Biochemistry

באמצעות מנתח השטף של מסחטות כדי למדוד שינויים גליקוליזה ו זירחון חמצוני במהלך הזרע העכבר מדרכיכים

Published: January 22, 2020 doi: 10.3791/60815

Melanie Balbach¹, Jochen Buck¹, Lonny R. Levin¹

¹Department of Pharmacology, Weill Cornell Medical College

Summary

אנו מתארים את היישום של מנתח השטף של מסחטות כדי לנטר שינויים בזמן אמת ב גליקוליזיס וזרחון חמצוני במהלך מדרכיכים זרע העכבר.

Abstract

הזרע מקבל קיבולת הפריה במערכת הרבייה הנשית בתהליך המכונה מדרכיכים. תהליכים משויכים למדרכיכים דורשים אנרגיה. קיים דיון מתמשך בנוגע למקורות היוצרים את ה-ATP המזין את הזרע לתנועתיות מתקדמת, מדרכיכים, היפרהפעלה ותגובה מאקרומה. כאן, אנו מתארים את היישום של מנתח השטף מחילוץ ככלי לניתוח שינויים בחילוף החומרים של אנרגיה במהלך מדרכיכים זרע העכבר. באמצעות H⁺-ו O₂-רגישות fluorophores, שיטה זו מאפשרת בניטור גליקוליזיס ו זרחון חמצוני בזמן אמת ב-non-capacitated לעומת הזרע קיבול. שימוש בשיטה זו בנוכחות מצעים אנרגטיים שונים ו/או מפעילים פרמקולוגיים ו/או מעכבי יכולים לספק תובנות חשובות לתרומת מסלולים מטבוליים שונים והצטלבות בין איתות מפלי ומטבוליזם במהלך מדרכיכים זרע.

Introduction

היישום של ספקטרומטר המסה יש מהפכה המחקר של חילוף החומרים. ממוקד פרופיל חילוף החומרים והעקיבה metabolomic לאפשר ניטור מדויק של שינויים בחילוף החומרים באנרגיה. עם זאת, ביצוע טבולומיקס בהצלחה דורש הכשרה נרחבת, צוות מנוסה, ו יקר, ספקטרומטר מסה מאוד רגיש לא זמין לכל מעבדה. בשנים האחרונות, באמצעות מנתח השטף של מסחטות, כגון סוסון ים XFe96 גדל פופולרי כשיטה פונדקאית למדידת שינויים בחילוף החומרים של אנרגיה בסוגי תאים שונים¹^,²^,³^,⁴^,⁵.

זרע הם תאים מיוחדים מאוד משבצת; אשר משימתו היא לספק את הגנום אבהי כדי oocyte. זרע עוזב את מערכת הרבייה זכר לאחר שפיכה הם עדיין בלתי בוגרים מבחינה פונקציונלית ולא ניתן להפרות את oocyte כי הם לא מסוגלים לחדור את הvestments של oocytes. זרע לרכוש יכולת דישון כאשר הם עוברים דרך מערכת הרבייה הנשית בתהליך התבגרות המכונה מדרכיכים⁶^,⁷. הפליטה הטרייה של זרע או זרע בגזור מיותרת הזנב יכול להיות capacitated בחוץ על ידי דגירה באמצעות המדרכיכים מדיה מוגדר המכיל Ca^{2 +}, ביקרבונט (hco₃^-) או מחנה חדיר תאים אנלוגי (למשל, diבוטילטור-מחנה), קבלה כולסטרול (למשל, סרום בשור, bsa), ומקור אנרגיה (למשל, גלוקוז). במהלך המדרכיכים, זרע לשנות את דפוס התנועתיות שלהם לתוך להכות המרצפות אסימטריים, המייצג מצב שחייה שנקרא hyperactivation פעלה⁸^,⁹, והם הופכים להיות מוכשרים כדי לעבור את התגובה האקרוכמה⁷, שם אנזימים פרוטבחרדה שפורסמו כי לעכל את הבאויות של oocytes. תהליכים אלה דורשים אנרגיה, ובדומה לתאים סומטיים, זרע לייצר ATP ותרכובות אנרגיה גבוהות אחרות דרך גליקוליזיס, כמו גם מחזור TCA מיטוכונדריאלי וזירחון חמצוני (oxphos)¹⁰. בעוד מחקרים מרובים מדגימים כי גליקוליזיס הוא הכרחי ומספיק כדי לתמוך זרע מדרכיכים¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴, התרומה של oxphos הוא פחות ברור. בניגוד לסוגי תאים אחרים בהם גליקולזיס משולב פיזית למחזור ה-tca, הזרע ממדר מאוד ונחשבים לשמור על תהליכים אלה בתאי הריצוף הנפרדים: המיחלק מתמקד במכונות המייטוכונדריאלי, בעוד שהאנזימים המרכזיים של גליקוליזה מופיעים כמוגבלים לחלק העיקרי¹⁵^,¹⁶. מידור זה מביא לויכוח מתמשך על האם פירובט המיוצר בחלק העיקרי מאת גליקולזיס יכול לתמוך באוקפוס מיטוכונדריאלי באמצע החלק, והאם ATP המיוצר על ידי oxphos ב-midpiece יוכל לפזר במהירות מספקת לאורך הפלאללום כדי לתמוך בדרישות האנרגיה בחלקים העיקריים של החלק העיקרי של הקרן¹⁷^,¹⁸^,¹⁹. יש גם תמיכה של תפקיד של oxphos במדרכיכים זרע. לא רק האוקפוס יותר מאשר באופן אנרגטי יותר מאשר גליקוליזיס, היוצר פי 16 יותר ATP מאשר גליקוליזיס, אך מידות נפח ותוכן מיטוכונדריאלי מתואמים במישרין עם כושר הרבייה במינים היונקים המוצגים דרגות גדולות יותר של התחרות בין הזכרים לחברים^{בגיל 20}. התייחסות לשאלות אלה מחייבת שיטות לבדיקת התרומות היחסיות של גליקוליזיס ואוקפוס במהלך מדרכיכים זרע.

Tourmente ואח ' להחיל מנתח השטף היטב של ממרור כדי להשוות את חילוף החומרים של האנרגיה של מינים העכבר קשור היטב עם פרמטרים שונים באופן משמעותי ביצועי זרע²¹. במקום לדווח על הערכים ECAR בסיס ו-OCR של זרע non-capacitated, כאן, אנו להתאים את השיטה שלהם באמצעות 96-היטב מנתח השטף לעקוב אחר שינויים בחילוף החומרים של אנרגיה במהלך זרע העכבר מדרכיכים בזמן אמת. פיתחנו שיטה המאפשרת במקביל לניטור גליקוליזיס ו oxphos בזמן אמת בזרע עם הכאת הדגל של עד 12 מצבים ניסיוניים שונים על ידי מדידת שטף של חמצן (O₂) ו פרוטונים (H⁺) (איור 1a). בשל פירוק של פירובט כדי לקטט במהלך גליקוליזיס וייצור של CO₂ באמצעות tca-מחזור, non-capacitated ו capacitated זרע הבלטה⁺ לתוך מדיה היכולת אשר מזוהים על ידי מנתח השטף החילוץ באמצעות H⁺-רגיש fluorophores לקצה בדיקה של מחסנית חיישן. במקביל, O₂ הצריכה על ידי זרחון חמצוני מזוהה באמצעות fluorophores₂-רגיש לקיבוע לאותו קצה בדיקה (איור 1b). זיהוי אפקטיבי של H⁺ ו נצרך O₂ דורש מאגר זרע שונה עם קיבולת אגירה נמוכה ללא ביקרבונט או פנול אדום. כך, כדי לגרום מדרכיכים בהעדר ביקרבונט, אימצנו את השימוש במחנה חדיר מחנה אנלוגי מוזרק יחד עם טווח רחב PDE מעכבי IBMX²². שלוש יציאות הזרקה עצמאיות נוספות מאפשרות הזרקה של מפעילים פרמקולוגיים ו/או מעכבי, אשר מקלה על זיהוי בזמן אמת של שינויים בנשימה התאית ובקצב גליקוליזיס עקב טיפול ניסיוני.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הזרע נאסף מ-8-16 בן שבוע-CD-1 עכברים גברים. ניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים של וייל קורנל וועדת השימוש (IACUC).

1. יום לפני השיטת התיאום

הכנת מחסנית חיישן ומנתח השטף של מסחטות כאשר
1. כדי לימה את מחסנית החיישן, להסיר את מחסנית חיישן מן השטף XFe96 מגלויה מערכת שיטת ומניחים את מחסנית חיישן הפוך ליד לוחית השירות.
2. מילוי מאגר הפתרונות עם 25 מ ל של כפול מזוקקים H₂o באמצעות פיפטה רב-ערוצי, להוסיף 200 μl של h₂o כדי כל טוב של צלחת השירות. מניחים את מחסנית החיישן בחזרה לתוך צלחת כלי השירות ו-דגירה לילה ב 37 ° c בחממה שאינה CO₂ .
  הערה: צריך לשתות מחסנית לפחות 4 h.
3. מחלק 25 מ ל של מנתח השטף מתוך הזרם מכייל את שפופרת 50 mL ומודלת אותו לילה ב 37 ° c בחממה שאינה CO₂ .
הכנת מיקרופלטות מצופות לקונה
1. לפזר 2.5 מ"ג של קונה ב 5 מ ל של כפול מזוקקים H₂O כדי להכין 0.5 Mg/mL (w/v) מניות.
2. באמצעות הצינורות רב ערוצי, למלא כל היטב של מנתח השטף מגלותאי 96-צלחת לוחית עם 50 μL של הפתרון ה0.5 mg/mL Con A. השאירו את המכסה פתוח ותנו לצלחת להתייבש לילה בטמפרטורת החדר.
  הערה: לוחות מרובים יכולים להיות מצופים בבת אחת ומאוחסנים ב 4 ° צ' עד ארבעה שבועות עד מוכן לשימוש.
הכנת מאגר זרע
1. להכין 250 mL של מאבחן השטף מנתח TYH עם הHEPES נמוך המכיל 138 Mm הנאקל, 4.7 Mm kcl, 1.7 Mm cacl₂, 1.2 mm KH₂הפו₄, 1.2 mm mgso₄, 5.6 מ"מ גלוקוז, ו 1 מ"מ hepes. מחממים את החוצץ ל37 ° c ומתאימים את ה-pH ל-7.4.

2. יום השיטת הזמן

הכנה לכיול מחסנית
1. החלף את ה-H₂O ב צלחת השירות עם 200 μl של XF מכייל לטוב ומודלת עבור לפחות 1 H ב שאינו CO₂ 37 ° c חממה.
  הערה: במקום כיונמלה, מסוננים מסונן PBS, pH 7.4 ניתן להשתמש.
2. חום 50 mL של מאגר TYH ב 37 ° c.
יצירת תבנית גל עבור מנתח השטף החילוץ
1. להפוך את מנתח השטף החילוץ על ולאפשר את הטמפרטורה לייצב 37 ° c.
2. פתח את תוכנת הגל ועצב תבנית חדשה על-ידי פתיחת תבנית ריקה (ראה קובץ משלים 1, תבנית גל).
3. פתח את הכרטיסיה הגדרות קבוצה . הגדרת מדיית שיטת הגדרה כ-tyh; pH 7.4 וסוג תא כמו זרע העכבר, להשאיר אסטרטגיות הזרקה ולקדם טיפולים ריקים. צור קבוצות שונות עבור כל תנאי שיטת הפעולה; בדוגמה זו, יש 6 קבוצות שונות (TYH, TYH + db-מחנה/IBMX, 2-DG, 2-DG + db-מחנה/IBMX, נמלה/ריקבון, נמלה/Rot + db-מחנה/IBMX); מחנה מחנאות (db-cAMP) ו-3-איזובוטיל-1-מתילקסאתה (IBMX) כדי לגרום מדרכיכים, 2-deoxyglucose (2-DG) כמו מעכב גליקוליזיס, antimycin A (antA) ו rotenone (להירקב) כמעכב של השלישי המורכב והראשון של רשת התחבורה אלקטרון.
  הערה: כדי להתחשב בהבדלים בין בארות, לפחות 7-8 בארות לכל תנאי יש למדוד במקביל.
4. פתחו את הכרטיסייה של מפת הצלחות והגדירו את מפת הצלחות על-ידי הקצאת קבוצות לבארות ספציפיות.
  הערה: ארבע הבארות הפינתיות (A1, A12, H1, H12) יהיו מלאות במאגר TYH (ללא זרע) ומאוחר יותר ישמשו לחיסור רקע.
5. פתחו את הכרטיסייה ' פרוטוקול ', הוסיפו 4 מחזורי מדידה שונים, בחרו ביציאה המתאימה וערכו את פרטי המדידה (איור 2, טבלה 1). הדגש מדידה לאחר הזרקה ואין להדגיש את השפה.
6. שמור את תבנית המילוי, מלא את סיכום הפרוייקט והגדר את מיקום השמירה עבור קובץ התוצאות.
הכנת תרכובות להיטען לתוך מחסנית חיישן
1. להכין 2 מ ל של 50 mM db-מחנה ידי המסת 9.8 mg של תרכובת במאגר TYH ולהוסיף IBMX לריכוז הסופי של 5 מ"מ.
  הערה: IBMX יש נטייה לזרז לאחר מדולל במאגר TYH. מאיצים יכולים להיות מומס על ידי vortexing ו-הדגירה של TYH/db-מחנה/IBMX פתרון בלוק חום 37 ° c עבור 5 דקות.
2. להכין 1 מ ל של 500 mM 2-DG ידי המסת 82.1 mg של תרכובת במאגר TYH.
3. הכינו 1 מ ל של 5 μM של AntA/Rot על ידי דילול שתי התרופות במאגר TYH.
  הערה: תרכובות הם מדולל 10-קיפול על ידי הזרקה לתוך המחסנית מנתח השטף הזרם; לכן, ודא כי פתרונות ההזרקה מרוכזים יותר ב-10x.
בידוד זרע של עכבר
1. מורדם 3 עכברים זכרים בין 8 ו 16 שבועות על ידי isofלאנה ולהקריב את העכברים על ידי נקע בצוואר הרחם לאחר שום תגובה צובט הבוהן זוהה. הסר את מיכל ה, היותרת והמידה
2. מקום כל תסמונת ב 500 μl של מאגר מראש tyh ב 24-באר צלחת היטב, לשתק את תסמונת לתחתית הצלחת באמצעות זוג מלקחיים ולפתוח את הרקמה על ידי ביצוע 5-7 חתכים קטנים עם מספריים נוצה.
3. להעביר את הצלחת מיד לתוך החממה₂ 37 ° c, ולתת לזרע להתפזר עבור 15 דקות.
טעינת מחסנית החיישן
1. שני מדריכים לטעינת יציאות עבור יציאה A ו-D ויציאה B ו-C מסופקים בערכת השטף מסחטות. לטעינת יציאה מסוימת, הסר את המכסה ממחסנית החיישן ויישר את האות של מדריך הטעינה המתאים של היציאה עם הפינה השמאלית העליונה של המחסנית. בזמן הזרקת, השתמשו בקצות האצבעות של הידיים שאינן מזריקים כדי להחזיק את קו הטעינה של היציאה במקום והכניסו את קצות הפיפטה אנכית לתוך הנמל וטעינת חורי העזר.
2. יציאה A: שימוש בפיפטה רב-ערוצית, הכנס 20 μL של מאגר TYH לכל עמודה.
3. Port B: הכנס 22 μL של מאגר TYH לטור 1-4, הכנס 22 μL של 500 mM 2-DG לטור 5-8, ו -25 μL של 5 μM AntA/Rot לעמודה 9-12.
4. פורט C: להזריק 25 μL של מאגר TYH לתוך כל עמודה עם מספרים אי-זוגיים, להזריק 25 μL של 10 מ"מ db-cAMP/500 μM IBMX לכל עמודה עם מספרים זוגיים.
5. מניחים את מחסנית חיישן עם לוחית כיול לתוך מנתח השטף החילוץ ולהתחיל את השיטת. כיול לוקח 10-15 דקות.
הכנת לוחות זרע
1. התמוססות 45 מ"ג של BSA ב 15 מ ל של מאגר TYH (3 מ"ג/mL w/v) ולהכין שלוש שעות של שלושה מ"ל של 3 mL BSA/TYH פתרון כל אחד ב 5 שפופרות צנטריפוגה mL.
2. לשלב שתי בארות זרע כל אחד 1.5 mL צנטר שפופרת, לספור את הזרע באמצעות המטציטוטומטר ולדלל את הזרע לריכוז של 2 x 10⁷ זרע/mL.
  הערה: השתמשו בטיפים חתוכים לחיתוך זרע כדי למנוע פגיעה בתאים.
3. צנטריפוגה את הזרע עבור 3 דקות ב 700 x g, להסיר את supernatant ולהוסיף 1 מ ל של מאגר tyh. חזור על צנטריפוגה step, הסר את הסופרנטאנט, והעבר את כל השעיית הזרע לצינור צנטריפוגה אחד של 5 מ ל עם 3 מ ל של BSA/TYH.
4. מקום 180 μL של מאגר TYH לכל פינה היטב (A1, A12, H1, H12) של צלחת מצופה קונה. מקום 180 μL של השעיית זרע לתוך כל באר ריקה של הלוח מצופה קונה (1.2 x 10⁶ זרע/טוב).
5. צנטריפוגה את צלחת הזרע ב 250 x g עבור 1 דקות, לסובב את הצלחת על ידי 180 °, ו צנטריפוגה שוב ב 250 x g עבור 1 דקות (הבלם הנמוך ביותר 1).
6. להסיר את לוחית הכיול ממנתח השטף החילוץ ולהוסיף את לוחית הזרע. המשך בסדר.
מיצוי וניתוח מידע
1. לאחר שסיימת את העיבוד, הסר את המחסנית, פתח את קובץ התוצאות, לחץ על הכרטיסיה ייצוא וייצא את ההפעלה הושלמה כקובץ של מנסרה (קובץ משלים 2: נתונים לדוגמה ראשוניים המשמשים לאיור 3).
2. שכפל את הקובץ ECAR ו-OCR על-ידי לחיצה על הכרטיסייה החדשה ולאחר מכן את משפחה כפולה . ... tab (איור 3א).
3. מחק את 7 השורות הראשונות של הנתונים (איור 3ב).
4. נרמל את נקודת הנתונים לפני הזרקת המחנה/IBMX באמצעות החסרה שורה 1. לחץ על הכרטיסיה ניתוח ולאחר מכן על הכרטיסיה הסר מתמטיקה בסיסית ועמודה . סמן שורות נבחרות: שורה ראשונה, חישוב: יחס: ערך/בסיס ועמודות משנה: התעלם מעמודת משנה. לחץ על אישור (איור 3ג).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

שיטה זו משתמשת במנתח השטף מתוך לעקוב אחר שינויים בזמן אמת בקצב של גליקוליזיס ו oxphos במהלך מדרכיכים זרע העכבר. איור 4 מראה ניסוי מופתי בו הזרע הcapacitated בנוכחות גלוקוז כמצע האנרגיה היחיד ו-2-DG ו antimycin rotenone כמו מאפלוטורים תרופתי. המצע האנרגיה במאגר מנתח השטף TYH ואת המודולטורים תרופתי ניתן לבחור בחופשיות בהתאם למטרה של הניסוי. הזרע לא capacitated העכבר ב BSA/TYH היו מחוברים לתחתית של מיקרו מצופה החלל הארעי דרך הראש שלהם. בדוגמה זו, ערכי ECAR בסיס ו-OCR בממוצע בין כל הבארות שזוהו היו 12.76 ± 2.75 מייל/שעה/מינימום ו 23.64 ± 2.78 pmol/דקה, בהתאמה.

לאחר הזרקה מבוים עם מאגר TYH, ואחריו הזרקה של 2-DG ו נמלה/ריקבון לעכב גליקוליזיס וזירחון חמצוני, בהתאמה, זרע מדרכיכים המושרה על ידי הזרקה של db-cAMP/IBMX.

התוצאות הייצוגיות מראות כי בנוכחות גלוקוז, מדרכיכים מלווה על ידי עלייה 7-קיפול בחמצה Rate (ECAR), אשר מעוכב על ידי חסימת גליקוליזיס עם 2-DG (איור 4א). זרע Capacitated מראה עלייה של 20 מקפלים בשיעור צריכת החמצן (OCR) לעומת זרע שאינו Capacitated (איור 4B), הוכחת כי זרע העכבר לשפר גם גליקולוליזה וזירחון חמצוני לתמוך בביקוש האנרגיה הגוברת במהלך מדרכיכים. עליית ecar במהלך מדרכיכים זרע מעכבות על ידי מעכבי גליקוליזיס 2-DG, אבל לא מושפע מעכבי זרחון חמצוני antimycin A ו rotenone (איור 4ג), המציין כי שינוי ecar מונע בעיקר על ידי H⁺ שחרור מ גליקוליזיס. הגידול ב-OCR הוא, כצפוי, נחסם על ידי antimycin A ו rotenone (איור 4D), אבל זה מעוכב גם על ידי 2-DG (איור 4ב) חשיפת כי העלייה בבית הגידול במהלך הזרע מדרכיכים תלויה בפעילות גליקוליטית.

איור 1: עקרון מנתח השטף הפריתאי. (א) בשל פירוק של גלוקוז ל לקטט במהלך גליקוליזיס והדור של CO₂ דרך מחזור tca, שינויים גליקוליזיס ו oxphos מלווים ב-H⁺ הפרשת לתוך מדיה החילוץ. XFe96 Analyzer מזהה שינויים אלה בחילוץ H⁺ ריכוז כמו ecar. במקביל, שינויים בריכוז O₂ בעקבות הצריכה o₂ על ידי זירחון חמצוני נמדד כמו OCR. חסימת גליקוליזיס עם 2-deoxyglucose (2-DG) או נשימה עם מורכב I ו מעכבי III מדחסים rotenone ו antimycin A מגלה אילו מסלולים מטבולית לתמוך בביקוש האנרגיה הגוברת במהלך מדרכיכים זרע. (ב) זרע העכבר מחוברים בראשם אל החלק התחתון של מיקרותא מצופה הקונה; הדגל שלהם נע בחופשיות. בעוד שינויים הריכוז H⁺ ו O₂ מזוהים על ידי H⁺-ו o₂רגיש fluorophores לבדוק חיישן, עד ארבעה תרכובות שונות ניתן להזריק ברציפות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: ייצוג סכמטי של הניסוי הופתי. שינויים ECAR (מייל/דקה) ו-OCR (pmol O₂/min) מזוהים בתוך הזרע הלא capacitated ו קיבולי באמצעות מנתח השטף מתוך מסחטות. מחזור 1: הערכים הבזליים ECAR ו-OCR. מחזורי 2-5: ייצוב מערכת לאחר הזרקת TYH ללעוג. מחזורי 6-8: הדגירה של התרופה. מחזורים 9-27: מדרכיכים זרע. חיצים מציינים זריקות. 2-DG: הריכוז הסופי 50 mM, AntA/Rot: ריכוז סופי 0.5 μM, db-מחנה: הריכוז הסופי 1 מ"מ, IBMX: ריכוז סופי 500 μM. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: ניתוח נתונים. (א) נתונים גולמיים של שינויים ב-ecar במהלך מדרכיכים זרע העכבר. (ב) נתונים לאחר הסרת 7 נקודות הנתונים הראשונות. (ג) נתונים מנורמגים לנקודת הנתונים לפני הזרקת מחנה/ibmx. נתונים מוצגים כממוצע 7-8 בארות ± S.E.M. זריקות מסומנים בחץ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: שינויים בגליקולוליזיס ובזירחון חמצוני במהלך מדרכיכים הזרע. (א) מנורמל ecar בזרע העכבר הcapacitated והקיבול בנוכחות והיעדרות של 50 מ"מ 2-DG. (ב) מנורמל OCR ב-capacitated ובזרע הקיבול של העכבר בנוכחות והיעדרות של 50 מ"מ 2-DG. (ג) מנורמל ecar בזרע לא capacitated והקיבעיים של העכבר בנוכחות והיעדרות של 0.5 μm antimycin A ו rotenone. (ד) מנורמל OCR ב-capacitated ובזרע הקיבעיים של העכבר בנוכחות והיעדרות של 0.5 μm antimycin A ו rotenone. נתונים מוצגים כממוצע ± S. E. M מנורמל לנקודת הנתונים לפני הזרקת db-cAMP/IBMX; n = 6. זריקות מסומנות עם חץ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

	נמל	מספר מחזורים	מערבבים (מזערי)	המתנה (מזערי)	מידה (מזערי)
A: ECAR בסיס/OCR	אין יציאה	1	2:00	0:00	3:00
ב: הזרקת מבוים	1	4	2:00	0:00	3:00
ג: הזרקת סמים	2	3	2:00	0:00	3:00
D: מדרכיכים	3	18	2:00	0:00	3:00

טבלה 1: פרטי מדידה.

Supplemental Figure 1
איור משלים 1: מדרכיכים של זרע העכבר בתוך מאבחן השטף מנתח TYH. זירחון של שאריות טירוזין של זרע העכבר זוהה בנקודות זמן שונות במהלך מדרכיכים (0-90 דקות) לאחר הדגירה (א) טירוזין עם 25 מ"מ hco₃^-, 3 מ"ג/mL bsa ו 20 מ"מ hepes או ב (ב) לחילוץ מנתח השטף טירוזין עם 5 מ"מ db-מחנה, 500 μm ibmx, ו 1 מ"מ hepes, זוהה עם נוגדן α-פוספולקור. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

משלים קובץ 1: תבנית שיטת גל כדי לזהות שינויים בגליקוליזיס וזירחון חמצוני במהלך מדרכיכים זרע העכבר. את התוכנה גל שולחן העבודה ניתן להוריד בחינם לאחר מילוי טופס ההרשמה (www.agilent.com/en/products/cell-analysis/cell-analysis-software/data-analysis/wave-desktop-2-6) ומותקן על windows 7, 8 או 10, (Mac OSx 10.11 (או יותר) עם הקבלות 12 (או יותר). ובכך, תבניות גל ניתן להפיק באופן עצמאי מן מנתח השטף החילוץ, מיוצאים ולאחר מכן מיובאים לתוך התוכנה גל של כל מנתח השטף החילוץ. אנא לחץ כאן כדי להציג קובץ זה (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד).

משלים קובץ 2: גרף משטח תרשים פריזמה מיוצא תוכנה גל עם ניתוח נתונים למופת. אנא לחץ כאן כדי להציג קובץ זה (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

אובדן של זרע מדרכיכים בהיעדר מצעים מטבולית מסוימים או אנזימים מטבולית קריטיים חשף את חילוף החומרים של האנרגיה כגורם מפתח התומך הפריה מוצלחת. מתג מטבולית במהלך הפעלת התא הוא מושג היטב בסוגי תאים אחרים, עם זאת, אנחנו רק מתחילים להבין איך זרע להתאים את חילוף החומרים שלהם לביקוש האנרגיה הגוברת במהלך מדרכיכים. באמצעות מנתח השטף לחילוץ, פיתחנו כלי ישימה בקלות כדי לפקח על שינויים בגליקוליזיס וזירחון חמצוני בזמן אמת במהלך מדרכיכים זרע. הזיהוי של שינויים ב H⁺ ו-O₂ עם fluorophores לבדוק חיישן הוא פולשני מינימלית וארבע יציאות הזרקת בנפרד מופעל לאפשר מניפולציה עם מעכבי או מפעילים פרמקולוגית בנקודות זמן נפרדות לפני או במהלך תהליך מדרכיכים. פרוטוקול זה מעניק דוגמה אחת בלבד לניסוי מדרכיכים של העכבר. כדי לפשט את הפרשנות של התוצאות בחרנו להראות ניסוי למופת שבו שימש גלוקוז כמקור האנרגיה היחיד. התנאים משתנים בהתאם למטרה של הניסוי, ועד 12 תנאים שונים (כלומר, מקורות אנרגיה שונים כמו גלוקוז לעומת גלוקוז ו פירובט) ניתן למדוד במקביל. בנוסף, ארבע יציאות הזרקה עצמאית לאפשר הזרקה של מפעילים פרמקולוגית ו/או מעכבי בכל נקודת זמן הרצויה לפני או במהלך מדרכיכים. זה פותח את האפשרות להשתמש מנתח השטף החילוץ כמו מכשיר חצי תפוקה גבוהה סינון. בדומה לזרע העכבר, במינים אחרים כמו אדם או שור זה עדיין מאוד מסוכן איך זרע לשנות את חילוף החומרים שלהם במהלך מדרכיכים. ניתן להתאים בקלות את הפרוטוקול; לכן, אנו ממליצים למטב את ריכוז הזרע בכל פעם לפני תחילת ניסוי אמיתי.

המגבלה הגדולה ביותר של הפרוטוקול היא כי ניתן להשיג תוצאות באיכות גבוהה רק בהעדר ביקרבונט. ביקרבונט בנוזל הזרע הוא האות הפיסיולוגי היוזם את המדרכיכים איתות מדורגת בעקבות השפיכה. ביקרבונט מפעיל את cyclase האדוליליל (sAC; ADCY10), אשר מזרז את ההמרה של ATP למחנה²³. הגידול במחנה ולאחר מכן מסיע איתות הדירוג מתווך על ידי חלבון קינאז a, אשר בסופו של דבר מוביל למטה טירוזלציה של חלבונים היעד (למשל, ערוצי יון, אנזימים מטבולית, וחלבונים מבניים²⁴^,²⁵). הגבלה זו נגד ביקרבונט היא להתגבר על ידי הזרקת את המוצר של שק ביקרבונט המופעל, מחנה. אנו משתמשים 5 mM של מחנה חדיר תא אנלוגי db-מחנה במקביל עם הרחבה-ספציפיות פוספודיאסטראז מעכב IBMX, אשר מונע השפלה מהירה של db-מחנה ידי פוספוסדיאסטראז. שילוב זה ביעילות יוזם את המחנה מוסדר מדרכיכים איתות מסלול הפעלה ההפעלה עם קינטי דומה כמו ביקרבונט (איור משלים 1). במקביל לביקרבונט, משמשת כולסטרול (g., BSA) בתוך מבחנה בcapacitate טרייה של זרע או זרע שנזרעו מהאפידיאמיס. אין אפשרות להזריק אלבומין משום שהוא סותם את יציאת ההזרקה ולכן יש להוסיף אותו למאגר הזרע לפני ציפוי התאים. ביצוע הניסוי בנוכחות או היעדרות של BSA חשף כי העלייה ECAR ו-OCR במהלך מדרכיכים זרע אינו תלוי בקבלה כולסטרול. עם זאת, הימצאות BSA במאגר הזרע ירד תנודות בערכי ECAR ו-OCR שאותרו בין בארות וניסויים שונים; לפיכך, אנו ממליצים במיוחד כולל BSA במאגר הזרע כדי להגביר את התוכסות.

גורם לזיהום של זרע. עם נוזל אפידימל כדי להימנע מתוצאות מלאכותיות בשל מרכיבי נוזל הזרע, אנו ממליצים על נטילת זרע פעמיים לפני השימוש בהם לניסוי. ריכוז וציפוי זרע הוא גורם קריטי נוסף הקובע את הצלחת הניסוי. לקבלת תוצאות אמינות, היצרן ממליץ על ערכי ECAR הראשוניים להיות גדולים מ -10 וערכי OCR כדי להיות גדולים מ-20. ריכוז הזרע המשמש בפרוטוקול זה היה מיטבי כך את ערכי ECAR בסיס הממוצע ו-OCR של 7-8 בארות נמדד לכל תנאי הם מעל 10 ו 20, בהתאמה. הזרע נע בחופשיות להפריע לגילוי שינויים של H⁺ ו-O₂. כך, חיוני לדבוק כל זרע עם ראשם לתחתית הצלחת. מצאנו הצלחה שמירה על זרע על ידי ציפוי הצלחת עם קונה, לקטין צמח כי במיוחד אינטראקציה עם קרום אקרוזוממית חיצונית והוא משמש בדרך כלל עבור אקרוכמה בחני²⁶, ועל ידי ספינינג בעדינות את הצלחת (ראה שלב 2.7.3). בשיטה זו, זרע מותאם לתחתית הבאר רק דרך הראש שלהם, כך שהם יכולים עדיין להעביר בחופשיות את הדגל שלהם ולשנות את דפוס המכה שלהם במהלך מדרכיכים.

זרע הבלטת מתמדת של H⁺ ו-O₂ בשניהם, הלא capacitated ומדינת capacitated. כדי לקבוע את ה-ECAR הראשונית ו-OCR באופן מדויק ככל האפשר, חשוב להתחיל את הניסוי מהר ככל שתוכל לאחר שלב הכביסה האחרון. זה יכול להתבצע על ידי טעינת מחסנית חיישן בעוד הזרע הם שוחים החוצה על ידי הפעלת השיטה במנתח השטף החילוץ לפני הצעד הראשון כביסה. כיול המכשיר לוקח בערך באותו זמן כמו כביסה וציפוי התאים וספינינג את הצלחת. היצרן ממליץ על שלב המדידה כדי לאפשר למערכת להתייצב לפני שנקודת הנתונים האמיתית הראשונה נמדדת. מאחר שהפרוטוקול כולל 8 מחזורי מדידה לפני שמדרכיכים מופעל, כדי לחסוך בזמן, השלב המפוקפק אינו נכלל בפרוטוקול זה.

היכולת להזריק פתרונות במהלך המבדק ולהתבונן בהשפעות שלהם על הנשימה ושיעור גליקוליטיק בזמן אמת היא תכונה מרכזית של מנתח השטף החילוץ. טעינת מחסנית החיישן היא אחד השלבים הקריטיים בפרוטוקול ויש לבצע אותם בקפידה. כדי להבטיח זריקה נאותה לכל הבארות, כל סדרה של יציאות צריכה להכיל את אותו אמצעי אחסון, כולל בארות הרקע. טעינת היציאות באמצעות צנרת רב-ערוצית מחייבת תרגול מסוים, אך מפחיתה את השונות ואת זמן הטעינה באופן משמעותי. אנו ממליצים במיוחד להשתמש במדריך הטעינה של היציאה אך להזריק רק ארבע יציאות בו. חשוב גם להעריך שבמהלך הטעינה, אמצעי ההזרקה מוגברים בהדרגה כדי לפצות על הנפח הגובר בבאר. בעת טעינת מחסנית החיישן, חשוב לא להכניס במלואו את העצות ליציאה. זה עשוי בטרם עת לדחוף פתרון הזרקה דרך פתח היציאה. בזמן הקמת השיטה שמצאנו שהזרקת נוזל לזרע גורמת לחפצי הזרקה לא רצויים, כנראה עקב דילול הזרע בבאר ו/או החדרת זרע מלמטה היטב. הזריקה הראשונה גורמת לפריט ההזרקה הגדול ביותר, ולכן כללנו הזרקת מדגם עם מאגר זרע לכל הבארות בתחילת הפרוטוקול.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

המחברים מבקשים להכיר בתמיכתם של ד ר לוטו ראמוס-אגריטו במרכז המשאבים של התפוקה והספקטרוסקופיה ברוקפלר.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
2-Deoxy-D-glucose	Sigma-Aldrich	D8375	2-DG
3-Isobutyl-1-methylxanthine	Sigma-Aldrich	I7018	IBMX; prepare a 500 mM stock solution in DMSO (111.1 mg/ml) and store in small aliquots
Antimycin A	Sigma-Aldrich	A8674	AntA; prepare a 5 mM stock solution in DMSO (2.7 mg/ml) and store in small aliquots
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A1470	BSA
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	C1016	CaCl2
Concanacalin A, Lectin from Arachis hypogaea (peanut)	Sigma-Aldrich	L7381	ConA
Glucose	Sigma-Aldrich	G7528
Hepes	Sigma-Aldrich	H0887
Isothesia	Henry Schein Animal Health	1169567761	Isoflurane
Magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	M2643	MgSO4
N6,2'-O-Dibutyryladenosine 3',5'-cyclic monophosphate sodium salt	Sigma-Aldrich	D0627	db-cAMP
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P9333	KCl
Potassium dihydrogen phosphate	Sigma-Aldrich	P5655	KH2PO4
Rotenone	Cayman Chemical Company	13995	Rot; prepare a 5 mM stock solution in DMSO (2mg/ml) and store in small aliquots
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761	NaHCO3-
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S9888	NaCl
Equipment and materials
12 channel pipette 10-100 μL	eppendorf	ES-12-100
12 channel pipette 50-300 μL	vwr	613-5257
37 °C, non-CO₂ incubator	vwr	1545
5 mL cetrifuge tubes	eppendorf	30119380
50 mL conical centrifuge tubes	vwr	76211-286
Centrifuge with plate adapter	Thermo Scientific	IEC FL40R
Dissection kit	World Precision Instruments	MOUSEKIT
Inverted phase contrast microscope with 40X objective	Nikon
OctaPool Solution Reservoirs, 25 ml, divided	Thomas Scientific	1159X93
OctaPool Solution Reservoirs, 25 mL, divided	Thomas Scientific	1159X95
Seahorse XFe96 Analyzer	Agilent
Seahorse XFe96 FluxPak	Agilent	102416-100	Also sold as XFe96 FluxPak mini (102601-100) with 6 instead of 18 cartidges.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

Wu, M., et al. Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 292 (1), C125-C136 (2007).
Amo, T., Yadava, N., Oh, R., Nicholls, D. G., Brand, M. D. Experimental assessment of bioenergetic differences caused by the common European mitochondrial DNA haplogroups H and T. Gene. 411 (1-2), 69-76 (2008).
Choi, S. W., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G. Bioenergetic analysis of isolated cerebrocortical nerve terminals on a microgram scale: spare respiratory capacity and stochastic mitochondrial failure. Journal of Neurochemistry. 109 (4), 1179-1191 (2009).
de Groof, A. J., et al. Increased OXPHOS activity precedes rise in glycolytic rate in H-RasV12/E1A transformed fibroblasts that develop a Warburg phenotype. Molecular Cancer. 8, 54 (2009).
Chao, L. C., et al. Insulin resistance and altered systemic glucose metabolism in mice lacking Nur77. Diabetes. 58 (12), 2788-2796 (2009).
Chang, M. C. Fertilizing capacity of spermatozoa deposited into the fallopian tubes. Nature. 168 (4277), 697-698 (1951).
Austin, C. R., Bishop, M. W. Role of the rodent acrosome and perforatorium in fertilization. Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 149 (935), 241-248 (1958).
Ishijima, S., Baba, S. A., Mohri, H., Suarez, S. S. Quantitative analysis of flagellar movement in hyperactivated and acrosome-reacted golden hamster spermatozoa. Molecular Reproduction and Development. 61 (3), 376-384 (2002).
Suarez, S. S. Control of hyperactivation in sperm. Human Reproduction Update. 14 (6), 647-657 (2008).
Goodson, S. G., Qiu, Y., Sutton, K. A., Xie, G., Jia, W., O'Brien, D. A. Metabolic substrates exhibit differential effects on functional parameters of mouse sperm capacitation. Biology of Reproduction. 87 (3), 75 (2012).
Travis, A. J., et al. Functional relationships between capacitation-dependent cell signaling and compartmentalized metabolic pathways in murine spermatozoa. Journal of Biological Chemistry. 276 (10), 7630-7636 (2001).
Urner, F., Leppens-Luisier, G., Sakkas, D. Protein tyrosine phosphorylation in sperm during gamete interaction in the mouse: the influence of glucose. Biology of Reproduction. 64 (5), 1350-1357 (2001).
Danshina, P. V., et al. Phosphoglycerate kinase 2 (PGK2) is essential for sperm function and male fertility in mice. Biology of Reproduction. 82 (1), 136-145 (2010).
Miki, K., et al. Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase-S, a sperm-specific glycolytic enzyme, is required for sperm motility and male fertility. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (47), 16501-16506 (2004).
Mori, C., et al. Mouse spermatogenic cell-specific type 1 hexokinase (mHk1-s) transcripts are expressed by alternative splicing from the mHk1 gene and the HK1-S protein is localized mainly in the sperm tail. Molecular Reproduction and Development. 49 (4), 374-385 (1998).
Westhoff, D., Kamp, G. Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase is bound to the fibrous sheath of mammalian spermatozoa. Journal of Cell Science. 110 (15), 1821-1829 (1997).
Nevo, A. C., Rikmenspoel, R. Diffusion of ATP in sperm flagella. Journal of Theoretical Biology. 26 (1), 11-18 (1970).
Adam, D. E., Wei, J. Mass transport of ATP within the motile sperm. Journal of Theoretical Biology. 49 (1), 125-145 (1975).
Tombes, R. M., Shapiro, B. M. Enzyme termini of a phosphocreatine shuttle. Purification and characterization of two creatine kinase isozymes from sea urchin sperm. Journal of Biological Chemistry. 262 (33), 16011-16019 (1987).
Gomendio, M., Tourmente, M., Roldan, E. R. Why mammalian lineages respond differently to sexual selection: metabolic rate constrains the evolution of sperm size. Proceedings of the Royal Society of Biological Sciences. 278 (1721), 3135-3141 (2011).
Tourmente, M., Villar-Moya, P., Rial, E., Roldan, E. R. Differences in ATP generation via glycolysis and oxidative phosphorylation and relationships with sperm motility in mouse species. Journal of Biological Chemistry. 290 (33), 20613-20626 (2015).
Visconti, P. E., et al. Capacitation of mouse spermatozoa. II. Protein tyrosine phosphorylation and capacitation are regulated by a cAMP-dependent pathway. Development. 121 (4), 1139-1150 (1995).
Buck, J., Sinclair, M. L., Schapal, L., Cann, M. J., Levin, L. R. Cytosolic adenylyl cyclase defines a unique signaling molecule in mammals. PNAS. 96 (1), 79-84 (1999).
Visconti, P. E., Bailey, J. L., Moore, G. D., Pan, D., Olds-Clarke, P., Kopf, G. S. Capacitation of mouse spermatozoa. I. Correlation between the capacitation state and protein tyrosine phosphorylation. Development. 121 (4), 1129-1137 (1995).
Morgan, D. J., et al. Tissue-specific PKA inhibition using a chemical genetic approach and its application to studies on sperm capacitation. PNAS. 105 (52), 20740-20745 (2008).
Lybaert, P., Danguy, A., Leleux, F., Meuris, S., Lebrun, P. Improved methodology for the detection and quantification of the acrosome reaction in mouse spermatozoa. Histology and Histopathology. 24 (8), 999-1007 (2009).

באמצעות מנתח השטף של מסחטות כדי למדוד שינויים גליקוליזה ו זירחון חמצוני במהלך הזרע העכבר מדרכיכים

Play Video

PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Balbach, M., Buck, J., Levin, L. R.… More

Balbach, M., Buck, J., Levin, L. R. Using an Extracellular Flux Analyzer to Measure Changes in Glycolysis and Oxidative Phosphorylation during Mouse Sperm Capacitation. J. Vis. Exp. (155), e60815, doi:10.3791/60815 (2020).

Less

Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions

View Video