Summary
ونحن وصف تطبيق محلل تدفق خارج الخلية لرصد التغيرات في الوقت الحقيقي في تحلل الجلوكوز والمؤكسدة اثناء الماوس السائل المنوي.
Abstract
وتكتسب النطاف في الثدييات قدره علي الإخصاب في الجهاز التناسلي الأنثوي في عمليه تعرف بالسعة الاستيعابية. تتطلب العمليات المرتبطة بالسعة الطاقة. لا يزال هناك نقاش مستمر حول المصادر التي تولد ATP التي تغذي النطاف الحركية التقدمية ، والسعه ، وفرط النشاط ، والتفاعل الزائد. هنا ، ونحن وصف تطبيق محلل تدفق خارج الخلية كاداه لتحليل التغيرات في استقلاب الطاقة خلال الماوس السائل المنوي. باستخدام الفلور الحساسةH +و O2، يسمح هذا الأسلوب بمراقبه تحلل الجلوكوز والاكسده المؤكسدة في الوقت الحقيقي في غير السعه مقابل السائل المنوي. استخدام هذا الفحص في وجود ركائز الطاقة المختلفة و/أو المنشطات الدوائية و/أو مثبطات يمكن ان توفر رؤى هامه في مساهمه المسارات الايضيه المختلفة والتقاطع بين الإشارات التعاقبية والأيض اثناء السائل المنوي.
Introduction
وقد أحدث تطبيق الطيف الكتلي ثوره في دراسة الأيض. التنميط الأيضي المستهدف وتتبع الأيض يسمح برصد دقيق للتغيرات في استقلاب الطاقة. ومع ذلك ، يتطلب أداء الأيض بنجاح التدريب المكثف ، والموظفين ذوي الخبرة ، وباهظه الثمن ، والأطياف الشاملة عاليه الحساسية ليست متاحه بسهوله لكل مختبر. في السنوات الاخيره ، باستخدام محلل تدفق خارج الخلية ، مثل فرس الحصان XFe96 نمت شعبيه كوسيلة بديله لقياس التغيرات في استقلاب الطاقة في مختلف أنواع الخلايا1،2،3،4،5.
السائل المنوي هي خلايا متحرك المتخصصة للغاية. مهمتها هي تسليم الجينوم الأبوي إلى البويضة. العنبر ترك الجهاز التناسلي الذكور بعد القذف لا تزال غير ناضجه وظيفيا ولا يمكن تخصيب البويضة لأنهم غير قادرين علي اختراق الخلايا الدهنية ' الأثواب. المني اكتساب كفاءه الإخصاب لأنها العبور من خلال الجهاز التناسلي الأنثوي في عمليه النضج المعروفة باسم السعه6,7. يمكن ان يكون السائل المنوي القذف الطازج أو السائل المنوي الذي يتم تشريحه من البربخ في المختبر عن طريق الحضانة في وسائل الاعلام المحددة التي تحتوي علي Ca2 +، بيكربونات (hco3-) أو التناظرية الخلية-المخيم نفاذيه (علي سبيل المثال ، dibutyryl-مخيم) ، متقبل الكولسترول (مثل الزلال مصل البقر ، جيش صرب البوسنيين) ، ومصدر للطاقة (علي سبيل المثال ، الجلوكوز). اثناء التاهيل ، وتعديل السائل المنوي نمط الحركة في فوز الصواري غير المتناظرة ، والتي تمثل وضع السباحة يسمي فرط التنشيط8،9، وانها تصبح المختصة للخضوع لرد فعل اكروبعض7، حيث يتم الإفراج عن الانزيمات البروتينية التي هضم البويضات ' vestments. هذه العمليات تتطلب الطاقة ، ومماثله للخلايا الجسدية ، والسائل المنوي توليد ATP وغيرها من مركبات الطاقة العالية عن طريق تحلل الخلايا ، فضلا عن دوره المركبات الفوسفاتية المتقدريه والاكسده فوسفولات (oxphos)10. في حين تبين دراسات متعددة ان تحلل الجلوكوز ضروري وكافي لدعم السائل المنوي السعه11,12,13,14, مساهمه oxphos اقل وضوحا. وخلافا لأنواع الخلايا الأخرى حيث يتم اقتران تحلل الجلوكوز جسديا بدوره الهيئة ، فان السائل المنوي مجزا إلى حد كبير ويعتقد انه يحافظ علي هذه العمليات في مقصورات الصواري المنفصلة: ويركز الجزء الأوسط علي آلاتالميتوكوندريا ، فيحين ان الانزيمات الرئيسية لتحلل الجلوكوز تبدومقيده. نتائج هذا التقسيم في نقاش مستمر حول ما إذا كان بيروفات المنتجة في القطعة الرئيسية من غليكولسيس يمكن ان تدعم oxphos الميتوكوندريا في midpiece ، وما إذا كان ATP التي تنتجها oxphos في midpiece تكون قادره علي نشر بسرعة كافيه علي طول السارية لدعم متطلبات الطاقة في الأجزاء البعيدة من القطعة الرئيسية17،18 وهناك أيضا دعم لدور اوكسنفوس في السائل المنوي. ليس فقط هو oxphos أكثر نشاطا مواتيه من تحلل, توليد 16 مرات أكثر ATP من تحلل, ولكن حجم midpiece ومحتوي الميتوكوندريا ترتبط مباشره مع اللياقة الانجابيه في الأنواع الثدييات التي تظهر درجات أكبر من المنافسة بين الذكور لأصحاب20. معالجه هذه الاسئله يتطلب أساليب لدراسة المساهمات النسبية لتحلل الجلوكوز والاكسده اثناء السائل المنوي.
تورمنت وآخرون تطبيق محلل تدفق خارج الخلية 24 جيدا لمقارنه الأيض الطاقة من الأنواع الماوس ذات الصلة بشكل وثيق مع مختلفه بشكل ملحوظ معلمات أداء العنبر21. بدلا من الإبلاغ عن قيم ECAR و OCR القاعدية للنطفة غير القادرة ، هنا ، فاننا نكيف طريقتهم باستخدام محلل تدفق خارج الخلية 96 لمراقبه التغيرات في استقلاب الطاقة خلال الماوس السائل المنوي في الوقت الحقيقي. قمنا بتطوير طريقه تسمح في الوقت نفسه رصد تحلل الجلوكوز و oxphos في الزمن الحقيقي في السائل المنوي مع الضرب الصواري في ما يصل إلى اثني عشر ظروف التجريبية المختلفة عن طريق قياس تدفق الأكسجين (O2) والبروتونات (H +) (الشكل 1a). نظرا لانهيار بيروفات إلى اللاكتات اثناء تحلل الجلوكوز وإنتاج CO 2 عن طريق الدورةالثانية والعشرين ، وعدم السعه والسعه المنوية البثقh + في وسائل الفحص التي يتم الكشف عنها من قبل محلل تدفق خارج الخلية عن طريقh +-الحساسة فلوبوريس إلى طرف التحقيق من خرطوشه الاستشعار. وفي موازاة ذلك ، يتم الكشف عن الاستهلاك O2 بواسطة فوسفولات الاكسده عن طريق o2-الحساسة الفلوروهورس التي تم تعبئتها لنفس التحقيق غيض (الشكل 1b). الكشف الفعال عنH + والمستهلكة س2 يتطلب المخزن المؤقت السائل المنوي المعدل مع انخفاض القدرة التخزين المؤقت دون بيكربونات أو الفينول الأحمر. التالي ، للحث علي السعه في غياب بيكربونات ، اعتمدنا استخدام التناظرية الخلية-نفاذيه مخيم حقن مع المثبط PDE واسعه النطاق IBMX22. ثلاثه منافذ حقن مستقله اضافيه تسمح بحقن المنشطات الدوائية و/أو مثبطات, مما يسهل الكشف في الوقت الحقيقي من التغيرات في التنفس الخلوي ومعدل تحلل الجلوكوز بسبب التلاعب التجريبية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
يتم جمع السائل المنوي من الفئران الذكور CD-1 البالغة من العمر 8-16 في الأسبوع. تمت الموافقة علي التجارب الحيوانية من قبل لجنه الرعاية الحيوانية والاستخدام المؤسسي لطب وآيل كورنيل (IACUC).
1. يوم قبل الفحص
-
اعداد خرطوشه الاستشعار ومحلل تدفق خارج الخلية معايره
- لترطيب خرطوشه المستشعر ، قم بازاله خرطوشه المستشعر من مجموعه فحص التدفق XFe96 خارج الخلية وضع خرطوشه المستشعر راسا علي عقب بجانب لوحه الاداه المساعدة.
- ملء خزان حل مع 25 مل من المقطر المزدوج H2س باستخدام ماصه متعددة القناات ، أضافه 200 Μl من h2o إلى كل بئر من لوحه الاداه المساعدة. وضع خرطوشه الاستشعار مره أخرى في لوحه الاداه المساعدة واحتضان بين عشيه وضحيها في 37 درجه مئوية غير CO2 حاضنه.
ملاحظه: يجب ان تكون الخرطوشة رطبه لمده 4 ساعات علي الأقل. - Aliquot 25 مل من محلل تدفق خارج الخلية معايره في أنبوب مخروطي 50 mL واحتضانه بين عشيه وضحيها في 37 درجه مئوية غير CO2 حاضنه.
-
اعداد الصفائح المجهرية المغلفة بالكونا
- تذوب 2.5 ملغ من كونا في 5 مل من المقطر المزدوج H2O لاعداد 0.5 Mg/mL (w/v) الأسهم.
- باستخدام ماصه متعددة القناات ، وملء كل بئر من محلل تدفق خارج الخلية 96 لوحه البئر مع 50 μL من 0.5 mg/mL Con A حل. اترك الغطاء مفتوحا واترك الصفيحة تجف بين عشيه وضحيها في درجه حرارة الغرفة.
ملاحظه: لوحات متعددة يمكن ان تكون مغلفه في وقت واحد وتخزينها في 4 درجه مئوية لمده تصل إلى أربعه أسابيع حتى تصبح جاهزه للاستخدام.
-
اعداد العنبر العازلة
- اعداد 250 mL من محلل تدفق خارج الخلية TYH العازلة مع HEPES منخفضه تحتوي علي 138 mm كلوريد الصوديوم ، 4.7 Mm kcl ، 1.7 Mm cacl2، 1.2 mm KH2PO4، 1.2 mm mgso4، 5.6 mm الجلوكوز ، و 1 مم hepes. تسخين العازلة إلى 37 درجه مئوية وضبط الأس الهيدروجيني إلى 7.4.
2. يوم من الفحص
- التحضير لمعايره الخرطوشة
- استبدال H2س في لوحه الاداه المساعدة مع 200 ΜL من XF معايره لكل بئر واحتضان لمده 1 ساعة علي الأقل في غير CO2 37 درجه مئوية حاضنه.
ملاحظه: بدلا من معايره ، المعقمة المصفاة ، ويمكن استخدام الأس الهيدروجيني 7.4. - الحرارة 50 مل من المخزن المؤقت TYH في 37 درجه مئوية.
- استبدال H2س في لوحه الاداه المساعدة مع 200 ΜL من XF معايره لكل بئر واحتضان لمده 1 ساعة علي الأقل في غير CO2 37 درجه مئوية حاضنه.
- إنشاء قالب موجه لمحلل التدفق خارج الخلية
- تحويل محلل تدفق خارج الخلية علي والسماح لدرجه الحرارة لتحقيق الاستقرار إلى 37 درجه مئوية.
- افتح برنامج الموجه وصمم قالبا جديدا عن طريق فتح قالب فارغ (راجع الملف الإضافي 1، قالب الموجه).
- افتح علامة التبويب تعريفات المجموعات . تعريف وسائط الفحص ك tyh; pH 7.4 ونوع الخلية كما الماوس السائل المنوي ، وترك استراتيجيات الحقن والمعالجات المسبقة فارغه. إنشاء مجموعات مختلفه لكل شرط الفحص; في هذا المثال ، هناك 6 مجموعات مختلفه (TYH ، TYH + db-كامب/IBMX ، 2-DG ، 2-DG + db-كامب/IBMX ، النمل/تعفن ، النمل/تعفن + db-كامب/IBMX) ؛ مخيم dibutyryl (db-كامب) و 3-ايزوبوتيل-1-ميثيلززانيني (IBMX) للحث علي السعه ، 2-ديوكسيكوز (2-DG) كمثبط لتحلل الجلوكوز ، انتيميسين ا (أنتا) وروتينون (تعفن) كمثبط للمجمع الثالث والمركب الأول من سلسله نقل الكترون.
ملاحظه: لمراعاه التباين بين الآبار ، ينبغي قياس ما لا يقل عن 7-8 بئر لكل حاله بالتوازي. - افتح علامة تبويب خريطة اللوحة وحدد خريطة اللوحة عن طريق تعيين المجموعات إلى ابار محدده.
ملاحظه: سيتم ملء الآبار الزاوية الاربعه (A1 ، A12 ، H1 ، H12) مع العازلة TYH (اي السائل المنوي) وسوف تستخدم في وقت لاحق لطرح الخلفية. - افتح علامة التبويب بروتوكول ، وأضف 4 دورات قياس مختلفه ، وحدد المنفذ المعني وحرر تفاصيل القياس (الشكل 2، الجدول 1). تسليط الضوء علي قياس بعد الحقن وعدم تسليط الضوء علي تتوازن.
- احفظ قالب الفحص ، وأملا ملخص المشروع وحدد موقع حفظ ملف النتائج.
- اعداد المركبات للتحميل في خرطوشه الاستشعار
- اعداد 2 مل من 50 مم db-كامب عن طريق تذويب 9.8 ملغ من مجمع في العازلة TYH وأضافه IBMX إلى تركيز نهائي من 5 ملم.
ملاحظه: IBMX لديه الميل إلى ان يعجل بعد المخفف في المخزن المؤقت TYH. ويمكن حل الرواسب عن طريق فورتكينغ واحتضان الحل TYH/db-كامب/IBMX في كتله حرارة 37 درجه مئوية لمده 5 دقائق. - اعداد 1 مل من 500 mM 2-DG عن طريق تذويب 82.1 ملغ من مجمع في العازلة TYH.
- اعداد 1 مل من 5 μM من أنتا/تعفن عن طريق تمييع كل من المخدرات في العازلة TYH.
ملاحظه: يتم تخفيف المركبات 10 اضعاف عن طريق الحقن في خرطوشه محلل تدفق خارج الخلية; لذلك ، تاكد من ان حلول الحقن هي 10x أكثر تركيزا.
- اعداد 2 مل من 50 مم db-كامب عن طريق تذويب 9.8 ملغ من مجمع في العازلة TYH وأضافه IBMX إلى تركيز نهائي من 5 ملم.
- عزل الماوس السائل المنوي
- تخدير 3 الفئران الذكور بين 8 و 16 أسبوعا من ايزوفلواني والتضحية الفئران بخلع عنق الرحم بعد ان تم الكشف عن اي استجابه لمعسر اصبع القدم. أزاله البربخ و فأسا ديفيديتيا.
- ضع كل متلازم في 500 μl من المخزن المؤقت tyh مسبقه التسخين في لوحه 24 بئر جيدا ، وشل متلازم إلى الجزء السفلي من لوحه باستخدام زوج من ملقط وفتح الانسجه عن طريق اجراء شقوق صغيره 5-7 مع مقص ريشه.
- نقل لوحه علي الفور إلى غير CO2 37 درجه مئوية حاضنه والسماح لل السائل المنوي تفريق لمده 15 دقيقه.
- تحميل خرطوشه الاستشعار
- يتم توفير دليلين لتحميل المنفذين للمنفذين A و D والمنفذين B و C في مجموعه التدفق خارج الخلية. لتحميل منفذ معين ، قم بازاله الغطاء من خرطوشه المستشعر ومحاذاة حرف دليل تحميل المنفذ الخاص به مع الزاوية اليسرى العليا من الخرطوشة. اثناء الحقن ، استخدم أطراف أصابع اليد غير المحقونة للاحتفاظ بدليل تحميل المنفذ في مكانه وادراج تلميحات الماصة عموديا في ثقوب دليل تحميل المنفذ.
- المنفذ A: باستخدام ماصه متعددة القناات ، احقن 20 μL من المخزن المؤقت TYH في كل عمود.
- المنفذ B: حقن 22 μL من المخزن المؤقت TYH في العمود 1-4 ، ضخ 22 μL من 500 mM 2-DG في العمود 5-8 ، و 25 μL من 5 μM AntA/تعفن في العمود 9-12.
- المنفذ C: حقن 25 μL من المخزن المؤقت TYH في كل عمود مع الأرقام الفردية ، حقن 25 μL من 10 مم db-كامب/500 μM IBMX في كل عمود مع أرقام حتى.
- وضع خرطوشه الاستشعار مع لوحه المعايرة في محلل تدفق خارج الخلية وبدء الفحص. المعايرة تاخذ 10-15 دقيقه.
- اعداد لوحات السائل المنوي
- حل 45 ملغ من الجيش الصربي البوسني في 15 مل من العازلة tyh (3 مغ/مل ث/الخامس) واعداد ثلاثه قسامات من 3 مل بوسنيا/tyh حل كل في أنابيب الطرد المركزي 5 مل.
- الجمع بين اثنين من الآبار المنوية في كل واحده 1.5 mL أنبوب الطرد المركزي, عد السائل المنوي باستخدام الخلايا الدموية وتمييع السائل المنوي إلى تركيز 2 × 107 السائل المنوي/مل.
ملاحظه: استخدم نصائح الماصة لتقطيع السائل المنوي لتجنب اتلاف الخلايا. - الطرد المركزي السائل المنوي لمده 3 دقائق في 700 x g، أزاله ماده طافي وأضافه 1 مل من العازلة tyh. كرر الخطوة طرد ، وأزاله supernatant ، ونقل كل العنبر تعليق قسامه في واحده 5 مل أنبوب الطرد المركزي مع 3 مل من جيش صرب الجمهورية/tyh.
- مكان 180 μL من TYH العازلة في كل زاوية جيدا (A1 ، A12 ، H1 ، H12) من لوحه كونا المغلفة. مكان 180 μL من تعليق العنبر في كل بئر فارغه من لوحه كونا المغلفة (1.2 x 106 العنبر/بئر).
- الطرد المركزي لوحه العنبر في 250 x g لمده 1 دقيقه ، وتدوير لوحه من قبل 180 درجه ، والطرد المركزي مره أخرى في 250 x g لمده 1 دقيقه (ادني معدل الكبح 1).
- أزاله لوحه المعايرة من محلل تدفق خارج الخلية وأضافه صفيحه العنبر. استمر في الفحص
- استخراج البيانات وتحليلها
- بعد الانتهاء من الفحص ، قم بازاله الخرطوشة ، وافتح ملف النتائج ، وانقر علي علامة التبويب تصدير وقم بتصدير التشغيل المكتمل باعتباره ملف غراكباي بريزم (الملف الإضافي 2: بيانات المثال الاساسيه المستخدمة لشكل 3).
- قم بتكرار ملف ECAR و OCR بالنقر فوق علامة تبويب جديده ثم علامة التبويب العائلة المكررة (الشكل 3ا).
- تحذف الصفوف السبعة الاولي من البيانات (الشكل 3(ب)).
- تطبيع إلى نقطه البيانات قبل حقن كامب/IBMX بواسطة السطر الأساسي طرح الصف 1. انقر فوق علامة التبويب تحليل ، ثم في علامة التبويب أزاله الأساس والعمود الرياضيات . تمييز الصف (الصفوف) المحددة: الصف الأول، الحساب: النسبة: القيمة/الأساس، والاعمده الفرعية: تجاهل العمود الفرعي. انقر فوق موافق (الشكل 3ج).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يستخدم هذا الأسلوب محلل تدفق خارج الخلية لمراقبه التغيرات في الوقت الحقيقي في معدل تحلل الجلوكوز و oxphos اثناء الماوس المنوية. ويبين الشكل 4 تجربه مثاليه حيث تم تمكين السائل المنوي في وجود الجلوكوز كركيزة الطاقة الوحيدة و 2-DG و انتيمايسين و والروتينون كما المغيرين الدوائية. الركيزة الطاقة في محلل تدفق خارج الخلية TYH العازلة والجهري الدوائية يمكن اختيارها بحريه اعتمادا علي الهدف من التجربة. تم ربط السائل المنوي غير القادر علي الماوس في الجيش الصربي البوسني/TYH بالجزء السفلي من الغرفة المصغرة العابرة المغلفة بالقاعدة من خلال رؤوسهم. في هذا المثال ، كانت قيم ECAR القاعدية والتعرف الضوئي علي الحروف في المتوسط بين جميع الآبار المكتشفة 12.76 ± 2.75 mpH/min و 23.64 ± 2.78 pmol/min ، علي التوالي.
بعد حقنه وهميه مع العازلة TYH ، تليها حقنه من 2-DG والنمل/تعفن لمنع تحلل الجلوكوز والاكسده فوسفولات ، علي التوالي ، وكان المستحثة السائل المنوي عن طريق حقن db-كامب/IBMX.
وتظهر النتائج التمثيلية انه في وجود الجلوكوز ، يرافق السعه زيادة 7 اضعاف في معدل الحموضة خارج الخلية (ECAR) ، والذي يعوقه انسداد تحلل مع 2-DG (الشكل 4ا). تظهر النطاف المنوية زيادة بمقدار 20 ضعفا في معدل استهلاك الأكسجين (OCR) مقارنه بالسائل المنوي غير القابل للزيادة (الشكل 4ب) ، مما يدل علي ان السائل المنوي للماوس يعزز كلا من تحلل الجلوكوز والفوسفات المؤكسد لدعم الطلب المتزايد علي الطاقة اثناء السعه. يتم تثبيط الارتفاع في ecar خلال السائل المنوي من قبل مثبطات تحلل الجلوكوز 2-DG ، ولكن لا يتاثر بمثبطات فوسفولات الاكسده انتيمايسين A و والروتينون (الشكل 4ج) ، مشيرا إلى ان التغيير في ecar هو أساسا يحركهاH + الإفراج عن تحلل. الزيادة في OCR هو ، كما هو متوقع ، سدت من قبل انتيمايسين A و والروتينون (الشكل 4د) ، ولكن يتم منعه أيضا من قبل 2-DG (الشكل 4ب) الكشف عن ان الزيادة في oxphos خلال السائل المنوي يعتمد علي النشاط غليكولتيك.
الشكل 1: مبدا محلل التدفق خارج الخلية. (A) بسبب انهيار الجلوكوز إلى اللاكتات اثناء تحلل الخلايا وتوليد CO2 عن طريق دوره التكوين ، ويرافق التغيرات في تحلل و Oxphos بواسطةH + إفراز في وسائل الاعلام خارج الخلية. محلل XFe96 بالكشف عن هذه التغييرات فيH + الخلية التركيز كما ecar. في موازاة ذلك ، يتم قياس التغيرات في تركيز O2 خارج الخلية بسبب o2 الاستهلاك بواسطة فوسفولات الاكسده كما OCR. منع تحلل الجلوكوز مع 2-ديوكسيكوز (2-DG) أو التنفس مع المجمع الأول والمركب الثالث المثبطات والروتينون و انتيميسين A يكشف عن المسارات الايضيه التي تدعم زيادة الطلب علي الطاقة اثناء السائل المنوي. (B) يتم إرفاق السائل المنوي الماوس عن طريق رؤوسهم إلى الجزء السفلي من الغرفة الصغيرة المغلفة كونا. ساريه الحرية تتحرك بحريه. في حين يتم الكشف عن التغيرات في التركيز الخارج عن الخليةh + و o2 بواسطةh +-و o2-الحساسة فلوبهورس لمجس الاستشعار ، يمكن حقن ما يصل إلى أربعه مركبات مختلفه بالتتابع. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: التمثيل التخطيطي للتجربة النموذجية. يتم الكشف عن التغييرات في ECAR (mpH/min) والتعرف الضوئي علي الحروف (pmol O2/min) في السائل المنوي غير السعه والسعه باستخدام محلل تدفق خارج الخلية. دوره 1: القاعدية ECAR والقيم OCR. دورات 2-5: استقرار النظام بعد حقن وهميه TYH. دورات 6-8: حضانة المخدرات. دورات 9-27: النطفة السعه. تشير الأسهم إلى الحقن. 2-DG: التركيز النهائي 50 mM ، AntA/تعفن: التركيز النهائي 0.5 μM ، db-كامب: التركيز النهائي 1 مم ، IBMX: التركيز النهائي 500 μM. الرجاء النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تحليل البيانات. (ا) البيانات الخام للتغيرات في ecar اثناء الماوس المنوية السعه. (ب) البيانات بعد أزاله النقاط السبع الاولي من البيانات. (ج) تطبيع البيانات إلى نقطه البيانات قبل حقن المعسكر/ibmx. يتم عرض البيانات كمتوسط ل7-8 الآبار ± يتم الاشاره إلى حقن S.E.M. مع سهم. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: التغيرات في تحلل الجلوكوز والاكسده المؤكسدة اثناء الماوس السائل المنوي التقوية. (ا) ecar تطبيع في السائل المنوي الماوس غير السعه والسعه في وجود وغياب 50 mM 2-DG. (B) الحروف الدقيقة التي تم تطبيعها في السائل المنوي الخاص بالماوس غير السعه والسعه في وجود وغياب 50 mM 2-DG. (ج) ecar تطبيع في السائل المنوي الماوس غير السعه والسعه في وجود وغياب 0.5 μM انتيمايسين A و rotenone. (د) الحروف الاوليه التي تم تطبيعها في السائل المنوي للماوس غير السعه والسعه في وجود وغياب 0.5 μM انتيمايسين A و rotenone. يتم عرض البيانات باعتبارها المتوسطة ± s. .M إلى نقطه البيانات قبل حقن db-كامب/IBMX; n = 6. يتم الاشاره إلى الحقن مع السهم. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
| منفذ | عدد الدورات | مزيج (دقيقه) | الانتظار (دقيقه) | قياس (دقيقه) | |
| A: القاعدية ECAR/OCR | لا يوجد منفذ | 1 | 2:00 | 0:00 | 3:00 |
| B: حقن وهميه | 1 | 4 | 2:00 | 0:00 | 3:00 |
| C: حقن المخدرات | 2 | 3 | 2:00 | 0:00 | 3:00 |
| D: السعه | 3 | 18 | 2:00 | 0:00 | 3:00 |
الجدول 1: تفاصيل القياس.
الشكل التكميلي 1: سعة السائل المنوي للماوس في محلل تدفق خارج الخلية العازلة TYH. فوسفولات من بقايا تيروزين من السائل المنوي الماوس الكشف عنها في نقاط زمنيه مختلفه خلال السعه (0-90 دقيقه) بعد الحضانة في (A) tyh مع 25 مم hco3-، 3 ملغ/مل بوسنيا و 20 مم hepes أو في (B) محلل تدفق خارج الخلية tyh مع 5 مم db-كامب ، 500 μM ibmx ، و 1 مم hepes ، المكتشفة مع الأجسام المضادة α-فوسففوتوروسين. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الملف التكميلي 1: قالب فحص الموجه للكشف عن التغيرات في تحلل الجلوكوز والاكسده المؤكسدة اثناء الماوس المنوي. ويمكن تحميل برنامج سطح المكتب موجه مجانا بعد ملء استمارة التسجيل (www.agilent.com/en/products/cell-analysis/cell-analysis-software/data-analysis/wave-desktop-2-6) وتثبيتها علي ويندوز 7, 8 أو 10, (ماك OSx 10.11 (أو اعلي) مع المتوازيات 12 (أو اعلي). التالي ، يمكن إنشاء قوالب الموجه بشكل مستقل عن محلل تدفق خارج الخلية ، وتصديرها ثم استيرادها إلى برنامج موجه من اي محلل تدفق خارج الخلية. الرجاء انقر هنا لعرض هذا الملف (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل).
الملف التكميلي 2: ملف المنشور الخاص بلوحه الرسم البياني الذي تم تصديره من برنامج موجه مع تحليل البيانات المثالي. الرجاء انقر هنا لعرض هذا الملف (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد كشف فقدان القدرة المنوية للمني في غياب بعض الركائز الايضيه أو الانزيمات الايضيه الحرجة عن استقلاب الطاقة كعامل رئيسي يدعم الإخصاب الناجح. التبديل الأيضي اثناء تنشيط الخلية هو مفهوم راسخ في أنواع الخلايا الأخرى ، ومع ذلك ، نحن مجرد بداية لفهم كيف السائل المنوي تكييف الأيض لزيادة الطلب علي الطاقة اثناء السعه. باستخدام محلل تدفق خارج الخلية ، قمنا بتطوير أداه قابله للتطبيق بسهوله لمراقبه التغيرات في تحلل الجلوكوز والاكسده في الوقت الحقيقي خلال السائل المنوي. الكشف عن التغيرات في خارج الخليةH + و O2 مع فلوبهوريس التي تم تعبئتها لمجس استشعار هو الحد الأدنى من التوغل والاربعه منافذ الحقن تعمل بشكل فردي تسمح التلاعب مع مثبطات الدوائية أو المنشطات في نقاط زمنيه متميزة قبل أو اثناء عمليه السعه. يعطي هذا البروتوكول مثالا واحدا فقط لتجربه الفاره المنوية. لتبسيط تفسير النتائج اخترنا العرض تجربه مثاليه حيث تم استخدام الجلوكوز كمصدر الطاقة الوحيد. الظروف متغيرة تبعا للهدف من التجربة ، وتصل إلى 12 ظروف مختلفه (اي ، مصادر الطاقة المختلفة مثل الجلوكوز مقابل الجلوكوز و pyruvate) يمكن ان تقاس بالتوازي. بالاضافه إلى ذلك ، تسمح أربعه منافذ حقن مستقله بحقن المنشطات الدوائية و/أو المثبطات في اي نقطه زمنيه مطلوبه قبل أو اثناء السعه. هذا يفتح امكانيه استخدام محلل تدفق خارج الخلية كجهاز فحص شبه الانتاجيه. علي غرار الماوس السائل المنوي ، في أنواع أخرى مثل الإنسان أو الأبقار فانه لا يزال غامضا كيف تغير النطفة الأيض خلال السعه. ويمكن تكييف البروتوكول بسهوله ؛ التالي ، نوصي بتحسين تركيز السائل المنوي في كل مره قبل بدء تجربه حقيقية.
الحد الأكبر للبروتوكول هو ان نتائج عاليه الجودة لا يمكن تحقيقها الا في غياب بيكربونات. بيكربونات في السائل المنوي هو الاشاره الفسيولوجية التي تستهل النطفة التي تشير إلى تتالي بعد القذف. بيكربونات ينشط القابلة للذوبان adenylyl سيكلواز (sAC; ADCY10), اي يحفز التحويل ال [أتب] داخل مخيم23. الزيادة في المخيم ثم يدفع تتالي الإشارات بوساطة بروتين كيناز a, الأمر الذي يؤدي في نهاية المطاف إلى المصب تيروزين فوسفولات من البروتينات المستهدفة (علي سبيل المثال, قنوات أيون, الانزيمات الايضيه, والبروتينات الهيكلية24,25). يتم التغلب علي هذا التقييد ضد بيكربونات عن طريق حقن المنتج من الكيس المنشط البيكربونات ، كامب. نحن نستخدم 5 ملم من الخلية--نفاذيه كامب التناظرية db-كامب في موازاة مع المثبط فوسفوديستريس واسعه الخصوصية IBMX ، والذي يمنع التدهور السريع للمخيم db بواسطة فوسفوديستراسيس. هذا المزيج يبدا بشكل فعال في معسكر تنظيم السعه الإشارات المسار بعد تفعيل الكيس مع الحركية مماثله كما بيكربونات (الشكل التكميلي 1). بالتوازي مع بيكربونات ، يتم استخدام متقبل الكولسترول (علي سبيل المثال ، جيش صرب البوسنيين) في المختبر لتقويه السائل المنوي القذف الطازج أو العنبر تشريحها من البربخ متلازم. لا يمكن حقن الزلال لأنه يسد منفذ الحقن ، التالي ، يجب اضافته إلى المخزن المؤقت للعنبر قبل طلاء الخلايا. وكشف أداء التجربة في وجود أو غياب جيش الصرب البوسنيين ان الزيادة في ECAR و OCR خلال السعه المنوية مستقله عن متقبل الكولسترول. ومع ذلك ، فان وجود الجيش الصربي البوسني في مخزن السائل المنوي قلل من التقلبات في قيم ECAR و OCR المكتشفة بين الآبار والتجارب المختلفة ؛ التالي ، فاننا نوصي بشده بما في ذلك جيش صرب البوسنيين في مخزن العنبر لزيادة استنساخ.
يؤدي عزل النطفة من البربخ إلى تلوث السائل المنوي بالسوائل البربخ. لتجنب النتائج الاصطناعية بسبب مكونات السوائل المنوية ، نوصي بغسل السائل المنوي مرتين قبل استخدامها لتجربه. تركيز السائل المنوي والطلاء هو عامل حاسم آخر تحديد نجاح التجربة. وللحصول علي نتائج موثوقه ، توصي الشركة المصنعة بان تكون قيم ECAR الاوليه أكبر من 10 وان تكون قيم OCR أكبر من 20. تم تحسين تركيز السائل المنوي المستخدم في هذا البروتوكول بحيث يكون متوسط قيم ECAR و OCR القاعدية لآبار 7-8 التي تقاس لكل حاله فوق 10 و 20 علي التوالي. تحريك السائل المنوي بحريه يزعج الكشف عن التغيرات فيH + و O2خارج الخلية. التالي ، فمن الضروري التمسك بجميع السائل المنوي مع رؤوسهم إلى الجزء السفلي من لوحه. وجدنا النجاح التمسك السائل المنوي عن طريق طلاء لوحه مع كونا ، وهو نبات لكتين التي تتفاعل علي وجه التحديد مع غشاء اكروسوال الخارجي ويشيع استخدامها لبعض المقايسات26، والغزل بلطف لوحه (انظر الخطوة 2.7.3). مع هذه الطريقة ، يتم ترجمه السائل المنوي إلى الجزء السفلي من البئر فقط عن طريق رؤوسهم حتى يتمكنوا من التحرك بحريه ساريه الشكل وتغيير نمط الضرب الخاص بهم اثناء التاهيل.
السائل المنوي باستمرار البثقH + و O2 في كل من ، وغير السعه والدولة التي تم تمكينها. لتحديد ECAR الاوليه والتعرف الضوئي علي الحروف بأكبر قدر ممكن من الدقة ، من المهم لبدء التجربة بأسرع ما يمكن بعد خطوه الغسيل الاخيره. ويمكن تحقيق ذلك عن طريق تحميل خرطوشه الاستشعار في حين ان السائل المنوي هو السباحة والبدء في الأسلوب في محلل تدفق خارج الخلية قبل خطوه الغسيل الاولي. معايره الصك ياخذ تقريبا نفس الوقت مثل الغسيل والطلاء الخلايا والغزل لوحه. توصي الشركة المصنعة بمرحله تاخيرمن للسماح للنظام بالاستقرار قبل قياس نقطه البيانات الحقيقية الاولي. بما ان البروتوكول يتضمن 8 دورات قياس قبل بدء السعه ، لتوفير الوقت ، يتم استبعاد الخطوة تاخيرمن من هذا البروتوكول.
القدرة علي حقن الحلول اثناء الفحص ومراقبه اثارها علي التنفس ومعدل غليكولتيك في الوقت الحقيقي هو ميزه رئيسيه لمحلل تدفق خارج الخلية. تحميل خرطوشه الاستشعار هي واحده من الخطوات الحاسمة في البروتوكول وينبغي ان تنفذ بعناية. لضمان الحقن السليم في جميع الآبار ، يجب ان تحتوي كل سلسله من الموانئ علي نفس الحجم ، بما في ذلك الآبار الخلفية. تحميل المنافذ مع ماصه متعددة القناات يتطلب بعض الممارسة ولكن يقلل من تقلب ووقت التحميل إلى حد كبير. ونحن نوصي بشده باستخدام الميناء دليل التحميل ولكن لضخ أربعه منافذ فقط في وقت واحد. ومن المهم أيضا ان نقدر انه اثناء التحميل ، يتم زيادة كميات الحقن تدريجيا للتعويض عن زيادة حجم في البئر. اثناء تحميل خرطوشه المستشعر ، من المهم عدم ادراج التلميحات بشكل كامل في المنفذ. هذا قد دفع قبل الأوان محلول الحقن من خلال فوهه الميناء. في حين ان إنشاء الطريقة وجدنا ان حقن السائل في العنبر جيدا يسبب التحف حقن غير مرغوب فيه, ربما بسبب التخفيف من المني في البئر و/أو تشريد المني من أسفل البئر. الحقنه الاولي تسبب أكبر قطعه أثريه للحقن ، لذلك قمنا بتضمين حقنه وهميه مع العنبر العازلة في جميع الآبار في بداية البروتوكول.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.
Acknowledgments
ويود أصحاب البلاغ ان ينووا بالدعم المقدم من الدكتور لافازييه راموس-اسبسيتو في مركز روكفلر للموارد العالية الانتاجيه والطيفية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| 2-Deoxy-D-glucose | Sigma-Aldrich | D8375 | 2-DG |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I7018 | IBMX; prepare a 500 mM stock solution in DMSO (111.1 mg/ml) and store in small aliquots |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | AntA; prepare a 5 mM stock solution in DMSO (2.7 mg/ml) and store in small aliquots |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A1470 | BSA |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | CaCl2 |
| Concanacalin A, Lectin from Arachis hypogaea (peanut) | Sigma-Aldrich | L7381 | ConA |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| Isothesia | Henry Schein Animal Health | 1169567761 | Isoflurane |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M2643 | MgSO4 |
| N6,2'-O-Dibutyryladenosine 3',5'-cyclic monophosphate sodium salt | Sigma-Aldrich | D0627 | db-cAMP |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | KCl |
| Potassium dihydrogen phosphate | Sigma-Aldrich | P5655 | KH2PO4 |
| Rotenone | Cayman Chemical Company | 13995 | Rot; prepare a 5 mM stock solution in DMSO (2mg/ml) and store in small aliquots |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | NaHCO3- |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | NaCl |
| Equipment and materials | |||
| 12 channel pipette 10-100 μL | eppendorf | ES-12-100 | |
| 12 channel pipette 50-300 μL | vwr | 613-5257 | |
| 37 °C, non-CO2 incubator | vwr | 1545 | |
| 5 mL cetrifuge tubes | eppendorf | 30119380 | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | vwr | 76211-286 | |
| Centrifuge with plate adapter | Thermo Scientific | IEC FL40R | |
| Dissection kit | World Precision Instruments | MOUSEKIT | |
| Inverted phase contrast microscope with 40X objective | Nikon | ||
| OctaPool Solution Reservoirs, 25 ml, divided | Thomas Scientific | 1159X93 | |
| OctaPool Solution Reservoirs, 25 mL, divided | Thomas Scientific | 1159X95 | |
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent | ||
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent | 102416-100 | Also sold as XFe96 FluxPak mini (102601-100) with 6 instead of 18 cartidges. |
References
- Wu, M., et al. Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 292 (1), C125-C136 (2007).
- Amo, T., Yadava, N., Oh, R., Nicholls, D. G., Brand, M. D. Experimental assessment of bioenergetic differences caused by the common European mitochondrial DNA haplogroups H and T. Gene. 411 (1-2), 69-76 (2008).
- Choi, S. W., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G. Bioenergetic analysis of isolated cerebrocortical nerve terminals on a microgram scale: spare respiratory capacity and stochastic mitochondrial failure. Journal of Neurochemistry. 109 (4), 1179-1191 (2009).
- de Groof, A. J., et al. Increased OXPHOS activity precedes rise in glycolytic rate in H-RasV12/E1A transformed fibroblasts that develop a Warburg phenotype. Molecular Cancer. 8, 54 (2009).
- Chao, L. C., et al. Insulin resistance and altered systemic glucose metabolism in mice lacking Nur77. Diabetes. 58 (12), 2788-2796 (2009).
- Chang, M. C. Fertilizing capacity of spermatozoa deposited into the fallopian tubes. Nature. 168 (4277), 697-698 (1951).
- Austin, C. R., Bishop, M. W. Role of the rodent acrosome and perforatorium in fertilization. Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 149 (935), 241-248 (1958).
- Ishijima, S., Baba, S. A., Mohri, H., Suarez, S. S. Quantitative analysis of flagellar movement in hyperactivated and acrosome-reacted golden hamster spermatozoa. Molecular Reproduction and Development. 61 (3), 376-384 (2002).
- Suarez, S. S.
- Goodson, S. G., Qiu, Y., Sutton, K. A., Xie, G., Jia, W., O'Brien, D. A. Metabolic substrates exhibit differential effects on functional parameters of mouse sperm capacitation. Biology of Reproduction. 87 (3), 75 (2012).
- Travis, A. J., et al. Functional relationships between capacitation-dependent cell signaling and compartmentalized metabolic pathways in murine spermatozoa. Journal of Biological Chemistry. 276 (10), 7630-7636 (2001).
- Urner, F., Leppens-Luisier, G., Sakkas, D. Protein tyrosine phosphorylation in sperm during gamete interaction in the mouse: the influence of glucose. Biology of Reproduction. 64 (5), 1350-1357 (2001).
- Danshina, P. V., et al. Phosphoglycerate kinase 2 (PGK2) is essential for sperm function and male fertility in mice. Biology of Reproduction. 82 (1), 136-145 (2010).
- Miki, K., et al. Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase-S, a sperm-specific glycolytic enzyme, is required for sperm motility and male fertility. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (47), 16501-16506 (2004).
- Mori, C., et al. Mouse spermatogenic cell-specific type 1 hexokinase (mHk1-s) transcripts are expressed by alternative splicing from the mHk1 gene and the HK1-S protein is localized mainly in the sperm tail. Molecular Reproduction and Development. 49 (4), 374-385 (1998).
- Westhoff, D., Kamp, G. Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase is bound to the fibrous sheath of mammalian spermatozoa. Journal of Cell Science. 110 (15), 1821-1829 (1997).
- Nevo, A. C., Rikmenspoel, R.
- Adam, D. E., Wei, J. Mass transport of ATP within the motile sperm. Journal of Theoretical Biology. 49 (1), 125-145 (1975).
- Tombes, R. M., Shapiro, B. M. Enzyme termini of a phosphocreatine shuttle. Purification and characterization of two creatine kinase isozymes from sea urchin sperm. Journal of Biological Chemistry. 262 (33), 16011-16019 (1987).
- Gomendio, M., Tourmente, M., Roldan, E. R. Why mammalian lineages respond differently to sexual selection: metabolic rate constrains the evolution of sperm size. Proceedings of the Royal Society of Biological Sciences. 278 (1721), 3135-3141 (2011).
- Tourmente, M., Villar-Moya, P., Rial, E., Roldan, E. R. Differences in ATP generation via glycolysis and oxidative phosphorylation and relationships with sperm motility in mouse species. Journal of Biological Chemistry. 290 (33), 20613-20626 (2015).
- Visconti, P. E., et al. Capacitation of mouse spermatozoa. II. Protein tyrosine phosphorylation and capacitation are regulated by a cAMP-dependent pathway. Development. 121 (4), 1139-1150 (1995).
- Buck, J., Sinclair, M. L., Schapal, L., Cann, M. J., Levin, L. R. Cytosolic adenylyl cyclase defines a unique signaling molecule in mammals. PNAS. 96 (1), 79-84 (1999).
- Visconti, P. E., Bailey, J. L., Moore, G. D., Pan, D., Olds-Clarke, P., Kopf, G. S. Capacitation of mouse spermatozoa. I. Correlation between the capacitation state and protein tyrosine phosphorylation. Development. 121 (4), 1129-1137 (1995).
- Morgan, D. J., et al. Tissue-specific PKA inhibition using a chemical genetic approach and its application to studies on sperm capacitation. PNAS. 105 (52), 20740-20745 (2008).
- Lybaert, P., Danguy, A., Leleux, F., Meuris, S., Lebrun, P. Improved methodology for the detection and quantification of the acrosome reaction in mouse spermatozoa. Histology and Histopathology. 24 (8), 999-1007 (2009).
