Summary
Descrevemos a aplicação de um analisador de fluxo extracelular para monitorar as mudanças em tempo real na glicolyse e fosforilação oxidativa durante a capacitação do esperma do rato.
Abstract
O esperma mamífero adquire a capacidade da fecundação no intervalo reprodutivo fêmea em um processo conhecido como a capacitação. Os processos associados à capacitação requerem energia. Ainda há um debate em curso sobre as fontes que geram o ATP que alimenta a motilidade progressiva do esperma, a capacitação, a hiperativação, e a reação acrógrada. Aqui, descrevemos a aplicação de um analisador de fluxo extracelular como uma ferramenta para analisar as mudanças no metabolismo energético durante a capacitação do esperma do rato. Usando h+- e O2- fluoroforres sensíveis, este método permite monitorar a glicolíse e a fosforilação oxidativa em tempo real em espermatozóides não capacitados versus capacitados. Usar este ensaio na presença de diferentes substratos energéticos e/ou ativadores farmacológicos e/ou inibidores pode fornecer insights importantes sobre a contribuição de diferentes vias metabólicas e a interseção entre sinalização de cascatas e metabolismo durante a capacitação do esperma.
Introduction
A aplicação da espectrometria de massa revolucionou o estudo do metabolismo. Perfil metabólico direcionado e rastreamento metabolômico permitem monitoramento preciso das mudanças no metabolismo energético. No entanto, a realização de metabolômica saem com sucesso requer treinamento extensivo, pessoal experiente e espectrômetros de massa caros e altamente sensíveis não prontamente disponíveis para todos os laboratórios. Nos últimos anos, usando um analisador de fluxo extracelular, como o Seahorse XFe96 tem crescido popular como um método substituto para medir as mudanças no metabolismo energético em vários tipos de células1,2,3,4,5.
Os espermatozóides são células motil altamente especializadas; cuja tarefa é entregar o genoma paterno ao ócito. O esperma que sae do intervalo reprodutivo masculino após a ejaculação é ainda funcional imaturo e não pode fertilizar o oócito porque são incapazes de penetrar as vestes dos oócitos. O esperma adquire a competência da fecundação enquanto transitam através do intervalo reprodutivo fêmea em um processo da maturação sabido como a capacitação6,7. Esperma ou esperma recém-ejaculado dissecado do epididímos cauda podem ser capacitados in vitro por incubação em meios de capacitação definido contendo Ca2+,bicarbonato (HCO3-) ou um analógico de axigônta permeável celular (por exemplo, dibutyryl-cAMP), um aceitador de colesterol (por exemplo, albumina de soro bovina, BSA) e uma fonte de energia (por exemplo, glicose). Durante a capacitação, o esperma modifica seu padrão de motilidade em uma batida flagelar assimétrica, representando um modo de natação chamado hiperativação8,9,e eles se tornam competentes para se submeter à reação acrosome7, onde enzimas proteolíticas são liberados que digerem os vestments dos oócitos. Estes processos requerem energia, e semelhante sasmáticas, espermatozóides geram ATP e outros compostos de alta energia através da glicolíse, bem como ciclo de TCA mitocondrial e fosforilação oxidativa (oxphos)10. Enquanto vários estudos demonstram que a glicolyse é necessária e suficiente para suportar a capacitação deespermatozóides 11,12,13,14, a contribuição do oxphos é menos clara. Ao contrário de outros tipos de células onde a glicolíse é fisicamente acoplado ao ciclo tca, espermatozóides são altamente compartimentados e são pensados para manter esses processos em compartimentos flagelar separados: o midpiece concentra a maquinaria mitocondrial, enquanto as enzimas-chave da glicolíse parecem ser restritas à peça principal15,16. Esta compartimentação resulta em um debate em curso sobre se o piruvato produzido na peça principal por glicolíse pode suportar oxphos mitocondrial no meio, e se ATP produzido por oxphos no midpiece seria capaz de difundir suficientemente rapidamente ao longo do comprimento do flagellum para suportar as necessidades energéticas em partesdistaisda peça principal 17,18,19. Há também o apoio de um papel para o oxphos na capacitação de espermatozóides. Não só o oxphos é mais favorável do que a glicolíse, gerando 16 vezes mais ATP do que a glicolíse, mas o volume médio e o conteúdo mitocondrial estão diretamente correlacionados com a aptidão reprodutiva em espécies de mamíferos que apresentam maiores graus de competição entre os machos para os companheiros20. Abordar essas questões requer métodos para examinar as contribuições relativas de glicolíse e oxphos durante a capacitação do esperma.
Tourmente et al. aplicaram um analisador de fluxo extracelular de 24 poços para comparar o metabolismo energético de espécies de camundongos intimamente relacionadas com parâmetros de desempenho deesperma21significativamente diferentes. Em vez de relatar os valores basal de ECAR e de OCR do esperma non-capacitated, aqui, nós adaptamos seu método usando um analisador extracelular do fluxo de 96 poços para monitorar mudanças no metabolismo de energia durante a capacitação do esperma do rato no tempo real. Desenvolvemos um método que permite monitorar simultaneamente a glicolíse e o oxphos em tempo real em espermatozóides com flagela batendo em até doze condições experimentais diferentes, medindo o fluxo de oxigênio (O2)e prótons (H+) (Figura 1A). Devido à quebra de piruvato para lactato durante a glicolíse e a produção de CO2 através do ciclo TCA, espermatozóides não capacitados e capacitados extrude H+ nos meios de ensaio que são detectados pelo analisador de fluxo extracelular via H+fluorofosfos sensíveis imobilizados para a ponta da sonda de um cartucho de sensor. Em paralelo, o consumo de O2 por fosforilação oxidativa é detectado via O2-fluorofóbicos sensíveis imobilizados até a mesma ponta da sonda (Figura 1B). A detecção eficaz do H+ liberado e consumiu O2 requer um amortecedor de esperma modificado com baixa capacidade de tampão sem bicarbonato ou fenol vermelho. Assim, para induzir a capacitação na ausência de bicarbonato, adotamos o uso de um analógico de cAMP permeável celular injetado juntamente com o inibidor de PDE de ampla gama IBMX22. Três portos de injeção independentes adicionais permitem a injeção de ativadores farmacológicos e/ou inibidores, o que facilita a detecção em tempo real de alterações na taxa de respiração celular e glicolíse devido à manipulação experimental.
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Protocol
Os espermatozóides são coletados de 8-16 semanas de idade CD-1 ratos machos. Experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Weill Cornell Medicine.
1. Dia antes do ensaio
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Preparação do cartucho do sensor e do calibrador extracelular do analisador do fluxo
- Para hidratar o cartucho do sensor, retire o cartucho do sensor do Kit de Ensaio de Fluxo Extracelular XFe96 e coloque o cartucho de sensor de cabeça para baixo ao lado da placa de serviço público.
- Preencha um reservatório de solução com 25 mL de H2O com destilação dupla usando uma pipeta multicanal, adicione 200 μL de H2O a cada poço da placa de serviço público. Coloque o cartucho de sensor de volta para a placa de serviço público e incubar durante a noite em uma incubadora de 37 °C não-CO2.
NOTA: Cartucho precisa ser hidratado por pelo menos 4 h. - Aliquot 25 mL do calibrador de analisador de fluxo extracelular em um tubo cônico de 50 mL e incuba-lo durante a noite em uma incubadora de 37 °C não-CO2.
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Preparação de microplacas revestidas de
- Dissolva 2,5 mg de em 5 mL de H2O de destilação dupla para preparar um estoque de 0,5 mg/mL (w/v).
- Usando uma pipeta multicanal, preencha cada poço de uma placa de fluxo extracelular de 96 poços com 50 μL da solução 0,5 mg/mL Con A. Deixe a tampa aberta e deixe a placa secar durante a noite à temperatura ambiente.
NOTA: Várias placas podem ser revestidas de uma só vez e armazenadas a 4 °C por até quatro semanas até que estejam prontas para uso.
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Preparação do amortecedor do esperma
- Prepare 250 mL de buffer de fluxo extracelular TYH com baixo HEPES contendo 138 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,7 mM CaCl2,1,2 mM KH2PO4, 1,2 mM MgSO4,5,6 mM glicose e 1 mM HEPES. Aqueça o buffer a 37 °C e ajuste o pH para 7,4.
2. Dia do ensaio
- Preparação para calibração de cartuchos
- Substitua o H2O na placa de serviço público com 200 μL de calibrante XF por poço e incubar por pelo menos 1 h em uma incubadora não-CO2 37 °C.
NOTA: Em vez de calibrante, estéril filtrado PBS, pH 7.4 pode ser usado. - Aqueça 50 mL de tampão TYH a 37 °C.
- Substitua o H2O na placa de serviço público com 200 μL de calibrante XF por poço e incubar por pelo menos 1 h em uma incubadora não-CO2 37 °C.
- Gerando um modelo de onda para o analisador de fluxo extracelular
- Ligue o analisador de fluxo extracelular e permita que a temperatura se estabilize para 37 °C.
- Abra o software de onda e projete um novo modelo abrindo um modelo em branco (ver Arquivo Suplementar 1,modelo de onda).
- Abra a guia de definições do Grupo. Definir a mídia de ensaio como TYH; pH 7.4 e tipo de célula como esperma toque de rato, deixar estratégias de injeção e pré-tratamentos em branco. Criar diferentes grupos para cada condição de ensaio; neste exemplo, existem 6 grupos diferentes (TYH, TYH + db-cAMP/IBMX, 2-DG, 2-DG + db-cAMP/IBMX, Ant/Rot, Ant/Rot + db-cAMP/IBMX); dibutyryl cAMP (db-cAMP) e 3-Isobutyl-1-metilxanthine (IBMX) para induzir a capacitação, 2-deoxiglucose (2-DG) como inibidor de glicolíse, antimicina A (antA) e rotenone (rot) como inibidor do complexo III e complexo I da cadeia de transporte de elétrons.
NOTA: Para explicar a variabilidade entre poços, pelo menos 7-8 poços por condição devem ser medidos em paralelo. - Abra a aba do mapa placa e defina o mapa da placa, atribuindo grupos para poços específicos.
NOTA: Os quatro poços de canto (A1, A12, H1, H12) serão preenchidos com tampão TYH (sem esperma) e mais tarde serão usados para subtração de fundo. - Abra a aba Protocol, adicione 4 ciclos de medição diferentes, selecione a respectiva porta e eite os detalhes de medição(Figura 2, Tabela 1). Destaque medida após injeção e não destacar o equilíbrio.
- Salve o modelo de ensaio, preencha o resumo do projeto e defina o local de economia para o arquivo de resultados.
- Preparação de compostos para carregar em cartucho de sensor
- Prepare 2 mL de 50 mM db-cAMP dissolvendo 9,8 mg de composto no buffer TYH e adicione o IBMX a uma concentração final de 5 mM.
NOTA: IBMX tem a tendência precipitar depois de ser diluído no buffer TYH. Os precipitados podem ser dissolvidos por vórtice e incubação da solução TYH/db-cAMP/IBMX em um bloco de calor de 37 °C por 5 min. - Prepare 1 mL de 500 mM 2-DG dissolvendo 82,1 mg de composto no tampão TYH.
- Prepare 1 mL de 5 μM de AntA/Rot diluindo ambas as drogas no buffer TYH.
NOTA: Os compostos são diluídos 10 vezes por injeção no cartucho de analisador de fluxo extracelular; portanto, certifique-se de que as soluções de injeção são 10x mais concentradas.
- Prepare 2 mL de 50 mM db-cAMP dissolvendo 9,8 mg de composto no buffer TYH e adicione o IBMX a uma concentração final de 5 mM.
- Isolamento do esperma do rato
- Anestesie 3 camundongos machos entre 8 e 16 semanas por isoflurano e sacrificar os ratos por deslocamento cervical após nenhuma resposta ao dedo do dedo do dedo do sexo foi detectado. Retire os epididimides cauda e vasa deferentia.
- Coloque cada cauda em 500 μL de tampão TYH pré-aquecido em 24 bem placa, imobilizar o cauda para o fundo da placa usando um par de fórceps e abra o tecido, fazendo 5-7 pequenas incisões com tesoura de penas.
- Transfira a placa imediatamente em uma incubadora não-CO2 37 °C e deixe o esperma dispersar por 15 min.
- Carregamento do cartucho do sensor
- Dois guias de carregamento portuário para o porto A e D e porto B e C são fornecidos no kit Extracellular Flux. Para carregar uma porta específica, retire a tampa do cartucho do sensor e alinhe a letra do respectivo guia de carregamento da porta com o canto superior esquerdo do cartucho. Ao injetar, use as pontas dos dedos da mão não injetando para manter o guia de carregamento do porto no lugar e inserir as pontas da pipeta verticalmente nos buracos de guia de carregamento do porto.
- Porto A: Usando uma pipeta multicanal, injete 20 μL do buffer TYH em cada coluna.
- Porto B: Injetar 22 μL de buffer TYH na coluna 1-4, injetar 22 μL de 500 mM 2-DG na coluna 5-8, e 25 μL de 5 μM AntA/Rot na coluna 9-12.
- Port C: Injetar 25 μL de buffer TYH em cada coluna com números ímpares, injetar 25 μL de 10 mM db-cAMP/ 500 μM IBMX em cada coluna com números pares.
- Coloque o cartucho de sensor com a placa de calibração no analisador de fluxo extracelular e inicie o ensaio. A calibração leva de 10 a 15 min.
- Preparação de placas de esperma
- Dissolva 45 mg de BSA em 15 mL de tampão TYH (3 mg/mL w/v) e prepare três alíquotas de 3 mL BSA/TYH solução cada um em 5 mL tubos de centrífuga.
- Combine dois poços de esperma cada um em um tubo de centrífuga de 1,5 mL, conte o esperma usando um hematocitometro e diluir o esperma a uma concentração de 2 x 107 esperma/mL.
NOTA: Use pontas da pipeta do corte para pipetting o esperma para evitar danificar as pilhas. - Centrífuga o esperma para 3 min em 700 x g, remover o supernatant e adicionar 1 mL de tyh buffer. Repita a etapa centrífuga, retire o supernatant, e transfira cada alíquota da suspensão do esperma em um tubo de centrífuga de 5 mL com 3 mL de BSA/TYH.
- Coloque 180 μL de tampão TYH em cada poço de canto (A1, A12, H1, H12) de uma placa revestida de. Coloque 180 μL de suspensão de esperma em cada poço vazio da placa revestida de (1,2 x 106 espermatozóides/poço).
- Centrífuga a placa de esperma em 250 x g para 1 min, gire a placa por 180°, e centrífuga outra vez em 250 x g para 1 min (a taxa de travagem a mais baixa 1).
- Retire a placa de calibração do analisador de fluxo extracelular e adicione o prato de esperma. Continue o ensaio.
- Extração e análise de dados
- Depois de terminar o ensaio, remover o cartucho, abrir o arquivo de resultados, clique na guia Export e exportar a execução concluída como um arquivo Prism GraphPad(Arquivo Suplementar 2:Dados de exemplo primário usado para a Figura 3).
- Duplicar o arquivo ECAR e OCR clicando na nova guia e, em seguida, a família duplicada ... guia (Figura 3A).
- Excluir as primeiras 7 linhas de dados(Figura 3B).
- Normalizar para o ponto de dados antes da injeção de cAMP/IBMX por linha de base subtraindo a linha 1. Clique na aba Analisar e, em seguida, na lista de matemática remove de linha de base e coluna. Destaque a linha selecionada (s): Primeira Linha, Cálculo: Relação:Valor/Linhade Base e Subcolunas: Ignore a Subcoluna. Clique OK (Figura 3C).
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Representative Results
Este método usa um analisador de fluxo extracelular para monitorar mudanças em tempo real na taxa de glicolíse e oxphos durante a capacitação de espermatozóides do mouse. A figura 4 mostra um experimento exemplar em que o esperma foi capacitado na presença de glicose como o único substrato de energia e 2-DG e antimicina e rotenone como moduladores farmacológicos. O substrato de energia no amortecedor TYH do analisador de fluxo extracelular e os moduladores farmacológicos podem ser selecionados livremente dependendo do objetivo do experimento. O esperma não capacitado do rato em BSA/TYH foi unido à parte inferior de um microchamber transiente ConA-revestido através de sua cabeça. Neste exemplo, os valores basal de ECAR e o OCR, em média, entre todos os poços detectados foram de 12,76 ± 2,75 mpH/min e 23,64 ± 2,78 pmol/min, respectivamente.
Após uma injeção simulada com tampão TYH, seguida pela injeção de 2 DG e formiga/podridão para inibir a glicolítico e a fosforilação oxidativa, respectivamente, a capacitação do esperma foi induzida pela injeção de db-cAMP/IBMX.
Os resultados representativos mostram que, na presença de glicose, a capacitação é acompanhada por um aumento de 7 vezes na Taxa de Acidificação Extracelular (ECAR), que é inibida pelo bloqueio da glicolyse com 2-DG (Figura 4A). O esperma capacitado mostra um aumento de 20 vezes na Taxa de Consumo de Oxigênio (OCR) em comparação com o esperma não capacitado (Figura 4B),demonstrando que o esperma de camundongo aumenta tanto a glicodiose quanto a fosforilação oxidativa para suportar a crescente demanda de energia durante a capacitação. O aumento da ECAR durante a capacitação do esperma é inibido pelo inibidor de glicolíse 2-DG, mas não afetado pelos inibidores de fosforilação oxidativa antimiocina A e rotenona (Figura 4C), indicando que a mudança na ECAR é impulsionada principalmente pela liberação H+ de glicolícise. O aumento da OCR é, como esperado, bloqueado pela antimicina A e rotenone(Figura 4D),mas também é inibido por 2-DG (Figura 4B) revelando que o aumento do oxphos durante a capacitação de espermatozóides depende da atividade glicolítica.
Figura 1: Princípio do analisador de fluxo extracelular. (A) Devido à quebra da glicose ao lactato durante a glicolíse e à geração de CO2 através do ciclo tca, as mudanças na glicolíse e no oxphos são acompanhadas por H+ excreção na mídia extracelular. O Analisador XFe96 detecta essas alterações na concentração extracelular de H+ como ECAR. Paralelamente, as alterações na concentração extracelular de O2 devido ao consumo de O2 por fosforia oxidativa são medidas como OCR. O bloqueio da glicolíse com 2 desoxiglicose (2-DG) ou respiração com os inibidores complexos I e complexos III rotenone e antimicina A revela quais vias metabólicas suportam a crescente demanda de energia durante a capacitação do esperma. (B) O esperma do rato é unido através de suas cabeças à parte inferior de um microchamber ConA-revestido; sua flagella estão se movendo livremente. Enquanto as mudanças na concentração extracelular de H+ e O2 são detectadas por H+- e Fluorofóbicos sensíveis ao O2imobilizados para uma sonda de sensor, até quatro compostos diferentes podem ser injetados sequencialmente. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 2: Representação esquemática do experimento exemplar. Mudanças na ECAR (mpH/min) eOCR (pmol O 2/min) são detectadas em espermatozóides não capacitados e capacitados usando um analisador de fluxo extracelular. Ciclo 1: Valores basal de ECAR e OCR. Ciclos 2-5: Estabilização do sistema após injeção simulada tyh. Ciclos 6-8: Incubação de drogas. Ciclos 9-27: Capacitação de esperma. As flechas indicam injeções. 2-DG: concentração final 50 mM, AntA/Rot: concentração final 0.5 μM, db-cAMP: concentração final 1 mM, IBMX: concentração final 500 μM. Por favor clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 3: Análise de dados. (A) Dados brutos de alterações na ECAR durante a capacitação do esperma do rato. (B) Dados após a remoção dos primeiros 7 pontos de dados. (C) Os dados normalizaram até o ponto de dados antes da injeção de cAMP/IBMX. Os dados são mostrados como média de 7-8 poços ± injeções de S.E.M. são indicadas com uma seta. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 4: Alterações na glicocise e fosforilação oxidativa durante a capacitação do esperma do rato. (A) ECAR normalizado no esperma non-capacitated e capacitating do rato na presença e na ausência de 50 mM 2-DG. (B) OCR normalizado em esperma tocos de camundongo sem capacitação e capacitação na presença e ausência de 50 mM 2-DG. (C) ECAR normalizado em esperma toco no camundongo não capacitado e capacitado na presença e ausência de 0,5 μM antimicina A e rotenone. (D) OCR normalizado no esperma não capacitado e capacitating do rato na presença e na ausência de 0.5 μM antimycin A e rotenone. Os dados são mostrados como média ± S.E.M normalizado ao ponto de dados antes da injeção db-cAMP/IBMX; n = 6. As injeções são indicadas com uma seta. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
| Porta | Número de ciclos | Mistura (min) | Espera (min) | Medida (min) | |
| R: Basal ECAR/OCR | sem porto | 1 | 2:00 | 0:00 | 3:00 |
| B: Injeção simulada | 1 | 4 | 2:00 | 0:00 | 3:00 |
| C: Injeção de drogas | 2 | 3 | 2:00 | 0:00 | 3:00 |
| D: Capacitação | 3 | 18 | 2:00 | 0:00 | 3:00 |
Tabela 1: Detalhes de medição.
Figura suplementar 1: Capacitação de espermatozóides de camundongos no amortecedor TYH analisador de fluxo extracelular. Fosforileação de resíduos de tirosina de espermatozóides de camundongo detectados em diferentes momentos durante a capacitação (0 - 90 min) após a incubação em (A) TYH com 25 mM HCO3-, 3 mg/mL BSA e 20 mM HEPES ou em (B) Extracellular flux analyzer TYH com 5 mM db-cAMP, 500 μM IBMX, e 1 mM HEPES, detectado com um anticorpo α-phosphotyrosine. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Arquivo suplementar 1: Modelo de ensaio de onda para detectar alterações na glicolíse e fosforilação oxidativa durante a capacitação do esperma do rato. O software desktop onda pode ser baixado gratuitamente após o preenchimento de um formulário de inscrição(www.agilent.com/en/products/cell-analysis/cell-analysis-software/data-analysis/wave-desktop-2-6)e instalado no Windows 7, 8 ou 10, (Mac OSx 10.11 (ou superior) com Paralelos 12 (ou superior). Assim, modelos de onda podem ser gerados de forma independente do analisador de fluxo extracelular, exportado e depois importado para o software de onda de qualquer analisador de fluxo extracelular. Clique aqui para ver este arquivo (Clique certo para baixar).
Arquivo suplementar 2: Arquivo de prisma de bloco gráfico exportado de software de onda com análise de dados exemplar. Clique aqui para ver este arquivo (Clique certo para baixar).
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Discussion
A perda de capacitação do esperma na ausência de certos substratos metabólicos ou enzimas metabólicas críticas revelou o metabolismo energético como um fator chave que suporta a fertilização bem sucedida. Um interruptor metabólico durante a ativação celular é um conceito bem estabelecido em outros tipos de células, no entanto, estamos apenas começando a entender como o esperma adapta seu metabolismo à crescente demanda de energia durante a capacitação. Usando um analisador de fluxo extracelular, desenvolvemos uma ferramenta facilmente aplicável para monitorar as mudanças na glicolíse e fosforilação oxidativa em tempo real durante a capacitação do esperma. A detecção de alterações no H+ e O2 extracelulares com fluorofóbicos imobilizados para uma sonda de sensor estiveram minimamente invasivas e as quatro portas de injeção operadas individualmente permitem manipulação com inibidores farmacológicos ou ativadores em pontos de tempo distintos antes ou durante o processo de capacitação. Este protocolo dá somente um exemplo de uma experiência da capacitação do esperma do rato. Para simplificar a interpretação dos resultados, escolhemos o show de um experimento exemplar onde a glicose foi usada como única fonte de energia. As condições são variáveis dependendo do objetivo do experimento, e até 12 condições diferentes (ou seja, diferentes fontes de energia como glicose vs glicose e piruvato) podem ser medidas em paralelo. Além disso, quatro portos de injeção independentes permitem a injeção de ativadores farmacológicos e/ou inibidores em qualquer ponto de tempo desejado antes ou durante a capacitação. Isso abre a possibilidade de usar o analisador de fluxo extracelular como um dispositivo de triagem de alta taxa de alta taxa. Similar ao esperma do rato, em outras espécies como o ser humano ou o bovino é ainda enigmático como o esperma muda seu metabolismo durante a capacitação. O protocolo pode ser facilmente adaptado; assim, recomendamos otimizar a concentração de espermatozóides cada vez antes de iniciar um experimento real.
A maior limitação do protocolo é que os resultados de alta qualidade só podem ser alcançados na ausência de bicarbonato. Bicarbonato no fluido seminal é o sinal fisiológico que inicia a capacitação do esperma sinalizando cascata após a ejaculação. Bicarbonato ativa a ciclása adenylyl solúvel (sAC; ADCY10), que catalisa a conversão do ATP em cAMP23. O aumento do cAMP, em seguida, impulsiona uma cascata de sinalização mediada pela Proteína Kinase A, que em última análise, leva à fosforilação de tirosina a jusante de proteínas-alvo (por exemplo, canais de íons, enzimas metabólicas e proteínas estruturais24,25). Essa restrição contra o bicarbonato é superada injetando o produto de sAC ativado por bicarbonato, cAMP. Usamos 5 mM do cAMP analógico db-cAMP permeável em paralelo com o inibidor de fosfolediase de grande especificidade IBMX, o que impede a rápida degradação do db-cAMP por fosfodiasterases. Esta combinação inicia efetivamente a capacitação regulada por cAMP após a ativação do sAC com uma cinética semelhante à bicarbonato(Figura Suplementar 1). Paralelamente ao bicarbonato, um aceitador de colesterol (por exemplo, BSA) é usado para capacitar in vitro esperma ou esperma toquete recém-ejaculado do epididígio cauda. Albumina não pode ser injetado porque obstrui a porta de injeção e, portanto, precisa ser adicionado ao tampão de esperma antes de chapeamento das células. Realizar o experimento na presença ou ausência de BSA revelou que o aumento da ECAR e OCR durante a capacitação do esperma é independente do aceitador de colesterol. No entanto, a presença de BSA no amortecedor de esperma diminuiu as flutuações nos valores detectados de ECAR e OCR entre diferentes poços e experimentos; assim, recomendamos a inclusão de BSA no amortecedor de esperma para aumentar a reprodutibilidade.
Isolar o esperma do epididígio cauda resulta na contaminação do esperma com líquido epidísmico. Para evitar resultados artificiais devido aos componentes fluidos seminais, recomendamos lavar esperma duas vezes antes de usá-los para um experimento. Concentração e revestimento do esperma são um outro fator crítico que determina o sucesso da experiência. Para obter resultados confiáveis, o fabricante recomenda que os valores iniciais de ECAR sejam maiores do que 10 e os valores ocr sejam maiores do que 20. A concentração de espermatozóides utilizadas neste protocolo foi otimizada para que os valores médios basal de ECAR e OCR dos 7-8 poços medidos por condição estejam acima de 10 e 20, respectivamente. O esperma em movimento livre perturba a detecção de mudanças no extracelular H+ e O2. Assim, é crucial aderir a todos os espermatozóides com a cabeça para o fundo da placa. Encontramos sucesso aderindo espermatozóides, revestindo a placa com, uma lectina de plantas que interage especificamente com a membrana acrosômica externa e é comumente usado para ensaios acrosome26, e girando suavemente a placa (ver passo 2.7.3). Com este método, o esperma é localizado à parte inferior do poço unicamente através de sua cabeça assim que podem ainda livremente mover seu flagella e mudar seu teste padrão batendo do flagellar durante a capacitação.
O esperma extrude constantemente H+ e O2 em ambos, o estado não capacitado e capacitado. Para determinar o ECAR inicial e OCR com a maior precisão possível, é crucial para iniciar o experimento o mais rapidamente possível após a última etapa de lavagem. Isto pode ser realizado carregando o cartucho do sensor quando o esperma nadar para fora e começando o método no analisador extracelular do fluxo antes da primeira etapa de lavagem. Calibrar o instrumento leva aproximadamente o mesmo tempo que lavar e chapear as células e girar a placa. O fabricante recomenda uma fase de equilíbrio para permitir que o sistema se estabilize antes que o primeiro ponto de dados real seja medido. Como o protocolo inclui 8 ciclos de medição antes do início da capacitação, para economizar tempo, a etapa de equilíbrio é excluída desse protocolo.
A capacidade de injetar soluções durante o ensaio e observar seus efeitos sobre a respiração e a taxa glicolítica em tempo real é uma característica fundamental do analisador de fluxo extracelular. Carregar o cartucho do sensor é uma das etapas críticas no protocolo e deve ser realizada com cuidado. Para garantir a injeção adequada em todos os poços, cada série de portas precisa conter o mesmo volume, incluindo os poços de fundo. Carregar as portas com uma pipeta multicanal requer alguma prática, mas diminui consideravelmente a variabilidade e o tempo de carregamento. Recomendamos o uso do guia de carregamento do porto, mas para injetar apenas quatro portas simultaneamente. Também é importante perceber que durante o carregamento, os volumes de injeção são gradualmente aumentados para compensar o aumento do volume no poço. Ao carregar o cartucho do sensor, é importante não introduzir inteiramente as pontas na porta. Isso pode empurrar prematuramente a solução de injeção através do orifício do porto. Ao estabelecer o método nós encontramos que injetar o líquido em um poço do esperma causa artifacts indesejáveis da injeção, provavelmente devido à diluição do esperma no poço e/ou deslocando o esperma da parte inferior boa. A primeira injeção causa o maior artefato de injeção, então incluímos uma injeção simulada com tampão de esperma em todos os poços no início do protocolo.
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Disclosures
Os autores não têm nada a divulgar.
Acknowledgments
Os autores desejam reconhecer o apoio do Dr. Lavoisier Ramos-Espiritu no Rockefeller High Throughput and Spectroscopy Resource Center.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| 2-Deoxy-D-glucose | Sigma-Aldrich | D8375 | 2-DG |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I7018 | IBMX; prepare a 500 mM stock solution in DMSO (111.1 mg/ml) and store in small aliquots |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | AntA; prepare a 5 mM stock solution in DMSO (2.7 mg/ml) and store in small aliquots |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A1470 | BSA |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | CaCl2 |
| Concanacalin A, Lectin from Arachis hypogaea (peanut) | Sigma-Aldrich | L7381 | ConA |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| Isothesia | Henry Schein Animal Health | 1169567761 | Isoflurane |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M2643 | MgSO4 |
| N6,2'-O-Dibutyryladenosine 3',5'-cyclic monophosphate sodium salt | Sigma-Aldrich | D0627 | db-cAMP |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | KCl |
| Potassium dihydrogen phosphate | Sigma-Aldrich | P5655 | KH2PO4 |
| Rotenone | Cayman Chemical Company | 13995 | Rot; prepare a 5 mM stock solution in DMSO (2mg/ml) and store in small aliquots |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | NaHCO3- |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | NaCl |
| Equipment and materials | |||
| 12 channel pipette 10-100 μL | eppendorf | ES-12-100 | |
| 12 channel pipette 50-300 μL | vwr | 613-5257 | |
| 37 °C, non-CO2 incubator | vwr | 1545 | |
| 5 mL cetrifuge tubes | eppendorf | 30119380 | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | vwr | 76211-286 | |
| Centrifuge with plate adapter | Thermo Scientific | IEC FL40R | |
| Dissection kit | World Precision Instruments | MOUSEKIT | |
| Inverted phase contrast microscope with 40X objective | Nikon | ||
| OctaPool Solution Reservoirs, 25 ml, divided | Thomas Scientific | 1159X93 | |
| OctaPool Solution Reservoirs, 25 mL, divided | Thomas Scientific | 1159X95 | |
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent | ||
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent | 102416-100 | Also sold as XFe96 FluxPak mini (102601-100) with 6 instead of 18 cartidges. |
References
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