Summary

Criando sistemas de dimerização de proteínas quimicamente induzidas altamente específicos pela seleção de fagos de uma biblioteca de anticorpos de domínio único combinatorial

Published: January 14, 2020
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Summary

Criar sistemas quimicamente induzidos da dimerização da proteína com afinidade e especificidade desejadas para toda a ligand pequena da molécula dada teria muitas aplicações biológicas da detecção e do atuação. Aqui, descrevemos um método eficiente e generalizável para a engenharia de novo de sistemas de dimerização quimicamente induzidos através da seleção manada de uma biblioteca de anticorpos combinatorial de domínio combinatório exibida por fago.

Abstract

Eventos de imersão de proteínas que ocorrem apenas na presença de um ligand de molécula pequena permitem o desenvolvimento de biossensores de pequenas moléculas para a dissecação e manipulação de vias biológicas. Atualmente, apenas um número limitado de sistemas de dimerização quimicamente induzida (CID) existe e engenharia de novos com sensibilidade desejada e seletividade para ligantes específicos de pequenas moléculas continua a ser um desafio no campo da engenharia de proteínas. Nós aqui descrevemos um método de triagem de alta produtividade, combin binders-enabled seleição de CID (COMBINES-CID), para a engenharia de novo de sistemas CID aplicável a uma grande variedade de ligantes. Este método usa a seleção em duas etapas de uma biblioteca de nanobody combinatória exibida por fago para obter 1) “pastas de âncora” que primeiro se ligam a um ligand de interesse e, em seguida, 2) “pastas de imersão” que só se ligam a complexos de ligand de pasta de ancoragem. Para selecionar pastas de âncora, uma biblioteca combinatória de mais de 109 nanobodies randomizados de complementaridade (CDR) é rastreada com um ligande biotinylated e os hits são validados com o ligand não rotulado pela interferometria de camada biológica (BLI). Para obter pastas de imersão, a biblioteca nanobody é rastreada com complexos de ligand escora como alvos para triagem positiva e as pastas de âncora sem limites para triagem negativa. Combines-CID é amplamente aplicável para selecionar pastas CID com outras imunoglobulina, não imunoglobulina, ou andaimes computacionalmente concebidos para criar biossensores para a detecção in vitro e in vivo de drogas, metabólitos, moléculas de sinalização, etc.

Introduction

Os sistemas CID, nos quais duas proteínas se dinamizarapenas na presença de um ligand de molécula pequena (Figura 1),oferecem ferramentas versáteis para dissecar e manipular vias metabólicas, sinalização e outras vias biológicas1. Eles demonstraram o potencial na atuação biológica, como a ativação de células T controladas por drogas2 e a apoptose3,4,para melhorar a segurança e eficácia da terapia de células T adotivas. Além disso, eles fornecem uma nova metodologia para a detecção in vivo ou in vitro de alvos de pequenas moléculas. Por exemplo, as proteínas CID podem ser geneticamente fundidas com sistemas de repórter de fluorescência (por exemplo, transferência de energia de ressonância fluorescência (FRET)5 e proteínas fluorescentes permutadas circularmente)6 para medições in vivo em tempo real, ou servir como reagentes de afinidade para ensaios imunosordobrados ligados a enzimas sanduíches (ELISA).

Apesar de suas amplas aplicações, a criação de novos sistemas CID que podem ser controlados por um dado ligand de pequenas moléculas tem grandes desafios. Métodos estabelecidos de engenharia de pasta de proteínas, incluindo imunização animal7,seleção in vitro8,9,e design computacional deproteína10 podem gerar proteínas de ligação que funcionam através de interações binárias de proteína-ligand. No entanto, esses métodos têm dificuldades em criar um complexo cid ternary induzido por ligand. Alguns métodos criam CID ligando quimicamente dois ligantes que se ligam independentemente às mesmas ou diferentes proteínas11,12,13,14,15,16 ou dependem da seleção de proteínas de pasta, como anticorpos que visam complexos pré-existentes de pequenas moléculas e proteínas17,18,e, portanto, têm uma escolha limitada de ligantes.

Recentemente desenvolvemos um método de bin dersbin ders-e nabled de CID (COMBINES-CID) método para engenharia de novo de sistemas CID19. Este método pode obter a alta especificidade da dimerização induzida por ligand (por exemplo, uma constante de dissociação da pasta de escorização âncora, KD (sem ligand)/KD (com ligand) > 1.000). A especificidade da imersão é alcançada usando pastas de âncora com locais de ligação flexíveis que podem introduzir mudanças conformais sobre a ligação, fornecendo uma base para a seleção de pastas conformaçãoseletivas que reconhecem apenas pastas de âncora ligadas. Demonstramos uma prova de princípio criando heterodimers induzidos por canabidiol (CBD) de nanobodies, um fragmento de anticorpo funcional de 12-15 kDa de camelid compreendendo um andaime universal e três loops cdr flexíveis (Figura 2)20, que podem formar um bolso de ligação com tamanhos adaptáveis para epitopes de pequenas moléculas21,22. Notavelmente, a seleção in vitro de uma biblioteca de proteína combinatória deve ser rentável e generalizável para a engenharia CID porque a mesma biblioteca de alta qualidade pode ser aplicada a diferentes ligantes.

Neste protocolo e vídeo, nos concentramos em descrever a seleção de duas etapas in vitro e validação de âncora(Figura 3A)e pastas de imersão(Figura 3B),selecionando a biblioteca nanobody combinatória com uma diversidade superior a 109 usando CBD como alvo, mas o protocolo deve ser aplicável a outras bibliotecas de proteínas ou alvos de pequenas moléculas. A triagem de pastas CID geralmente leva 6-10 semanas(Figura 4).

Protocol

1. Construção da biblioteca Use uma biblioteca de anticorpos de domínio único combinatório sintético com uma diversidade de ~1.23-7.14 x 109, como descrito anteriormente19. Embora este protocolo não inclua a construção de bibliotecas, ele pode ser aplicado a outras bibliotecas de pasta combinatória. 2. Biotinylation do alvo ou do ligand do ligand Biotinylate o ligand selecionado, por exemplo, CBD e tetrahidrocanabinol (THC)…

Representative Results

Descrevemos a seleção in vitro em duas etapas e a validação de pastas de âncora e imersão, selecionando a biblioteca de nanobody combinatória com uma diversidade superior a 109 usando cbd como alvo. Avaliar o enriquecimento da biopanning do phage durante os círculos sucessivos da seleção para ligações da escora e do dimerization é importante. Resultados típicos de enriquecimento após 4-6 rodadas de seleção, como mostrado na Figura 5 são uma boa indicação de que…

Discussion

É fundamental escolher as concentrações corretas de bibliotecas de fagos de entrada para diferentes rodadas de biopanning. Nós normalmente começou a partir de uma biblioteca de entrada de ~ 1012-1013 partículas de fago com uma diversidade >109, permitindo ~ 100-1.000 cópias de cada clone fago para ser apresentado no ensaio pull-down. Se a concentração de fagos em um ensaio vinculativo for muito alta ou baixa, a probabilidade de ligação inespecífica ou perda de clones positivos…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado pelo Prêmio de Inovação da Universidade de Washington (para a L.G.), uma doação dos Institutos Nacionais de Saúde dos EUA (1R35GM128918 para a L.G.), e um fundo de startups da Universidade de Washington (para l.G.). H.J. foi apoiado por uma bolsa de graduação da Washington Research Foundation. K.W. foi apoiado por uma bolsa de graduação do Instituto de Design de Proteínas da Universidade de Washington.

Materials

1-Step Ultra TMB ELISA substrate solution Thermo Fisher Scientific 34029
Agar Thermo Fisher Scientific BP1423-2
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter unit (3 kDa cutoff) Millipore UFC900324
Ampicillin Thermo Fisher Scientific BP1760-25
Bio-Rad Protein Assay Kit II Bio-Rad 5000002
BirA biotin-protein ligase standard reaction kit Avidity BirA500
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A2153-50G
Casein Sigma-Aldrich C7078-1KG
CM13 Helper phage Antibody Design Labs PH020L
D-(+)-Glucose monohydrate Alfa Aesar A11090
Dynabeads M-280 Streptavidin Thermo Fisher Scientific 11205D
DynaMag-2 Magnet Thermo Fisher Scientific 12321D
EDTA Thermo Fisher Scientific BP120-1
Fast DNA Ladder New England Biolabs N3238S
FastDigest BglI Thermo Fisher Scientific FD0074
Glycerol Thermo Fisher Scientific BP229-1
HiLoad 16/600 Superdex 200 pg GE Healthcare 28989335
HiPrep 26/10 Desalting Column GE Healthcare 17508701
HisTrap-FF-1ml GE Healthcare 11000458
Imidazole Alfa Aesar 161-0718
IPTG Thermo Fisher Scientific 34060
Kanamycin Thermo Fisher Scientific BP906-5
M13 Major Coat Protein Antibody Santa Cruz Biotechnology sc-53004
NaCl Sigma-Aldrich S3014-500G
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers Thermo Fisher Scientific ND-2000
Nunc 96-Well Polypropylene DeepWell Storage Plates Thermo Fisher Scientific 260251
Nunc MaxiSorp Thermo Fisher Scientific 44-2404-21
Octet RED96 ForteBio N/A
pADL-23c Phagemid Vector Antibody Design Labs PD0111
PEG-6000 Sigma-Aldrich 81260-1KG
Platinum SuperFi DNA Polymerase Invitrogen 12351010
PureLink PCR Purification Kit Thermo Fisher Scientific K310001
QIAprep Spin M13 Kit Qiagen 27704
Recovery Medium Lucigen 80026-1
SpectraMax Plus 384 Molecular Devices N/A
Sucrose Sigma-Aldrich S0389-1KG
Super Streptavidin (SSA) Biosensors ForteBio 18-5057
Superdex 75 increase 10/300 GL Column GE Healthcare 28-9909-44
T4 DNA Ligase Thermo Fisher Scientific 15224-025
TG1 Electrocompetent Cells Lucigen 60502-1
Triethylamine Sigma-Aldrich 471283-100mL
Trizma Base Sigma-Aldrich T1503
Tryptone Thermo Fisher Scientific BP9726-5
Tween 20 Thermo Fisher Scientific BP337-500
Yeast Extract Thermo Fisher Scientific BP1422-2
Zeba Spin Desalting Column Thermo Fisher Scientific 89882

References

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Gomez-Castillo, L., Watanabe, K., Jiang, H., Kang, S., Gu, L. Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library. J. Vis. Exp. (155), e60738, doi:10.3791/60738 (2020).

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