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Biochemistry

एक संयोजन एकल डोमेन एंटीबॉडी लाइब्रेरी के स्टेपवाइज फाग चयन द्वारा अत्यधिक विशिष्ट रासायनिक प्रेरित प्रोटीन डामरीकरण सिस्टम बनाना

Published: January 14, 2020 doi: 10.3791/60738
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1, 1
1Department of Biochemistry and Institute for Protein Design, University of Washington
* These authors contributed equally

Summary

किसी भी छोटे अणु लिगामेंट के लिए वांछित आत्मीयता और विशिष्टता के साथ रासायनिक रूप से प्रेरित प्रोटीन डामरीकरण प्रणाली बनाने में कई जैविक संवेदन और एक्टयूशन अनुप्रयोग होंगे। यहां, हम एक phage प्रदर्शित संयोजन एकल डोमेन एंटीबॉडी पुस्तकालय के स्टेपवाइज चयन के माध्यम से रासायनिक प्रेरित डामरीकरण प्रणालियों के डी नोवो इंजीनियरिंग के लिए एक कुशल, सामान्यीकरण विधि का वर्णन करते हैं।

Abstract

प्रोटीन डामरीकरण की घटनाएं जो केवल एक छोटे-अणु लिगामेंट की उपस्थिति में होती हैं और जैविक रास्तों के विच्छेदन और हेरफेर के लिए छोटे अणु बायोसेंसर के विकास को सक्षम करती हैं। वर्तमान में, केवल रासायनिक रूप से प्रेरित डामरीकरण (सीआईडी) प्रणालियों की एक सीमित संख्या मौजूद है और विशिष्ट छोटे अणु ligands के लिए वांछित संवेदनशीलता और चयनात्मकता के साथ नए लोगों को इंजीनियरिंग प्रोटीन इंजीनियरिंग के क्षेत्र में एक चुनौती बनी हुई है । हम यहां एक उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग विधि, कॉमबिनेटोरियल बिनडेर्स-ई एनएबीड एससीआईडी (एनकोन्स-सीआईडी) के चुनाव का वर्णन करते हैं, सीआईडी सिस्टम की डी नोवो इंजीनियरिंग के लिए जो बड़ी विविधता के लिए लागू होती है। यह विधि 1 प्राप्त करने के लिए एक phage-प्रदर्शित संयोजन naकोई पुस्तकालय के दो चरण चयन का उपयोग करता है) "एंकर बाइंडर्स" जो पहले ब्याज के लिगामेंट से बांधते हैं और फिर 2) "डिमराइजेशन बाइंडर्स" जो केवल एंकर बाइंडर-लिगामेंट कॉम्प्लेक्स से बांधते हैं। एंकर बाइंडर्स का चयन करने के लिए, 109 से अधिक पूरकता-निर्धारक क्षेत्र (सीडीआर) की एक संयोजन पुस्तकालय - यादृच्छिक नैनोबॉडी को बायोटिनेटेड लिगांड के साथ जांच की जाती है और हिट को बायो-लेयर इंटरफेरोमेट्री (BLI) द्वारा अलेबल लिगलैंड के साथ मान्य किया जाता है। डिमराइजेशन बाइंडर्स प्राप्त करने के लिए, नकोई लाइब्रेरी सकारात्मक स्क्रीनिंग के लिए लक्ष्य और नकारात्मक स्क्रीनिंग के लिए अनबाउंड एंकर बाइंडर्स के रूप में लंगर बांधने वाले लिगामेंट कॉम्प्लेक्स के साथ जांच की जाती है । जोड़ती-सीआईडी मोटे तौर पर अन्य इम्यूनोग्लोबुलिन, गैर इम्यूनोग्लोबुलिन, या गणना रूप से डिजाइन किए गए मचानों के साथ सीआईडी बांधने वालों का चयन करने के लिए लागू होता है ताकि इन विट्रो के लिए बायोसेंसर बनाया जा सके और दवाओं, मेटाबोलाइट्स, सिग्नलिंग अणुओं आदि का विवो डिटेक्शन बनाया जा सके।

Introduction

सीआईडी सिस्टम, जिसमें दो प्रोटीन केवल एक छोटे-अणु लिगांड(चित्रा 1)की उपस्थिति में डिमेराइज़ करते हैं, मेटाबोलिक, सिग्नलिंग और अन्य जैविक रास्तों को विच्छेदन और हेरफेर करने के लिए बहुमुखी उपकरण प्रदान करतेहैं। उन्होंने दत्तक टी सेल थेरेपी की सुरक्षा और प्रभावकारिता में सुधार के लिए जैविक एक्क्यूशन में क्षमता का प्रदर्शन किया है, जैसे ड्रग-नियंत्रित टी सेल एक्टिवेशन2 और एपोप्टोसिस3,4। इसके अतिरिक्त, वे वीवो में या छोटे अणु लक्ष्यों का इन विट्रो पता लगाने के लिए एक नई पद्धति प्रदान करते हैं। उदाहरण के लिए, सीआईडी प्रोटीन आनुवंशिक रूप से फ्लोरेसेंस रिपोर्टर सिस्टम (जैसे, फ्लोरेसेंस अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (FRET)5 और परिपत्र रूप से छिद्रित फ्लोरोसेंट प्रोटीन)6 वीवो माप में वास्तविक समय के लिए, या सैंडविच एंजाइम से जुड़े इम्यूनोसोरबेंट परख (एलिसा) के लिए आत्मीयता अभिकर्मकों के रूप में काम कर सकते हैं।

उनके व्यापक अनुप्रयोगों के बावजूद, नए सीआईडी सिस्टम बनाने कि एक दिया छोटे अणु ligand द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है बड़ी चुनौतियों का सामना करना पड़ता है । पशु प्रतिरक्षण7,इन विट्रो चयन8,9,और कम्प्यूटेशनल प्रोटीन डिजाइन10 सहित स्थापित प्रोटीन बाइंडर इंजीनियरिंग विधियां लिगामेंट बाध्यकारी प्रोटीन उत्पन्न कर सकती हैं जो बाइनरी प्रोटीन-लिगामेंट इंटरैक्शन के माध्यम से कार्य करती हैं। हालांकि, इन तरीकों से लिगामेंट प्रेरित टर्नरी सीआईडी कॉम्प्लेक्स बनाने में दिक्कतें होती हैं। कुछ विधियां रासायनिक रूप से दो लिगांडों को जोड़कर सीआईडी बनाती हैं जो स्वतंत्र रूप से समान या विभिन्न प्रोटीन11,12,13,14,15,16 से बांधते हैं या पहले से मौजूद छोटे अणु-प्रोटीनपरिसरों17,18को लक्षित करने वाले एंटीबॉडी जैसे बाइंडर प्रोटीन का चयन करने पर भरोसा करते हैं, और इस प्रकार लिगांड का सीमित विकल्प है।

हमने हाल ही में सीआईडीसिस्टम्स 19के डी नोवो इंजीनियरिंग के लिए सीआईडी (एनकोन्स-सीआईडी) विधि के एक कॉमबिनेटोरियल बिनडेर्स-ई नाब्ड एसइलेक्शन विकसित किए हैं । यह विधि लिगांड-प्रेरित डामरीकरण (उदाहरण के लिए, एंकर-डिमराइजेशन बाइंडर विच्छेदन स्थिर, केडी (लिगांड के बिना)/केडी (लिगांड के साथ) और 1,000) की उच्च विशिष्टता प्राप्त कर सकती है। डिमराइजेशन विशिष्टता लचीला बाध्यकारी साइटों के साथ एंकर बांधने का उपयोग करके हासिल की जाती है जो लिगाण्ड बाइंडिंग पर संरचनापरिवर्तन शुरू कर सकती है, केवल लिगांड-बाउंड एंकर बाइंडर्स को पहचानने के लिए एक आधार प्रदान करती है। हमने कैनाबिडिओल (सीबीडी) -नैनोबॉडी के प्रेरित हेटेरोडिमर, कैमलिड से 12-15 केडीए कार्यात्मक एंटीबॉडी टुकड़ा बनाकर एक सबूत-सिद्धांत का प्रदर्शन किया जिसमें एक सार्वभौमिक पाड़ और तीन लचीला सीडीआर लूप(चित्रा 2)20शामिल हैं, जो छोटे अणु एपिटोप21, 22के लिए अनुकूलनीय आकार के साथ एक बाध्यकारी जेब बना सकते हैं। विशेष रूप से, एक संयोजन प्रोटीन पुस्तकालय का इन विट्रो चयन सीआईडी इंजीनियरिंग के लिए लागत प्रभावी और सामान्यहोना चाहिए क्योंकि एक ही उच्च गुणवत्ता वाली लाइब्रेरी को विभिन्न लिगांड पर लागू किया जा सकता है।

इस प्रोटोकॉल और वीडियो में, हम दो कदम में विट्रो चयन और एंकर के सत्यापन का वर्णन करने पर ध्यान केंद्रित(चित्रा 3ए)और डिमराइजेशन बाइंडर्स(चित्रा 3बी)एक लक्ष्य के रूप में सीबीडीका उपयोग कर अधिक विविधता के साथ संयोजन naकोई पुस्तकालय स्क्रीनिंग द्वारा, लेकिन प्रोटोकॉल अंय प्रोटीन पुस्तकालयों या छोटे अणु लक्ष्यों पर लागू होना चाहिए । सीआईडी बांधने वालों की स्क्रीनिंग में आमतौर पर 6-10 सप्ताह(चित्रा 4)लगते हैं ।

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Protocol

1. पुस्तकालय निर्माण

  1. ~ 1.23-7.14 x 109की विविधता के साथ एक सिंथेटिक संयोजन एकल डोमेन एंटीबॉडी लाइब्रेरी का उपयोग करें, जैसा कि पहलेवर्णित 19। हालांकि इस प्रोटोकॉल में पुस्तकालय निर्माण शामिल नहीं है, इसे अन्य संयोजन बाइंडर पुस्तकालयों पर लागू किया जा सकता है।

2. लिगामेंट टारगेट या लिगामेंट का बायोटिन्टिनेशन

  1. चयनित लिगांड को बायोटिनेट करें, उदाहरण के लिए, सीबीडी और टेट्राहाइड्रोकैनाबिनॉल (टीएचसी)19,विभिन्न रासायनिक संश्लेषण रणनीतियों के माध्यम से, एक लक्ष्य के उपयुक्त बायोटिनीशन साइटों के आधार पर।

3. एंकर बांधने की मशीन स्क्रीनिंग

  1. चयन की शुरुआत
    1. एक टीजी1-सेल कॉलोनी को इनकुलकरके चयन के हर दौर को शुरू करें, जो 2YT के 6 mL में 37 डिग्री सेल्सियस और250 क्रांतियों प्रति मिनट (आरपीएम) में ~ 0.5 के अवशोषित के लिए प्रति मिनट (आरपीएम) में उगाया जाता है। चरण 3.5.1 में उपयोग के लिए बर्फ पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  2. बायोटिन-बाउंड स्ट्रेप्टाविडिन मोतियों के साथ नकारात्मक चयन
    1. चुंबकीय पृथक्करण रैक का उपयोग करके स्ट्रेप्टाविडिन-लेपित चुंबकीय मोतियों के 300 माइक्रोन धोकर "नकारात्मक चयन मोतियों" को तैयार करें, ट्वीन बफर (PBST, 0.05% vol/vol Tween 20% के साथ 0.05% फॉस्फेट-बफर्ड खारा के साथ 3x) और 1 एक्स पीबीएस के साथ 2x।
    2. 1 एक्स पीबीएस (पीएच = 7.4) में 1% केसिन के 1 मिलील के साथ मोतियों को फिर से निलंबित करें, और बायोटिन का उपयोग करके रिपोर्ट की गई बाध्यकारी क्षमता को 5x जोड़कर मोतियों को संतृप्त करें। 1 घंटे के लिए एक रोटेटर पर कमरे के तापमान (आरटी) पर इनक्यूबेट ।
    3. कुल आठ वॉश के लिए 1 एक्स पीबीएस का उपयोग करके 0.05% पीएसटी और 3x का उपयोग करके मोतियों 5x को धोएं।
    4. 1 एक्स पीबीएस (पीएच = 7.4) में 1% casein/1% बीएसए में ~ 1013 phage कणों जोड़ें और 1 घंटे के लिए एक रोटेटर पर आरटी पर इनक्यूबेट।
    5. ऊष्मायन के बाद, चरण 3.3.6 में उपयोग किए जाने वाले सुपरनेटेंट को इकट्ठा करें।
  3. बायोटिनीलिगेटेड लिगामेंट-बाउंड स्ट्रेप्टाविडिन मोतियों के साथ सकारात्मक चयन
    1. चरण 3.2.1 के बाद "नकारात्मक चयन मोतियों" के लिए उपयोग किए जाने वाले मोतियों की मात्रा 1/2 का उपयोग करके "सकारात्मक चयन मोतियों" को तैयार करें।
    2. 1 × पीबीएस, पीएच 7.4 में 1 mL 1% कैसिन के साथ मोतियों को फिर से निलंबित करें और पसंद के बायोटिनेटेड लिगामेंट का उपयोग करके मैनुअल के आधार पर गणना की गई पूर्ण बाध्यकारी क्षमता को जोड़कर मोतियों को संतृप्त करें। 1 घंटे के लिए एक रोटेटर पर आरटी पर इनक्यूबेट ।
    3. कुल आठ वॉश के लिए 1 एक्स पीबीएस का उपयोग करके 0.05% पीएसटी और 3x का उपयोग करके मोतियों 5x को धोएं।
    4. 1 एक्स पीबीएस (पीएच = 7.4) में 1% कैसिन/1% बीएसए के 1 mL के साथ मोतियों को ब्लॉक करें और 1 घंटे के लिए रोटेटर पर आरटी पर इनक्यूबेट करें ताकि फेज और स्ट्रेप्टाविडिन-लेपित चुंबकीय मोतियों के बीच गैर-विशिष्ट बाध्यकारी को रोका जा सके।
    5. स्ट्रेप्टाविडिन-लेपित चुंबकीय मोती 3x को कुल चार वॉश के लिए 0.05% पीबीएस एसटीएसटी और 1 एक्स पीबीएस का उपयोग करके धोएं।
    6. स्टेप 3.2.5 से उठाए गए अनबाउंड फेज का उपयोग करके स्ट्रेप्टाविडिन-लेपित चुंबकीय मोतियों को फिर से निलंबित करें और 1 घंटे के लिए एक रोटेटर पर आरटी पर इनक्यूबेट करें।
    7. चुंबकीय मोतियों को परेशान किए बिना अधिनेचिता निकालें। इनपुट के रूप में अनबाउंड फेज को बचाएं, चरण 3.5.1 में उपयोग किया जाएगा।
    8. 1 एक्स पीबीएस का उपयोग करके 0.05% पीएसटी और 5x का उपयोग करके मोतियों को 10x धोएं। हर तीन वॉश के बीच में उन्हें एक नई ट्यूब में स्थानांतरित करने के लिए phages गैर विशेष रूप से ट्यूब दीवारों के लिए बाध्य से बचने के लिए ।
  4. फेज-प्रदर्शित नैनोबॉडीका एल्यूशन
    1. माइक्रोमोलर रेंज (जैसे, 10-50 माइक्रोन) में एकाग्रता का उपयोग करके और 30 मिन के लिए रोटेटर पर आरटी पर इनक्यूबेटिंग, गैर-बायोटिनेटेड लिगामेंटके 450 माइक्रोन जोड़कर प्रतिस्पर्धी रूप से बाध्य फेज को कम किया जाता है। बाउंड फेज के प्रतिस्पर्धी एल्यूशन के लिए चयनित लिगांड एकाग्रता "एंकर बाइंडर" के वांछित केडी पर निर्भर है। लिगामेंट सांद्रता प्रारंभिक चयन दौर में अपेक्षाकृत अधिक हो सकती है और फिर बाद के दौर में कम हो सकती है।
    2. सुपरनेट ले लीजिए और उत्पादन के रूप में लट के phages को बचाने के लिए, चरण 3.5.2 में इस्तेमाल किया जाएगा।
  5. इनपुट/आउटपुट टिट्रिशन और इंफेक्शन
    1. इनपुट टिट्रेशन के लिए, 1 x पीबीएस में 10x सीरियल कमजोर होकर 109तक तैयार करें - चरण 3.3.7 से इनपुट फेज के साथ गुना। प्रत्येक कमजोर पड़ने से 70 माइक्रोन टीजी1 कोशिकाओं (~ 0.5 के ओडी600) को स्थानांतरित करके संक्रमण करने के लिए 107-109 सीरियल कमजोरका का उपयोग करें। 45 मिन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट, तीन 90 मिमी 2YT-आगर व्यंजन ों पर संक्रमित टीजी1 कोशिकाओं को प्लेट करें जिसमें 100 μg/mL ampicillin और 2% (wt/vol) ग्लूकोज होता है, और रात में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। रात भर प्लेटों से, phage इनपुट इस प्रकार की गणना की जा सकती है:
      Equation 1
    2. आउटपुट इंफेक्शन और टिट्रेशन के लिए, लुटे हुए फेज को टीजी1 कोशिकाओं के चरण 3.4.2 से 3 मिलीएल (~ 0.5 की ओडी600) से स्थानांतरित करें। 45 मिन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में इनक्यूबेट। फिर 2YT में 10x सीरियल कमजोर होकर 103गुना, प्लेट प्रत्येक कमजोर पड़ने पर 90 मिमी 2YT-agar व्यंजन तैयार करें, और 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें। रात भर प्लेटों से, phage आउटपुट की गणना इस प्रकार की जा सकती है:
      Equation 1
    3. शेष संक्रमित टीजी1 कोशिकाओं को तीन १५० मिमी 2YT-आगर प्लेटों पर विभाजित करें जिनमें १०० μg/mL ampicillin और 2% (wt/vol) ग्लूकोज हो । रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट प्लेटें।
  6. चयन के आगे के दौर के लिए पुस्तकालय प्रवर्धन और वसूली
    1. प्रति प्लेट 2YT के 3 mL जोड़ें, एक बाँझ सेल स्क्रैपर के साथ परिमार्जन और एक 50 mL शंकुट्यूब में सभी कोशिकाओं को इकट्ठा। एकत्र कोशिकाओं को बाँझ ग्लाइसेरोल (20% wt/vol अंतिम एकाग्रता) के साथ मिलाएं। मिश्रण के ओडी600 को मापें और 3-5 स्टॉक एलिकोट करें। लंबी अवधि के भंडारण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    2. phage बचाव के लिए, 2YT मीडिया के 25 mL का उपयोग कर phagemid युक्त TG1 जीवाणु मिश्रण कमजोर 2% ग्लूकोज और १०० μg/mL ampicillin के साथ एक ओडी६०० के लिए ~ ०.१ । 37 डिग्री सेल्सियस और 250 आरपीएम पर संस्कृति कोशिकाओं को ~ 0.5 की एक ओडी600.
    3. 5 x 109 pfu/mL पर CM13 हेल्पर phage जोड़कर कोशिकाओं को सुपरसंक्रमित और ३७ डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर और ४५ ०० के लिए २५० आरपीएम । CM13 हेल्पर phage पूर्ण phage कणों की विधानसभा के लिए आवश्यक phage कोट प्रोटीन प्रदान करता है।
    4. ग्लूकोज को हटाने के लिए 10 मिन के लिए 8,000 x ग्राम पर संस्कृति को केंद्रित करें। 2YT मीडिया के ५० मिलीग्राम का उपयोग कर कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें १०० μg/mL ampicillin और ५० μg/mL kanamycin और इनक्यूबेट पर 25 डिग्री सेल्सियस और २५० आरपीएम रातोंरात के साथ पूरक ।
    5. 9,000 x ग्राम,30 मिन के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात संस्कृति से कोशिकाओं को केंद्रित करें। 1/5 वॉल्यूम खूंटी/नैसीएल समाधान (20% wt/vol पॉलीथीन ग्लाइकोल-6,000 और 2.5 एम नासीएल) का उपयोग करके सुपरनेटेंट में सुपरनेटेंट को स्थानांतरित करें। धीरे-धीरे मिलाएं और 1 घंटे के लिए बर्फ पर रखें।
    6. 30 00 00 00 0 00 0 0 0 0 0 0 का उपयोग करके अपकेंद्रित्र द्वारा फाग कणों को एकत्र करें। 1 एक्स पीबीएस के 1 mL का उपयोग करके छर्रों को फिर से निलंबित करें, और निलंबन को माइक्रोसेंटरिफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। अवशिष्ट बैक्टीरिया को दूर करने के लिए ट्यूब को 20,000 x जी और 10 मिन के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर केंद्रित करें।
    7. बैक्टीरियल पैलेट को परेशान किए बिना सुपरनेटेंट को एक नई माइक्रोसेंटाइफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। 269 एनएम और 320 एनएम पर अवशोषण को मापने के लिए 1:100 कमजोर पड़ने का उपयोग करें। फेज की कुल संख्या की गणना निम्नलिखित सूत्र23का उपयोग करके की जा सकती है:
      Equation 3
    8. अल्पकालिक उपयोग के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर या दीर्घकालिक भंडारण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर 25% ग्लाइसेरोल के साथ phage लाइब्रेरी स्टोर करें।
    9. 3-6 राउंड के लिए या वांछित संवर्धन देखे जाने तक चयन (चरण 3.1-3.6) के दौर दोहराएं (परिणाम अनुभाग को देखें)। लिगांड (सेक्शन 5-7) के प्रति उनकी आत्मीयता और विशिष्टता को चित्रित करने के लिए प्लेट और एकल क्लोन (सेक्शन 4) चुनें।

4. एकल क्लोन अलगाव

  1. एक समृद्ध उपपुस्तकालय से व्यक्तिगत क्लोन को अलग करने के लिए, फेज-संक्रमित TG1 कोशिकाओं (चरण 3.5.2) के 10x सीरियल कमजोर ियां तैयार करें। प्लेट सीरियल 90 मिमी 2YT-agar व्यंजन ों पर कमजोरियां जिनमें 100 μg/mL ampicillin और 2% (wt/vol) ग्लूकोज और इनक्यूबेट 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर शामिल हैं।
  2. रात भर प्लेटों से, एकल उपनिवेशों को 2YT मीडिया के 250 माइक्रोन में चुनें जो बाँझ गहरी-अच्छी प्लेटों में प्रति अच्छी तरह से 100 μg/mL ampicillin के साथ पूरक है और रात भर 37 डिग्री सेल्सियस की दर से बढ़ता है।
  3. रातोंरात संस्कृतियों से, ताजा 2YT मीडिया के ५०० μL में 10 μL टीका १०० μg/mL ampicillin के साथ पूरक ।
  4. ~ 0.5 के एक ओडी600 के लिए कोशिकाओं को बढ़ाएं, 5 x 109 pfu/mL पर CM13 सहायक phage जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट और 45 min के लिए 250 आरपीएम।
  5. 100 μg/mL ampicillin और 50 μg/mL kanamycin के साथ पूरक 2YT मीडिया के 500 μL जोड़ें। रात भर 25 डिग्री सेल्सियस और 250 आरपीएम पर इनक्यूबेट।
  6. 10 किमी के लिए 3,000 x ग्राम पर रात भर संस्कृतियों से गहरी अच्छी तरह से प्लेटों को अपकेंद्रित ्रित करें। सेल पैलेट को परेशान किए बिना फाज कणों वाले अधिनायक को एकत्र करें।
  7. लिगामेंट में चयनित क्लोन की विशिष्टता निर्धारित करने के लिए एलिसा के लिए फाज़ कणों का उपयोग किया जा सकता है। बायोटिन या लक्ष्य के संरचनात्मक होमोलॉग का उपयोग नकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया जा सकता है।

5. एलिसा द्वारा एंकर बांधने की मशीन सत्यापन

  1. कोट 96 अच्छी तरह से एलिसा प्लेटें रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर कोटिंग बफर (100 एमएमएम कार्बोनेट बफर, पीएच = 8.6) में 5 μg/mL स्ट्रेप्टाविडिन के 100 माइक्रोन का उपयोग कररही हैं।
  2. 0.05% पीएसटी का उपयोग करके एलिसा प्लेट्स 3x को धोएं और लक्ष्य कुओं में 1 माइक्रोएम बायोटिनेटेड लक्ष्य के 100 माइक्रोन जोड़ें। नियंत्रण कुओं में 1 माइक्रोन बायोटिन या टारगेट होमोलॉग के 100 माइक्रोन जोड़ें। 1 घंटे के लिए आरटी पर इनक्यूबेट ।
  3. 1 एक्स पीबीएस में 1% केसिन के 300 माइक्रोन जोड़कर 0.05% पीएसटी का उपयोग करके प्लेट्स 5x धोएं और ब्लॉक नॉनस्पेसिफिक बाइंडिंग करें। 1 घंटे के लिए आरटी पर इनक्यूबेट ।
  4. 0.05%- PBST का उपयोग करके एलिसा प्लेट्स 3x धोएं और शुद्ध फाग अधिनेत जोड़ें। आरटी में 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट ।
  5. 0.05% पीएसटी का उपयोग करके एलिसा प्लेट्स 10x को धोएं और 100 माइक्रोन सहिजन पेरोक्सिडेस (एचआरपी) जोड़ें - M13 प्रमुख कोट प्रोटीन एंटीबॉडी (1% कैसिन के साथ 1 x पीबीएस के साथ 1:10,000 कमजोर पड़ने)। 1 घंटे के लिए आरटी पर इनक्यूबेट ।
  6. 0.05% PBST का उपयोग कर एलिसा प्लेट3x धोएं और 100 माइक्रोन टेट्रामेथाइलबेंजेडीन (टीएमबी) सब्सट्रेट जोड़ें। 10 मिन के लिए या जब तक एक दृश्यरंग परिवर्तन मनाया जाता है के लिए इनक्यूबेट। 1 एम एचसीएल के 100 माइक्रोन जोड़कर रिएक्शन बंद करें। 450 एनएम पर प्लेट को स्पेक्ट्रोफोटोमीटर पर पढ़ें।
  7. प्रोटीन अभिव्यक्ति और शुद्धि के लिए, लक्ष्य के लिए उच्च आत्मीयता और विशिष्टता दिखाने वाले क्लोन चुनें (चर्चा देखें)।

6. प्रोटीन अभिव्यक्ति, शुद्धि, और बायोटिनाइलेशन

  1. जैसा कि पहले19की रिपोर्ट थी, सबक्लोन ने धारा 5 से क्लोन का चयन किया और सी-टर्मिनल लवी-टैग और उनके टैग नैनोबॉडी के रूप में व्यक्त किया।
  2. एक्सप्रेस ई. कोलाई WK6 कोशिकाओं (आम तौर पर 1 एल संस्कृति में) के periplasm में नैनोबॉडी का चयन किया, ऑस्मोटिक सदमे से रिहाई, और एक निकल-एनटीए कॉलम का उपयोग कर शुद्ध (सामग्री की तालिकादेखें) ।
  3. एक डिसाल्टिंग कॉलम के साथ एक्सचेंज बफर (5% ग्लाइसेरोल के साथ 1 एक्स पीबीएस; टेबल ऑफ मैटेरियलदेखें)।
  4. आगे के उपयोग के लिए एक वाणिज्यिक किट (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करके बायोटिनिटलेट नैनोबॉडी।

7. BLI द्वारा लंगर बांधने की मशीन लक्षण वर्णन

  1. बाध्यकारी परख बफर (1 एक्स पीबीएस (पीएच = 7.4), 0.05% ट्वीन 20, 0.2% बीएसए, 3% मेथनॉल) के साथ स्ट्रेपेविडिन बायोसेंसर (सामग्री की तालिकादेखें) पर 200 एनएम बायोटिनेटेड एंकर बाइंडर्स को स्थिर करके चयनित एंकर बाइंडर्स की बाध्यकारी आत्मीयता और काइनेटिक्स का विश्लेषण करें।
  2. डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करके स्थिर-राज्य विश्लेषण द्वारा एंकर बाइंडर-लिगांड इंटरैक्शन के वियोजन स्थिरता(केडी)की गणना करें। प्राप्त कश्मीरडी मान आम तौर पर एकल से दो अंकों के माइक्रोमोलर तक होते हैं।

8. डामरीकरण बांधने की मशीन स्क्रीनिंग

नोट: "डिमराइजेशन बाइंडर्स" की बायोपैनिंग स्क्रीनिंग एंकर बाइंडर्स के समान है, दो महत्वपूर्ण चरणों को छोड़कर: 1) डिमराइजेशन बाइंडर्स को नकारात्मक के लिए एक चयनित बायोटिनेटेड एंकर बाइंडर और एंकर बाइंडर-लिगांड कॉम्प्लेक्स का उपयोग करके चुना जाता है और सकारात्मक चयन, क्रमशः । 2) एल्यूशन स्टेप के दौरान, 100 एमएम ट्रायलॉयलमाइन का उपयोग सकारात्मक रूप से चयनित फेज को एल्यूट करने के लिए किया जाता है जो केवल एंकर बाइंडर-लिगामेंट टारगेट कॉम्प्लेक्स से बंधे थे। 100 mM ट्राइमेथिलमाइन समाधान (पीएच = 11.5) का उपयोग प्रोटीन इंटरैक्शन को बाधित करके सकारात्मक क्लोन को एल्यूट करने के लिए किया जाता है।

  1. चयन की शुरुआत
    1. एक टीजी1 सेल कॉलोनी को इनकुलिंग करके चयन के हर दौर को शुरू करें, जो न्यूनतम मीडिया पर ताजा रूप से उगाया जाता है, 6 mL 2YT में 37 डिग्री सेल्सियस और 250 आरपीएम में ~ 0.5 के ओडी600 में। बर्फ पर इनक्यूबेट कोशिकाएं।
  2. नकारात्मक रूप से चयनित नैनोबॉडी को हटाना
    1. स्ट्रेप्टाविडिन-लेपित चुंबकीय मोतियों के 400 माइक्रोन का उपयोग करके "घटाव ट्यूब" तैयार करें और चरण 3.2 का पालन करें। हालांकि, बायोटिन के साथ संतृप्त करने के बजाय, चयनित बायोटिनेटेड एंकर बांधने की मशीन का उपयोग करके 5x गणना पूर्ण बाध्यकारी क्षमता जोड़ें और चरण 8.3.3 में उपयोग किए जाने वाले अनबाउंड फेज को बचाएं।
  3. सकारात्मक रूप से चयनित नैनोबॉडी का चयन
    1. 1/2 का उपयोग करके "कैप्चरिंग ट्यूब" तैयार करें स्ट्रेप्टाविडिन-लेपित चुंबकीय मोतियों की मात्रा जिसका उपयोग "घटाव ट्यूब" के लिए उपयोग किया जाता है और निम्नलिखित चरण 3.3.2 से 3.3.3 तक। हालांकि, बायोटिनेटेड लिगामेंट के साथ संतृप्त करने के बजाय, चयनित बायोटिनेटेड एंकर बांधने की मशीनका उपयोग करके गणना की गई पूर्ण बाध्यकारी क्षमता का पांच गुना जोड़ें।
    2. सकारात्मक डिमराइजेशन बाइंडर चयन के लिए एंकर बाइंडर-लिगामेंट कॉम्प्लेक्स बनाने के लिए, गैर-बायोटिनेटेड लिगामेंटकी एक उच्च पर्याप्त एकाग्रता जोड़ें। इससे सबसे स्ट्रेप्टाविडिन जाने वाले एंकर बाइंडर को लिगामेंट बाउंड कॉम्प्लेक्स बनाने का काम करना पड़ेगा।
    3. "घटाव ट्यूब" से उठाए गए अनबाउंड फेज का उपयोग करके 3.3.3 से 3.3.8 चरणों का पालन करें।
  4. सकारात्मक रूप से चयनित नैनोबॉडीका एल्यूशन
    1. 100 मीटर ट्रिथाइलमाइन के 450 माइक्रोन जोड़कर एंकर बाइंडर-लिगामेंट कॉम्प्लेक्स के लिए बाध्य किए गए फेज को एलिट करें, और 10 मिन के लिए एक रोटेटर पर आरटी पर इनक्यूबेटिंग करें।
    2. प्रतिस्पर्धी रूप से लट-जो हुए फेज ों को एकत्र करें और चरणों का पालन करें 3.4.1 से 3.4.2 तक।
  5. डामरीकरण बांधने की मशीन चयन के आगे दौर
    1. चयन के आगे के दौर को करने के लिए पुस्तकालय को बढ़ाना और ठीक करने के लिए चरण 3.5 और 3.6 का पालन करें। 3-6 राउंड के लिए या वांछित संवर्धन के लिए चयन के दौर दोहराएं। लक्ष्य के प्रति उनकी आत्मीयता और विशिष्टता को चित्रित करने के लिए प्लेट और एकल क्लोन (धारा 4 को संदर्भित करें) चुनें।

9. एलिसा द्वारा डिमराइजेशन बाइंडर लक्षण वर्णन

  1. एलिसा के माध्यम से लक्षण वर्णन के लिए व्यक्तिगत क्लोन को अलग करने के लिए धारा 4 में चरणों का पालन करें।
  2. एंकर बाइंडर-लिगामेंट कॉम्प्लेक्स में डिमराइजेशन बाइंडर उम्मीदवारों की आत्मीयता का परीक्षण करने के लिए, एलिसा लक्ष्य प्लेट को 100 एनएम बायोटिनेटेड एंकर बाइंडर के 100 माइक्रोन का उपयोग करके कोट करें। 1 घंटे के लिए ऊष्मायन के बाद, लंगर बांधने की मशीन-लिगामेंट कॉम्प्लेक्स बनाने के लिए लिगामेंट टारगेट का 1 माइक्रोन जोड़ें।
  3. नियंत्रण प्लेट को अकेले बायोटिनेटेड एंकर बाइंडर का उपयोग करके क्लोन को स्क्रीन करने के लिए लेपित किया जाना चाहिए जो मुफ्त एंकर बांधने की मशीन से भी बांध सकते हैं। 1 घंटे के लिए आरटी पर 100 एनएम बायोटिनेटेड एंकर बाइंडर और इनक्यूबेट के 100 माइक्रोन जोड़ें।
  4. धारा5.3-5.7 का पालन करें।

10. BLI द्वारा डामरीकरण बांधने की मशीन लक्षण वर्णन

  1. एंकर बाइंडर-लिगामेंट कॉम्प्लेक्स के लिए डिमराइजेशन बाइंडर्स की बाध्यकारी आत्मीयता और काइनेटिक्स का विश्लेषण बाध्यकारी परख बफर के साथ स्ट्रेप्टाविडिन (एसए) बायोसेंसर पर बायोटिनी डिमराइजेशन बाइंडर्स को स्थिर करके किया जा सकता है और फिर लिगांड के धारावाहिक कमजोरियों के साथ 1 μM एंकर बाइंडर पूर्व-संतुलन के साथ पहुंचाया जाता है। केडी, कश्मीरपरऔर बातचीत के कश्मीरबंद हमारी रिपोर्ट विधि19का उपयोग कर गणना की जा सकती है ।

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Representative Results

हम एक लक्ष्य के रूप में सीबीडी का उपयोग कर के 109 से अधिक विविधता के साथ संयोजन नानोन लाइब्रेरी की स्क्रीनिंग करके एंकर और डिमराइजेशन बाइंडर्स के दो-चरण का वर्णन करते हैं। एंकर और डामरीकरण दोनों बांधने वालों के लिए चयन के लगातार दौर के दौरान फाज बायोपैनिंग के संवर्धन का आकलन महत्वपूर्ण है। चयन के 4-6 दौर के बाद विशिष्ट संवर्धन परिणाम के रूप में चित्रा 5 में दिखाया गया है एक अच्छा संकेत है कि वहां उपपुस्तकालयों में संभावित हिट का एक उच्च अनुपात है, तो चयन के आगे दौर आवश्यक नहीं हो सकता है ।

एकल क्लोन एलिसा एंकर और डामरीकरण बांधने वालों की सापेक्ष बाध्यकारी आत्मीयता और चयनात्मकता का विश्लेषण करने के लिए उपयुक्त है। चित्रा 6ए बायोपैनिंग के छह राउंड के बाद रिप्रेजेंटेटिव एंकर बाइंडर सेलेक्शन रिजल्ट है। उच्च (जैसे, #87) या कम (जैसे, #27) लिगामेंट चयनात्मकता दिखाने वाले क्लोन की तुलना की जा सकती है। उच्च चयनात्मकता क्लोन को एंकर बाइंडर उम्मीदवार के रूप में चुना जाना चाहिए। इसी तरह, चित्रा 6बी बायोपैनिंग के चार दौर के बाद डिमराइजेशन बाइंडर चयन परिणाम दिखाता है। हम आम तौर पर क्लोन है कि केवल लिगांड (जैसे, #49) या बिना (जैसे, #80) के साथ स्थिर लंगर बांधने की मशीन के साथ एक विषमताका गठन मनाया । पूर्व, डामरीकरण विशिष्टता दिखा रहा है, आगे सत्यापन के लिए चुना जाना चाहिए ।

एंकर बाइंडर एलिसा बायोटिनेटेड लक्ष्य के उपयोग पर निर्भर करता है। इस प्रकार, हमें गैर-लेबल वाले लक्ष्य के लिए बाध्यकारी की पुष्टि करने के लिए BLI का उपयोग करने की आवश्यकता है । BLI बाध्यकारी गतिज के लक्षण वर्णन की भी अनुमति देता है। एंकर और डामरीकरण बांधने वालों के प्रतिनिधि BLI परिणाम क्रमशः चित्रा 7ए और 7 Bमें दिखाए जाते हैं। बाएं पैनल लिगामेंट एकाग्रता पर निर्भर बाध्यकारी दिखाते हैं, जिससे यह सुझाव दिया जाता है कि वे सीआईडी प्रणाली के निर्माण के लिए उपयुक्त हैं। सही पैनल नकारात्मक नियंत्रण दिखाते हैं। लिगांड की उपस्थिति में एंकर और डिमराइजेशन बाइंडर इंटरैक्शन की गणना केडी आमतौर पर दो अंकों के नैनोमोलर से लेकर दो अंकों के माइक्रोमोलर तक होती है। वे लिगामेंट और पसंद के संयोजन पुस्तकालय के आधार पर भिन्न हो सकते हैं।

एंकर और डामरीकरण बांधने वालों के बीच विषमता के गठन की पुष्टि करने के लिए विश्लेषणात्मक आकार-अपवर्जन क्रोमेटोग्राफी (एसईसी) का प्रदर्शन किया गया था। एक डामरीकरण चोटी देखी गई जब एंकर और डामरीकरण बाइंडर्स और सीबीडी मिश्रित थे(चित्रा 8ए,लाल रेखा)। इसके विपरीत, सीबीडी(चित्रा 8ए,ब्लू लाइन) की अनुपस्थिति में कोई डिमराइजेशन पीक नहीं पाया गया था या जब प्रत्येक बांधने की मशीन अकेले कॉलम(चित्रा 8बी)पर लोड की गई थी। रासायनिक क्रॉसलिंकिंग का उपयोग सीआईडी परिसरों को स्थिर करने के लिए किया गया था, और क्रॉसलिंक्ड नैनोबॉडीने पहले की चोटियों के अनुरूप आकार में थोड़ा वृद्धि की है।

Figure 1
चित्रा 1: रासायनिक रूप से प्रेरित प्रोटीन डामरीकरण का तंत्र। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: एक सिंथेटिक naकोई कॉम्बिनेटर लाइब्रेरी की पीढ़ी की योजनाबद्ध । पुस्तकालय का निर्माण एक सार्वभौमिक नानोपाड़ पाड़ का उपयोग करके और एक ट्रिन्यूक्लियोटाइड मुताजेनेसिस (ट्रिम) प्रौद्योगिकी 24द्वारा तीन पूरक निर्धारण क्षेत्रों (सीडीआर) में प्रत्येक यादृच्छिक स्थिति में अमीनो एसिड के डिजाइन वितरण को शामिल करके किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: (ए) एंकर और (बी) डिमराइजेशन बाइंडर स्क्रीनिंग का फ्लोचार्ट । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: जोड़ती-सीआईडी की समयरेखा । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: एंकर बाइंडर चयन के लिए बायोपैनिंग के प्रत्येक दौर के बाद phage टिटर का संवर्धन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6: प्रतिनिधि एलिसा सकारात्मक (+) और नकारात्मक (*) क्लोन दिखा परिणाम । (A)एंकर बाइंडर एलिसा चयन के छह दौर के बाद ९६ बेतरतीब ढंग से उठाया क्लोन से परिणाम । (ख)डिमराइजेशन बाइंडर एलिसा चयन के चार दौर के बाद ९६ बेतरतीब ढंग से चुने गए क्लोन के परिणाम । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्रा 7: BLI द्वारा लंगर और डामरीकरण बांधने की मशीन काइनेटिक विश्लेषण । (A)अवेलेबल सीबीडी (बाएं) और टीएचसी (दाएं) के साथ एंकर बाइंडर का विश्लेषण । बायोटिनेटेड एंकर बाइंडर को सीबीडी की विभिन्न सांद्रता के साथ सुपर स्ट्रेप्टाविडिन (एसएसए) बायोसेंसर पर स्थिर किया गया था। सीबीडी बाध्यकारी (लाल घटता) के लिए मापा डेटा विश्व स्तर पर फिट (ग्रे लाइनों) थे । (ख)बाएं, एक एसए बायोसेंसर-स्थिर डिमराइजेशन बाइंडर का विश्लेषण जो एंकर बाइंडर को बाध्यकारी है, जो सीबीडी की विभिन्न सांद्रता के साथ पहले से ही है । ठीक है, लंगर बांधने की मशीन एकाग्रता titrated और सीबीडी की अनुपस्थिति में स्थिर dimerization बांधने की मशीन के लिए बाध्य किया गया था । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 8
चित्रा 8: एंकर और डामरीकरण बांधने वालों के बीच विषमता का एसईसी विश्लेषण। (क)सीबीडी की उपस्थिति या अनुपस्थिति में डामरीकरण और एंकर बाइंडर्स (प्रत्येक 5 माइक्रोन) को विश्लेषण से पहले आरटी में 30 मिन के लिए 100 माइक्रोएम बीआईएस-एन-सुसिनीमिडिल-(पेंटेथलीन ग्लाइकोल) एस्टर द्वारा क्रॉसलिंक किया गया था । प्रोटीन मानकों की एल्यूशन मात्रा त्रिकोण द्वारा चिह्नित की जाती है। (ख)गैर-क्रॉसलिंक्ड एंकर और डामरीकरण बाइंडर्स (प्रत्येक 30 माइक्रोन) को अलग से इंजेक्ट किया गया था । ए और बी में क्रोमेटोग्राम अलग-अलग वाई तराजू में दिखाए जाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

बायोपैनिंग के विभिन्न दौरों के लिए इनपुट फाज पुस्तकालयों की सही सांद्रता का चयन करना महत्वपूर्ण है। हम आम तौर पर एक विविधता और gt;109के साथ ~ 1012-1013 phage कणों के एक इनपुट पुस्तकालय से शुरू किया, प्रत्येक phage क्लोन की ~100-1,000 प्रतियां पुल-नीचे परख में प्रस्तुत करने की अनुमति । यदि बाध्यकारी परख में फाग एकाग्रता बहुत अधिक या कम है, तो सकारात्मक क्लोन के गैर-विशिष्ट बाध्यकारी या हानि की संभावना बढ़ जाएगी। एंकर या डामरीकरण बांधने की मशीन चयन में आम तौर पर बायोपैनिंग के तीन से छह राउंड होते हैं, और आउटपुट फेज मायने रखता है आमतौर पर ~ 104 से शुरू होता है और ~ 108-109तक बढ़ जाता है। इस तरह के संवर्धन को देखने के बाद एलिसा सत्यापन के लिए एकल क्लोन चुनना उपयुक्त है। बायोपैनिंग के अतिरिक्त दौर उपयुक्त कम बहुतायत सकारात्मक क्लोन की पहचान करने की संभावना को कम कर सकते हैं।

चयन की सफलता को बढ़ाने के लिए उपयुक्त नकारात्मक नियंत्रण और चयन स्थापित करना महत्वपूर्ण है। उदाहरण के लिए, लिगामेंट लक्ष्यों के संरचनात्मक अनुरूपों के उपयोग से लिगामेंट विशिष्टता के चयन में आसानी होगी। हमारे काम में, एक अत्यधिक समान एनालॉग, टीएचसी, एलिसा में सीबीडी के लिए नियंत्रण के रूप में उपयोग किया गया था और एंकर और डिमराइजेशन बाइंडर्स19के BLI सत्यापन। डिमराइजेशन बाइंडर चयन में, यदि एंकर बाइंडर्स में अपेक्षाकृत कम लिगामेंट और बाध्यकारी आत्मीयता है, तो सकारात्मक चयन में मुफ्त और लिगामेंट-बाउंड एंकर दोनों को लक्ष्य के रूप में प्रस्तुत किया जा सकता है। इस प्रकार, नकारात्मक चयन के दौरान मुक्त एंकर बाइंडर्स को बांधने वाले बांधने वालों को अच्छी तरह से हटाना महत्वपूर्ण है। यह मुफ्त एंकर बांधने के साथ घटाव के कई दौर प्रदर्शन करके प्राप्त किया जा सकता है।

हमारे प्रोटोकॉल की एक सीमा यह है कि लक्ष्य अणुओं को एंकर बाइंडर चयन के लिए बायोटिनेटेड करने की आवश्यकता है और डामरीकरण चयन के लिए केवल एक या कुछ एंकर बाइंडर्स का उपयोग किया जा सकता है। बायोटिनी लक्ष्यों का उपयोग बाइंडर्स को समृद्ध कर सकता है जो आंशिक रूप से बायोटिन और लक्ष्यों के बीच लिंकर से बांधते हैं। इस प्रकार, BLI या अन्य तकनीकों द्वारा अलेबल लक्ष्यों का उपयोग करके हिट को मान्य करना महत्वपूर्ण है। डिमराइजेशन बाइंडर चयन के लिए एक एकल या कुछ एंकर बाइंडर्स का चयन उपयुक्त संवेदनशीलता और विशिष्टता के साथ सीआईडी सिस्टम की पहचान करने की संभावना को कम कर सकता है। इस प्रकार, चयन की मल्टीप्लेक्सिंग क्षमता अन्य तकनीकों में युग्मन द्वारा और सुधार का इंतजार कर रही है- उदाहरण के लिए, एकल-आणविक-इंटरैक्शन अनुक्रमण (एसएमआई-एसईक्यू) जो "लाइब्रेरी-बाय-लाइब्रेरी" प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन स्क्रीनिंग25को सक्षम बनाता है।

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Disclosures

इस काम से संबंधित एक अनंतिम पेटेंट वाशिंगटन विश्वविद्यालय द्वारा दायर किया गया है ।

Acknowledgments

इस काम को वाशिंगटन नवाचार पुरस्कार विश्वविद्यालय (एलजी को) द्वारा समर्थित किया गया था, जो अमेरिका के राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों (1R35GM128918 से L.G.) से अनुदान, और वाशिंगटन विश्वविद्यालय (एलजी के लिए) का एक स्टार्टअप फंड है । एचजे को वाशिंगटन रिसर्च फाउंडेशन की स्नातक फैलोशिप का समर्थन मिला । केडब्ल्यू को यूनिवर्सिटी ऑफ वाशिंगटन इंस्टीट्यूट फॉर प्रोटीन डिजाइन से स्नातक फेलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-Step Ultra TMB ELISA substrate solution Thermo Fisher Scientific 34029
Agar Thermo Fisher Scientific BP1423-2
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter unit (3 kDa cutoff) Millipore UFC900324
Ampicillin Thermo Fisher Scientific BP1760-25
Bio-Rad Protein Assay Kit II Bio-Rad 5000002
BirA biotin-protein ligase standard reaction kit Avidity BirA500
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A2153-50G
Casein Sigma-Aldrich C7078-1KG
CM13 Helper phage Antibody Design Labs PH020L
D-(+)-Glucose monohydrate Alfa Aesar A11090
Dynabeads M-280 Streptavidin Thermo Fisher Scientific 11205D
DynaMag-2 Magnet Thermo Fisher Scientific 12321D
EDTA Thermo Fisher Scientific BP120-1
Fast DNA Ladder New England Biolabs N3238S
FastDigest BglI Thermo Fisher Scientific FD0074
Glycerol Thermo Fisher Scientific BP229-1
HiLoad 16/600 Superdex 200 pg GE Healthcare 28989335
HiPrep 26/10 Desalting Column GE Healthcare 17508701
HisTrap-FF-1ml GE Healthcare 11000458
Imidazole Alfa Aesar 161-0718
IPTG Thermo Fisher Scientific 34060
Kanamycin Thermo Fisher Scientific BP906-5
M13 Major Coat Protein Antibody Santa Cruz Biotechnology sc-53004
NaCl Sigma-Aldrich S3014-500G
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers Thermo Fisher Scientific ND-2000
Nunc 96-Well Polypropylene DeepWell Storage Plates Thermo Fisher Scientific 260251
Nunc MaxiSorp Thermo Fisher Scientific 44-2404-21
Octet RED96 ForteBio N/A
pADL-23c Phagemid Vector Antibody Design Labs PD0111
PEG-6000 Sigma-Aldrich 81260-1KG
Platinum SuperFi DNA Polymerase Invitrogen 12351010
PureLink PCR Purification Kit Thermo Fisher Scientific K310001
QIAprep Spin M13 Kit Qiagen 27704
Recovery Medium Lucigen 80026-1
SpectraMax Plus 384 Molecular Devices N/A
Sucrose Sigma-Aldrich S0389-1KG
Super Streptavidin (SSA) Biosensors ForteBio 18-5057
Superdex 75 increase 10/300 GL Column GE Healthcare 28-9909-44
T4 DNA Ligase Thermo Fisher Scientific 15224-025
TG1 Electrocompetent Cells Lucigen 60502-1
Triethylamine Sigma-Aldrich 471283-100mL
Trizma Base Sigma-Aldrich T1503
Tryptone Thermo Fisher Scientific BP9726-5
Tween 20 Thermo Fisher Scientific BP337-500
Yeast Extract Thermo Fisher Scientific BP1422-2
Zeba Spin Desalting Column Thermo Fisher Scientific 89882

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References

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एक संयोजन एकल डोमेन एंटीबॉडी लाइब्रेरी के स्टेपवाइज फाग चयन द्वारा अत्यधिक विशिष्ट रासायनिक प्रेरित प्रोटीन डामरीकरण सिस्टम बनाना
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Gomez-Castillo, L., Watanabe, K., Jiang, H., Kang, S., Gu, L. Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library. J. Vis. Exp. (155), e60738, doi:10.3791/60738 (2020).

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