie rondes mogelijk niet nodig zijn.
Single-Clone Elisa is geschikt voor het analyseren van de relatieve binding affiniteit en selectiviteit van anker-en door dimerisatie bindmiddelen. Figuur 6a is een representatief selectie resultaat van een anker Binder na zes rondes biopanning. Klonen met hoge (bijvoorbeeld #87) of lage (bijvoorbeeld #27) ligand selectiviteit kunnen worden vergeleken. Hoge selectiviteit klonen moeten worden gekozen als anker Binder kandidaten. Evenzo toont Figuur 6B de door dimerisatie Binder selectie resultaten na vier rondes biopanning. We observeerden klonen die een heterodimer vormden met de geïmmobiliseerde anker Binder alleen met de ligand (bijv. #49) of zonder (bijv. #80). De eerste, waaruit blijkt door dimerisatie specificiteit, moet worden geselecteerd voor verdere validatie.
Anker Binder Elisa vertrouwt op het gebruik van de biotinyleerd target. Daarom moeten we BLI gebruiken om de binding met de niet-gelabelde doelstelling verder te bevestigen. BLI maakt ook de karakterisering van bindende kinetiek mogelijk. Representatieve bli-resultaten van anker-en door dimerisatie-bindmiddelen worden respectievelijk weergegeven in Figuur 7A en 7b. De linker panelen tonen de ligand concentratieafhankelijke binding, wat suggereert dat ze geschikt zijn voor het construeren van een CID systeem. De rechter panelen tonen de negatieve controles. De berekende KD van het anker en de door dimerisatie bindmiddel interacties in de aanwezigheid van de ligand varieerden meestal van dubbelcijferige nanomolair naar dubbelcijferige micromolar. Ze kunnen variëren afhankelijk van de ligand en de combinatorische bibliotheek van keuze.
Analytische grootte-uitsluitings chromatografie (SEC) werd uitgevoerd om de heterodimervorming tussen anker-en door dimerisatie bindmiddelen te bevestigen. Een door dimerisatie piek werd waargenomen wanneer het anker en de door dimerisatie bindmiddelen en CBD werden gemengd (Figuur 8A, rode lijn). Er werd daarentegen geen door dimerisatie piek waargenomen bij afwezigheid van CBD (Figuur 8A, blauwe lijn) of wanneer elke Binder alleen in de kolom werd geladen (Figuur 8B). De chemische crosslinking werd gebruikt voor het stabiliseren van CID-complexen, en gecrosslinkt nanolichamen hebben iets grotere maten die overeenstemmen met eerdere eluteerde pieken.
Figuur 1: mechanisme van chemisch geïnduceerde eiwit dimerization. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: schematische voorstelling van de generatie van een synthetische nanolichaam combinatorische bibliotheek. De bibliotheek is gebouwd met behulp van een universele nanobody-steiger en integreert ontworpen verdelingen van aminozuren op elke randomisatie positie in drie complementariteit bepalende gebieden (Cdr's) door een Trinucleotide mutagenese (TRIM) technologie 24. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: stroomschema van (a) anker en (B) door dimerisatie Binder-screening. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: tijdlijn van combinatie-Cid. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: verrijking van faag Antilichaamtiters na elke ronde biopanning voor de selectie van de anker Binder. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6: representatieve Elisa-resultaten die positieve (+) en negatieve (*) klonen tonen. A) anker Binder Elisa-resultaten van 96 willekeurig geplukt klonen na zes selectie rondes. (B) dimerization Binder Elisa-resultaten van 96 willekeurig geplukt klonen na vier selectie rondes. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 7: anker en door dimerisatie Binder kinetische analyse door Bli. A) analyse van de anker binder met niet-GELABELDE CBD (links) en THC (rechts). Biotinylated Anchor Binder werd geïmmobiliseerd op Super Streptavidin (SSA) biosensoren getitreerd met verschillende concentraties van CBD. Gemeten gegevens voor CBD binding (rode curven) werden wereldwijd gemonteerd (grijze lijnen). B) links, bli-analyse van een SA biosensor-geïmmobiliseerde door dimerisatie bindmiddel binding aan de anker Binder, voorafgegaan door verschillende concentraties van CBD. Rechts werd de concentratie van de anker Binder getitreerd en gebonden aan de geïmmobiliseerde door dimerisatie Binder bij afwezigheid van CBD. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 8: SEC analyse van de heterodimerisatie tussen het anker en de door dimerisatie bindmiddelen. A) de door dimerisatie-en anker binders (elk 5 μM) in de aanwezigheid of afwezigheid van CBD werden met 100 μM bis-N-succinimidyl-(pentaethyleen glycol) ester gedurende 30 minuten bij RT voor de analyse gecrosslinkt. Elutie volumes van eiwit normen worden gekenmerkt door driehoeken. B) niet-crosslinked anker-en door dimerisatie bindmiddelen (elk 30 μM) werden afzonderlijk geïnjecteerd. Chromatogrammen in A en B worden in verschillende Y-schalen weergegeven. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het is essentieel om te kiezen van de juiste concentraties van de invoer faag bibliotheken voor verschillende rondes van biopanning. We zijn meestal gestart vanuit een invoer bibliotheek van ~ 1012– 1013 faag deeltjes met een diversiteit > 109, waardoor ~ 100 – 1000 kopieën van elke faag-kloon worden weergegeven in de pull-down assay. Als de faag concentratie in een bindende assay te hoog of te laag is, zal de waarschijnlijkheid van niet-specifieke binding of verlies van positieve klonen toenemen. De selectie van het anker of de door dimerisatie Binder bestaat normaliter uit drie tot zes rondes biopanning, en de output faag telt meestal vanaf ~ 104 en stijgt tot ~ 108– 109. Het is geschikt om enkelvoudige klonen voor ELISA-validering te kiezen na het observeren van een dergelijke verrijking. Extra biopanning kan de kans op het identificeren van geschikte laag-overvloed positieve klonen verminderen.
Het is belangrijk om geschikte negatieve controles en selecties in te stellen om het succes van de selecties te verbeteren. Bijvoorbeeld, het gebruik van structurele analogen van ligand doelen zal de selectie van ligand specificiteit vergemakkelijken. In ons werk werd een sterk vergelijkbare analoog, THC, gebruikt als een controle voor CBD in de Elisa en bli validatie van anker en door dimerisatie bindmiddelen19. In de door dimerisatie Binder selectie, als anker binders relatief lage ligand binding affiniteit hebben, kunnen zowel vrije als ligand gebonden anker binders worden gepresenteerd als doelen in de positieve selectie. Daarom is het belangrijk om bindmiddelen die aan vrije anker binders binden tijdens de negatieve selectie, grondig te verwijderen. Dit kan worden bereikt door het uitvoeren van meerdere rondes van de aftrekken met gratis anker Binders.
Een beperking van ons protocol is dat doel moleculen biotinyated moeten zijn voor de selectie van de anker Binder en dat er slechts één of enkele anker binders kunnen worden gebruikt voor de door dimerisatie-selectie. Het gebruik van biotinyleerd doelen kan bindmiddelen verrijken die deels binden aan de linker tussen Biotine en targets. Het is dus belangrijk om hits te valideren met behulp van niet-gelabelde doelen door BLI of andere technieken. Het kiezen van een enkele of enkele anker bindmiddelen voor de door dimerisatie Binder-selectie kan de kans verkleinen dat Cid-systemen worden geïdentificeerd met een geschikte gevoeligheid en specificiteit. Zo wacht het multiplexing vermogen van de selectie op verdere verbetering door te koppelen aan andere technieken — bijvoorbeeld single-moleculaire-interactie sequentiëren (SMI-SEQ), waarmee een "library-by-Library" eiwit-eiwit interactie screening25mogelijk is.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Een voorlopig octrooi met betrekking tot dit werk is ingediend door de Universiteit van Washington.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door de University of Washington Innovation Award (to L.G.), een subsidie van de Amerikaanse National Institutes of Health (1R35GM128918 tot L.G.), en een startup Fonds van de Universiteit van Washington (naar L.G.). H.J. werd gesteund door de Washington Research Foundation undergraduate Fellowship. K.W. werd gesteund door een undergraduate Fellowship van het University of Washington Institute for protein design.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Step Ultra TMB ELISA substrate solution | Thermo Fisher Scientific | 34029 | |
| Agar | Thermo Fisher Scientific | BP1423-2 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter unit (3 kDa cutoff) | Millipore | UFC900324 | |
| Ampicillin | Thermo Fisher Scientific | BP1760-25 | |
| Bio-Rad Protein Assay Kit II | Bio-Rad | 5000002 | |
| BirA biotin-protein ligase standard reaction kit | Avidity | BirA500 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153-50G | |
| Casein | Sigma-Aldrich | C7078-1KG | |
| CM13 Helper phage | Antibody Design Labs | PH020L | |
| D-(+)-Glucose monohydrate | Alfa Aesar | A11090 | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | Thermo Fisher Scientific | 11205D | |
| DynaMag-2 Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| EDTA | Thermo Fisher Scientific | BP120-1 | |
| Fast DNA Ladder | New England Biolabs | N3238S | |
| FastDigest BglI | Thermo Fisher Scientific | FD0074 | |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific | BP229-1 | |
| HiLoad 16/600 Superdex 200 pg | GE Healthcare | 28989335 | |
| HiPrep 26/10 Desalting Column | GE Healthcare | 17508701 | |
| HisTrap-FF-1ml | GE Healthcare | 11000458 | |
| Imidazole | Alfa Aesar | 161-0718 | |
| IPTG | Thermo Fisher Scientific | 34060 | |
| Kanamycin | Thermo Fisher Scientific | BP906-5 | |
| M13 Major Coat Protein Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-53004 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014-500G | |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
| Nunc 96-Well Polypropylene DeepWell Storage Plates | Thermo Fisher Scientific | 260251 | |
| Nunc MaxiSorp | Thermo Fisher Scientific | 44-2404-21 | |
| Octet RED96 | ForteBio | N/A | |
| pADL-23c Phagemid Vector | Antibody Design Labs | PD0111 | |
| PEG-6000 | Sigma-Aldrich | 81260-1KG | |
| Platinum SuperFi DNA Polymerase | Invitrogen | 12351010 | |
| PureLink PCR Purification Kit | Thermo Fisher Scientific | K310001 | |
| QIAprep Spin M13 Kit | Qiagen | 27704 | |
| Recovery Medium | Lucigen | 80026-1 | |
| SpectraMax Plus 384 | Molecular Devices | N/A | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389-1KG | |
| Super Streptavidin (SSA) Biosensors | ForteBio | 18-5057 | |
| Superdex 75 increase 10/300 GL Column | GE Healthcare | 28-9909-44 | |
| T4 DNA Ligase | Thermo Fisher Scientific | 15224-025 | |
| TG1 Electrocompetent Cells | Lucigen | 60502-1 | |
| Triethylamine | Sigma-Aldrich | 471283-100mL | |
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Tryptone | Thermo Fisher Scientific | BP9726-5 | |
| Tween 20 | Thermo Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Yeast Extract | Thermo Fisher Scientific | BP1422-2 | |
| Zeba Spin Desalting Column | Thermo Fisher Scientific | 89882 |
References
- Stanton, B. Z., Chory, E. J., Crabtree, G. R. Chemically induced proximity in biology and medicine. Science. 359 (6380), (2018).
- Wu, C. Y., Roybal, K. T., Puchner, E. M., Onuffer, J., Lim, W. A. Remote control of therapeutic T cells through a small molecule-gated chimeric receptor. Science. 350 (6258), (2015).
- Straathof, K. C., et al. An inducible caspase 9 safety switch for T-cell therapy. Blood. 105 (11), 4247-4254 (2005).
- Di Stasi, A., et al. Inducible apoptosis as a safety switch for adoptive cell therapy. The New England Journal of Medicine. 365 (18), 1673-1683 (2011).
- Mank, M., et al. A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change. Biophysical Journal. 90 (5), 1790-1796 (2006).
- Nagai, T., Sawano, A., Park, E. S., Miyawaki, A. Circularly permuted green fluorescent proteins engineered to sense Ca2+. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (6), 3197-3202 (2001).
- Hunter, M. M., Margolies, M. N., Ju, A., Haber, E. High-affinity monoclonal antibodies to the cardiac glycoside, digoxin. Journal of Immunology. 129 (3), 1165-1172 (1982).
- Bradbury, A. R. M., Sidhu, S., Dubel, S., McCafferty, J. Beyond natural antibodies: the power of in vitro display technologies. Nature Biotechnology. 29 (3), 245-254 (2011).
- Chen, G., et al. Isolation of high-affinity ligand-binding proteins by periplasmic expression with cytometric screening (PECS). Nature. Biotechnology. 19 (6), 537-542 (2001).
- Tinberg, C. E., et al. Computational design of ligand-binding proteins with high affinity and selectivity. Nature. 501 (7466), 212-216 (2013).
- Spencer, D. M., Wandless, T. J., Schreiber, S. L., Crabtree, G. R. Controlling signal transduction with synthetic ligands. Science. 262 (5136), 1019-1024 (1993).
- Ho, S. N., Biggar, S. R., Spencer, D. M., Schreiber, S. L., Crabtree, G. R. Dimeric ligands define a role for transcriptional activation domains in reinitiation. Nature. 382 (6594), 822-826 (1996).
- Belshaw, P. J., Ho, S. N., Crabtree, G. R., Schreiber, S. L. Controlling protein association and subcellular localization with a synthetic ligand that induces heterodimerization of proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (10), 4604-4607 (1996).
- Farrar, M. A., AlberolaIla, J., Perlmutter, R. M. Activation of the Raf-1 kinase cascade by coumermycin-induced dimerization. Nature. 383 (6596), 178-181 (1996).
- Erhart, D., et al. Chemical Development of Intracellular Protein Heterodimerizers. Chemistry & Biology. 20 (4), 549-557 (2013).
- Ballister, E. R., Aonbangkhen, C., Mayo, A. M., Lampson, M. A., Chenoweth, D. M. Localized light-induced protein dimerization in living cells using a photocaged dimerizer. Nature Communications. 17 (5), 5475 (2014).
- Hill, Z. B., Martinko, A. J., Nguyen, D. P., Wells, J. A. Human antibody-based chemically induced dimerizers for cell therapeutic applications. Nature Chemical Biology. 14 (2), 112-117 (2018).
- Foight, G. W., et al. Multi-input chemical control of protein dimerization for programming graded cellular responses. Nature Biotechnology. 37 (10), 1209-1216 (2019).
- Kang, S., et al. COMBINES-CID: An efficient method for de novo engineering of highly specific chemically induced protein dimerization systems. Journal of the American Chemical Society. 141 (28), 10948-10952 (2019).
- Muyldermans, S. Nanobodies: natural single-domain antibodies. Annual Review of Biochemistry. 82, 775-797 (2013).
- Fanning, S. W., Horn, J. R. An anti-hapten camelid antibody reveals a cryptic binding site with significant energetic contributions from a nonhypervariable loop. Protein Science. 20 (7), 1196-1207 (2011).
- Zavrtanik, U., Luken, J., Loris, R., Lah, J., Hadzi, S. Structural basis of epitope recognition by heavy-chain camelid antibodies. Journal of Molecular Biology. 430 (21), 4369-4386 (2018).
- Denhardt, D. T., Dressler, D., Ray, D. S. The Single-Stranded DNA Phages. , 605-625 (1978).
- Virnekas, B., et al. Trinucleotide phosphoramidites: ideal reagents for the synthesis of mixed oligonucleotides for random mutagenesis. Nucleic Acids Research. 22 (25), 5600-5607 (1994).
- Gu, L., et al. Multiplex single-molecule interaction profiling of DNA-barcoded proteins. Nature. 515 (7528), 554-557 (2014).
