Summary
इस लेख में, हम एक्सॉन लंघन के बाद डिस्ट्रोफिन एमआरएनए और प्रोटीन के स्तर की बहाली का मूल्यांकन करने के लिए MYOD1-परिवर्तितमूत्र-व्युत्पन्न कोशिकाओं का उपयोग करके ड्यूचेर्न मस्कुलर डिस्ट्रॉफी मांसपेशियों के कुशल मॉडलिंग के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं।
Abstract
ड्यूचेर्न मस्कुलर डिस्ट्रॉफी (डीएमडी), एक प्रगतिशील और घातक मांसपेशियों की बीमारी, डीएमडी जीन में उत्परिवर्तन के कारण होती है जिसके परिणामस्वरूप डिस्ट्रोफिन प्रोटीन की अनुपस्थिति होती है। आज तक, हमने मॉर्फोलिनो ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के प्रणालीगत इंजेक्शन के आधार पर न्यूरोलॉजी और मनोरोग के राष्ट्रीय केंद्र में एक अन्वेषक-प्रारंभिक प्रथम-इन-ह्यूमन अध्ययन पूरा कर लिया है जो एक्सोन-53 लंघन से ग्रस्त हैं। डीएमडी के प्रभावी उपचार के लिए, डीएमडी रोगियों से प्राप्त मायोब्लास्ट के साथ इन विट्रो परीक्षण दवाओं को स्क्रीन करने और नैदानिक परीक्षण शुरू करने से पहले रोगी पात्रता का आकलन करना आवश्यक माना जाता है। हाल ही में, हमने डीएमडी के सेलुलर मॉडल के रूप में हिस्टोन मिथाइलट्रांसफरेन्से अवरोधक (3-deazaneplanocin A हाइड्रोक्लोराइड) के साथ इलाज किया गया एक नया MYOD1-परिवर्तितमूत्र-व्युत्पन्न सेल (यूडीसी) की सूचना दी। नए ऑटोलॉगस यूडीसी डीएमडी के रोग-विशिष्ट फेनोटाइप की फेनोकॉपी दिखा सकता है, जिससे मांसपेशियों से संबंधित विभिन्न बीमारियों में सटीक दवा का उपयोग हो सकता है। इस लेख में, हम एक्क्रोन लंघन के बाद डिस्ट्रोफिन एमआरएनए और प्रोटीन के स्तर की बहाली का मूल्यांकन करने के लिए रिवर्स ट्रांसक्रिटेज़ पॉलीमरेज चेन रिएक्शन (आरटी-पीसीआर), वेस्टर्न ब्लॉटिंग और इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री के साथ MYOD1-परिवर्तितयूडीसी का उपयोग करके डीएमडी मांसपेशी कोशिकाओं के कुशल मॉडलिंग के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं।
Introduction
ड्यूचेर्न मस्कुलर डिस्ट्रॉफी (डीएमडी), एक प्रगतिशील, घातक मांसपेशी रोग, डीएमडी जीन में फ्रेम-शिफ्ट म्यूटेशन के कारण होता है जिसके परिणामस्वरूप डिस्ट्रोफिन प्रोटीन1की अनुपस्थिति होती है। एंटीसेंस ओलिगोन्यूक्लियोटाइड आधारित एक्सोन लंघन चिकित्सा डीएमडी के लिए वादा करने के लिए सोचा है । यह थेरेपी डीएमडी रीडिंग फ्रेम2को बहाल करने के लिए प्री-एमआरएनए स्प्लिकिंग में फेरबदल करके गंभीर डीएमडी फेनोटाइप को मामूली बेकर मस्कुलर डिस्ट्रॉफी जैसी फेनोटाइप में बदलने पर आधारित है। हमने हाल ही में फॉस्फोरोडिडेट मॉर्फोलिनो ओलिगोमर (पीएमओ) विल्टोलरसेन के बार-बार नसों में प्रशासन के आधार पर एक पहला मानव अध्ययन पूरा किया है, जो डीएमडी में एक्सोन 53 लंघन को प्रेरित कर सकता है, और एक उत्कृष्ट सुरक्षा प्रोफ़ाइल, आशाजनक प्रभावकारिता, और स्वीकार्य फार्माकोकिनेटिक पैरामीटर (यूएमआईएन के रूप में पंजीकृत: 000010964 और ClinicalTrials.gov: एनसीटीएनसी020811111) का प्रदर्शन कियाहै।
हालांकि, रोग के लिए लागत प्रभावी और कुशल उपचार विकसित करने के लिए, डीएमडी रोगियों से प्राप्त प्राथमिक मांसपेशी कोशिकाओं का उपयोग करइन विट्रो परीक्षणनैदानिक परीक्षण शुरू करने से पहले दवा स्क्रीनिंग और रोगी पात्रता सत्यापन के लिए आवश्यक हैं, साथ ही बायोमार्कर जो मानव परीक्षणों के दौरान लंघन उपचार ों की प्रभावकारिता को दर्शाते हैं4। हाल ही में, हमने डीएमडी7के प्राथमिक मायोब्लास्ट मॉडल के रूप में रोगी-विशिष्ट MYOD1-परिवर्तितमूत्र-व्युत्पन्न कोशिकाओं (यूडीसी)5,,6 को विकसित करने के लिए एक उपन्यास तकनीक की सूचना दी। इस प्रकार, मायोब्लास्ट उत्पन्न करने के लिए, केवल रोगियों से मूत्र के संग्रह की आवश्यकता होती है और किसी आक्रामक प्रक्रिया की आवश्यकता नहीं होती है। इस लेख में, हम एक्पोन लंघन के बाद बहाल डिस्ट्रोफिन एमआरएनए और प्रोटीन का मूल्यांकन करने के लिए 3-deazaneplanocin एक हाइड्रोक्लोराइड के साथ इलाज MYOD1-परिवर्तितयूडीसी का उपयोग करDMD मांसपेशी के कुशल मॉडलिंग के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं।
Protocol
नेशनल सेंटर ऑफ न्यूरोलॉजी एंड मनोरोग की एथिक्स कमेटी ने इस अध्ययन (अनुमोदन आईडी: A2017-018, A2018-029) को मंजूरी दी। सभी व्यक्तियों ने मूत्र प्रदान करने से पहले सूचित सहमति दी। सभी प्रयोग संबंधित दिशा-निर्देशों और विनियमों के तहत किए गए थे ।
1. यूडीसी की अलगाव और प्राथमिक संस्कृति
नोट: यूडीसी कुछ संशोधनों के साथ एक पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल8,,9,,10 के अनुसार अलग थे ।
- निष्फल प्लास्टिक की बोतलों में सहज micturition के दौरान मूत्र के नमूने ले लीजिए।
नोट: बाहरी मूत्रमार्ग छिद्र की नसबंदी की आवश्यकता नहीं है। वायरल संदूषण के जोखिम को कम करने के लिए मिडस्ट्रीम मूत्र वांछनीय है। यदि अगली प्रक्रिया से पहले स्टॉक समय >1 h है, तो सेल व्यवहार्यता को संरक्षित करने के लिए मूत्र के नमूनों को 4 डिग्री सेल्सियस तक स्थानांतरित किया जाना चाहिए। हालांकि, 4 डिग्री सेल्सियस के तापमान से बचा जाना चाहिए क्योंकि अघुलनशील उपजी दिखाई दे सकती है। - कमरे के तापमान पर 10 मीटर के लिए 400 x ग्राम पर पूरे मूत्र नमूना अपकेंद्रित।
- अलौकिक, ट्यूब में 1 mL छोड़ने।
- मूत्र के शेष 1 mL में व्यक्तिगत रूप से छर्रों को फिर से निलंबित करें और फिर एक ही 50 मीटर ट्यूब में उन लोगों को इकट्ठा करें।
- वॉशिंग बफर के 10 एमएल जोड़ें जिसमें कैल्शियम और मैग्नीशियम के बिना पीबीएस के ९९ एमएल, 1% पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन (पी/एस), ०.५ μg/mL एम्फोटेरिसिन बी, और कमरे के तापमान पर 10 min के लिए २०० x ग्राम पर नमूनों को अपकेंद्री ।
- अलौकिक, ट्यूब में 0.2 mL छोड़ने।
- उच्च ग्लूकोज Dulbecco के संशोधित ईगल माध्यम (DMEM) सोडियम पायरुवेट और हैम एफ-12 पोषक तत्व मिश्रण के बिना सोडियम पायरुवेट और हैम एफ-12 पोषक तत्व मिश्रण के 1:1 मिश्रण से बना प्राथमिक माध्यम के 4.5 mL में सेल छर्रों को फिर से निलंबित करें, हाइड्रोकॉर्टिसोन, एपिनेफ्रीन, टी 3, ट्रांसफरिन, 10% टेट्रासाइक्लिन-फ्री भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस), 1% पी/एस, और 0.5 μg/mL एम्होटेरिसिन बी
- जिलेटिन-लेपित छह अच्छी प्लेटों (प्रत्येक कुएं की कुल मात्रा, 1.5 मिली) के तीन कुओं में कोशिकाओं को बीज करें। संस्कृति 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर 24 घंटे के लिए आर्द्र।
- अगले 3 दिनों के लिए दैनिक प्राथमिक माध्यम के 1.5 mL जोड़ें।
- 4 दिन, विकास माध्यम के 1.5 मिलील के साथ माध्यम की जगह पुनः संयोजन मानव EGF के साथ पूरक, इंसुलिन, हाइड्रोकॉर्टिसोन, एपिनेफ्रीन, टी 3, ट्रांसफरिन, 15% टेट्रासाइक्लिन-फ्री एफबीएस, 05% एल-एलेन-एल-ग्लूटामाइन, 0.5% गैरजरूरी अमीनो एसिड, और 2.5 एनजी/एमएल फाइब्रोब्लास्ट ग्रोथ फैक्टर- बेसिक (बीएफजीएफ), रिकॉम्बिनेंट ह्यूमन प्लेटलेट-व्युत्पन्न ग्रोथ फैक्टर (पीडीजीएफ), ईजीएफएफ, और 1% पी/एस/
- हर दूसरे दिन विकास माध्यम बदलें।
नोट: यूडीसी कॉलोनियां एक सप्ताह के भीतर दिखाई देती हैं। - जब यूडीसी संस्कृति 80−90% कन्फ्लोरेंट हो जाती है, तो पीबीएस के साथ मध्यम और धोने की कोशिकाओं को हटा दें, 0.25% ट्राइप्सिन-ईडीटीए और बीज का उपयोग करके सभी कोशिकाओं को 3,000-5,000 कोशिकाओं/सेमी2 पर एक नए जिलेटिन-लेपित 60 मिमी पकवान (मार्ग 1) पर विभाजित करें।
नोट: यूडीसी को तरल नाइट्रोजन में संग्रहीत किया जा सकता है। यूडीसी को आमतौर पर 60 मिमी संस्कृति डिश में 60−70% कन्फ्लोरेंस को तीन स्टॉक ट्यूबों में विभाजित किया जाता है।
2. रेट्रोवायरल निर्माण
- पॉलीमरेज चेन रिएक्शन (पीसीआर) द्वारा MYOD1 (NM_002478.4) प्लाज्मिड के कोडिंग क्षेत्र को बढ़ाना।
नोट: MYOD1 प्रवर्धन और थर्मल साइकिलर के लिए शर्तों के लिए मिश्रण क्रमशः तालिका 1 और तालिका 2में दिखाया गया है। - 0.7% अगारोज जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा लगभग 1,000 बीपी आकार के एक बैंड का पता लगाएं, जो इस बात की पुष्टि करने के लिए कि MYOD1 अनुक्रम सफलतापूर्वक परिलक्षित होता है।
- क्लीन-अप किट का उपयोग करके पीसीआर उत्पाद को साफ करें और स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के साथ इसकी एकाग्रता निर्धारित करें।
- मिश्रण को इनक्यूबेट करें, जैसा कि टेबल 3 में 37 डिग्री सेल्सियस पर दिखाया गया है, जो कई क्लोनिंग साइट में प्रतिबंध एंजाइम-लक्षित क्षेत्रों में टीईटी-ऑन सिस्टम और प्यूरोमाइसिन प्रतिरोधी जीन के साथ रेट्रोवायरल वेक्टर को पचाने के लिए रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर दिखाया गया है।
- पचाने वाले उत्पाद के 1 माइक्रोन का उपयोग करके 0.7% अगारोज जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा एक बैंड का पता लगाएं ताकि यह पुष्टि की जा सकी कि रेट्रोवायरल वेक्टर सफलतापूर्वक पचा गया था।
- साफ-सुथरी किट का उपयोग करके पचाए गए उत्पाद को साफ करें और स्पेक्ट्रोफोटोमीटर द्वारा इसकी एकाग्रता निर्धारित करें।
- प्रवर्धित MYOD1 टुकड़े (चरण 2.1−2.3 द्वारा उत्पादित) को पचाने वाले रेट्रोवायरल वेक्टर (चरण 2.4−2.6 द्वारा उत्पादित) में क्लोन करने के लिए, एक इन-फ्यूजन क्लोनिंग प्रतिक्रिया करते हैं। तालिका 4में दिखाए गए प्रतिक्रिया को सेट करें, 50 डिग्री सेल्सियस पर 15 सीन के लिए प्रतिक्रिया को इनक्यूबेट करें, और फिर बर्फ पर रखें।
- निर्माता के निर्देशों(सामग्री की तालिका)के अनुसार ई. कोलाई सक्षम कोशिकाओं का उपयोग करके परिवर्तन करें।
- 10 जी/एल बैक्टो ट्राइप्टोन, 5 जी/एल बैक्टो खमीर निकालने, 5 जी/एल नैल, 15 जी/एल बैक्टो एगर, और 50 मिलीग्राम/एल एमपिसिलिन से मिलकर एलबी कल्चर प्लेट पर खेती करके परिवर्तित सक्षम कोशिकाओं का चयन करें।
- 200 आरपीएम पर बैक्टो आगार के बिना एलबी कल्चर मीडियम में चयनित कॉलोनी और कल्चर को रातोंरात 37 डिग्री सेल्सियस पर उठाएं।
- एक प्लाज्मिड शुद्धिकरण किट(सामग्री की तालिका)का उपयोग करके MYOD1-डालारेट्रोवायरल वेक्टर को शुद्ध करें और स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके मात्रा निर्धारित करें।
- पुष्टि करें कि MYOD1 सही ढंग से डाला MYOD1 अनुक्रम भर में दोनों पक्षों पर क्रमशः लक्षित आगे और रिवर्स प्राइमर द्वारा परिलक्षित पीसीआर उत्पाद के प्रत्यक्ष अनुक्रमण द्वारा रेट्रोवायरल वेक्टर में डाला जाता है ।
नोट: MYOD1 अनुक्रम रेट्रोवायरल वेक्टर दृश्यों के बीच सैंडविच का पता लगाया जा सकता है जब संलयन क्लोनिंग सफल है । - रेट्रोवायरल उत्पादन के लिए, 10 सेमी कोलेजन-कोटेड प्लेटों और डीएमईएम में संस्कृति पर 50,000 कोशिकाओं/सेमी2 पर पैकेजिंग कोशिकाओं को बीज करें, जिसमें 10% एफबीएस 37 डिग्री सेल्सियस पर आर्द्रऔर 24 घंटे के लिए 5% सीओ2।
- जब पैकेजिंग कोशिकाएं 80% कन्फ्यूजन तक पैदा होती हैं, तो MYOD1के 30 μg-डाला रेट्रोवायरल वैक्टर, पैकेजिंग वैक्टर के 30 μg, और ट्रांसफेक्शन रिएजेंट युक्त सेल-मर्मज्ञ पेप्टाइड(सामग्री की तालिका)भंवर द्वारा, और उन्हें 10 00 के लिए इनक्यूबेट करें।
- इनक्यूबेटेड मिश्रण को पैकेजिंग कोशिकाओं और संस्कृति के माध्यम से 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2पर मिलाएं ।
नोट: कोलेजन कोटिंग आवश्यक है। ट्रांसफेक्शन सीडिंग के बाद 24 घंटे या उससे अधिक में बेहतर हो सकता है क्योंकि पैकेजिंग कोशिकाएं आसानी से संस्कृति प्लेट से अलग हो जाती हैं। - 4 घंटे या रातोंरात के बाद, मध्यम को नए विकास के माध्यम में बदलें।
- वायरल अलौकिक ले लीजिए और cotransfection के बाद 24 और ४८ घंटे में ताजा माध्यम के साथ बदलें और अलौकिक गठबंधन ।
- वायरल सुपरनेटेंट को ध्यान में रखने के लिए, इसे रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर कंसोटेंट और इनक्यूबेट के साथ मिलाएं, फिर 4 डिग्री सेल्सियस पर 45 मीटर के लिए 1,500 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र करें।
- 0.45 माइक्रोन छिद्रों के साथ पीवीडीएफ फिल्टर के माध्यम से रेट्रोवायरस सुपरनेटेंट को फ़िल्टर करें।
- निर्माता के निर्देशों के अनुसार मात्रात्मक पीसीआर किट और थर्मल साइकिलर सिस्टम का उपयोग करके रेट्रोवायरल वेक्टर के टिटर की जांच करें।
- वायरल सुपरनेटेंट को छोटे एलिकोट में बांटें और उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टॉक करें।
3. यूडीसी में MYOD1-रेट्रोवायरलवेक्टर के साथ संक्रमण
- एक जिलेटिन-लेपित ६० मिमी पकवान पर 3,000-5,000 कोशिकाओं/सेमी2 पर यूडीसी बीज ।
- सीडिंग के 24 घंटे के बाद, 8 μg/mL की एकाग्रता पर हेक्साडिमेथ्रिन ब्रोमाइड जोड़कर २०० के संक्रमण की बहुलता पर गल रेट्रोवायरस (चरण २.२१) को संक्रमित करें ।
- 24 घंटे इनक्यूबेशन 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2पर आर्द्रता के बाद, संस्कृति माध्यम को नए विकास माध्यम के साथ प्रतिस्थापित करें जिसमें 1 μg/mL puromycin युक्त MYOD1-ट्रांसड्यूडकोशिकाओं का चयन करने के लिए । हर दूसरे दिन माध्यम बदलें।
नोट: MYOD1-सकारात्मककोशिकाओं के लिए चयन करते समय, चयन के लिए आमतौर पर 1 μg/mL प्यूरोमाइसिन का उपयोग किया जाता है। उचित खुराक निर्धारित की जानी चाहिए। ट्रांसट्रांस संक्रमित कोशिकाओं वाली प्लेट का उपयोग करें और खुराक चुनें जो 3−5 दिनों में सभी कोशिकाओं को मारता है। MYOD1- पॉजिटिव कोशिकाओं का चयन प्यूरोमाइसिन जोड़ने के बाद 7−10 दिनों के भीतर किया जाना चाहिए। MYOD1-ट्रांसड्यूड यूडीसी को तरल नाइट्रोजन में संग्रहीत किया जा सकता है।
4. MYOD1-ट्रांसड्यूडयूडीसी का मायोजेनिक भेदभाव 3-deazaneplanocin एक हाइड्रोक्लोराइड (DZNep) के साथ इलाज
नोट: हाल ही में, यह बताया गया है कि DZNep, एक हिस्टोन मिथाइलट्रांसफरेज अवरोधक, MYOGENIN,देर से मांसपेशियों के नियामक कारकों में से एक की अभिव्यक्ति को काफी बढ़ावा दे सकता है, और मायोट्यूब भेदभाव7का नेतृत्व भी कर सकता है।
- प्लेट MYOD1-3.5x 104 कोशिकाओं/सेमी2के घनत्व पर कोलेजन-लेपित कुओं में यूडीसी ट्रांसड्यू किया । संस्कृति 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2पर आर्द्र
- 24 घंटे के बाद, एल-एलेन-एल-ग्लूटामाइन, 5% हॉर्स सीरम, आईटीएस सप्लीमेंट, 1 μg/mL doxycycline, और 5 μ DZNep के साथ उच्च ग्लूकोज DMEM से बना विकास माध्यम को बदलें ।
नोट: 10 एमएम DZNep समाधान 3 महीने के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। डिफ्रॉस्ट फ्रीजर का उपयोग करें और बार-बार फ्रीज-गल चक्र से बचें। दोनों MYOD1 डॉक्सीसाइक्लिन और DZNep द्वारा सक्रिय प्रसार को दबाने और UDCs के मायोजेनिक भेदभाव को बढ़ावा देने । इसलिए, यह सिफारिश की जाती है कि मेयोजेनिक भेदभाव को शामिल करने के बाद डॉक्सीसाइक्लिन और डीजेडनेप को जोड़ा जाता है। DZNep एक खुराक पर निर्भर तरीके से MYOD1-UDCsके मायोजेनिक भेदभाव को बढ़ावा देता है । दूसरी ओर, यह एक उच्च एकाग्रता पर साइटोटॉक्सिकिटी दिखाता है। इसलिए, मायोजेनिक भेदभाव और सेलुलर जैव उपलब्धता पर इसके प्रभावों के आधार पर 1−10 माइक्रोन से लेकर डीजेडनेप की उचित एकाग्रता निर्धारित करें। - 3 दिनों के बाद, DZNep के बिना भेदभाव माध्यम को ताजा भेदभाव माध्यम में बदलें। इसके बाद हर 3 दिन में मीडियम बदलें।
नोट: यूडीसी एक दूसरे के लिए फ्यूज और भेदभाव के बाद 1−2 सप्ताह के भीतर मायोट्यूब बनाते हैं ।
5. MYOD1में लंघन Exon-परिवर्तित यूडीसी
नोट: यहां, तीन प्रोटोकॉल रोगी-व्युत्पन्न कोशिकाओं में लंघन का मूल्यांकन करने के लिए वर्णित हैं: 1) रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज़ पॉलीमरेज चेन रिएक्शन (आरटी-पीसीआर) डिस्ट्रोफिन एमआरएनए की; 2) पश्चिमी दाग द्वारा बहाल डिस्ट्रोफिन प्रोटीन सिग्नल का अर्धक्वांटिफिकेशन; और 3) इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री द्वारा बहाल डिस्ट्रोफिन फ्लोरेसेंस सिग्नल का अर्धक्वैकाकरण। सभी तरीकों एक खुराक पर निर्भर तरीके से लंघन exon का पता लगा सकते हैं ।
- आरटी-पीसीआर द्वारा दक्षता लंघन एक्सोन का मूल्यांकन
- MYOD1में एंटीसेंस ओलिगोन्यूक्लियोटाइड (एएसओ) को स्थानांतरित करने के लिए-परिवर्तित यूडीसी भेदभाव के बाद 7 दिन डीएमडी रोगियों से प्राप्त, मिश्रण ASO, ट्रांसफेक्शन रिएजेंट(सामग्री की तालिका),और भेदभाव माध्यम 1−10 μM की अंतिम एकाग्रता के लिए । संस्कृति ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2पर humidified ।
- एएसओ के साथ इनक्यूबेशन के 72 एच के बाद, एएसओ के बिना मध्यम को ताजा भेदभाव माध्यम में बदल ें।
- एएसओ ट्रांसफेक्शन के 3−7 दिनों से, भेदभाव माध्यम को हटा दें और पीबीएस के साथ 1x धोएं। सेल लिसिस बफर जोड़ें, यूडीसी को लाज़ करें और आरएनए निष्कर्षण किट का उपयोग करके कुल आरएनए को काटें।
- एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के साथ आरएनए एकाग्रता को मापें।
- टेबल 5के अनुसार पीसीआर ट्यूबों में एक कदम आरटी-पीसीआर प्रतिक्रिया के लिए आवश्यक अभिकर्मकों को मिलाएं ।
- पीसीआर ट्यूबों को मिश्रण के साथ थर्मोसाइकिलर में रखें। तालिका 6 के अनुसार थर्मोसाइकिलर चलाएं।
- माइक्रोचिप इलेक्ट्रोफोरेसिस करें और नीचे के रूप में मोलर एकाग्रता का उपयोग करके एक्सोन लंघन दक्षता की गणना करें।
Exon लंघन दक्षता (%) = छोड़ दिया बैंड/
नोट: पीसीआर उत्पाद को अल्पकालिक भंडारण के लिए 4 डिग्री सेल्सियस या दीर्घकालिक भंडारण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर फ्रिज में स्टोर करें।
- वेस्टर्न ब्लॉटिंग द्वारा लंघन के बाद डिस्ट्रोफिन का पता लगाना
- 5.1.1 और 5.1.2 कदमों के अनुसार ट्रांसफेक्ट एएसओ और कल्चर MYOD1-यूडीसी।
- हर 3 दिन में मीडियम बदलें।
- भेदभाव के 2 सप्ताह के बाद, रेडियोइम्यूनोप्रिसिप्रिशन परख (RIPA) बफर प्रोटीज़ अवरोधकयुक्त का उपयोग कर सुसंस्कृत कोशिकाओं से कुल प्रोटीन निकालें ।
- 15 डिग्री सेल्सियस पर 15 मीटर के लिए बर्फ और अपकेंद्रित्र पर लिसिस का टीलेका करें।
- सुपरनेट ले लीजिए और बीसीए प्रोटीन परख किट का उपयोग कर प्रोटीन सांद्रता निर्धारित करते हैं।
- 0.5 एमएल ट्यूब में कुल प्रोटीन का 15 माइक्रोग्राम जोड़ें और रिपा बफर को जोड़कर पतला करें जिसमें प्रोटीज़ अवरोधक ों को 10 माइक्रोन की कुल मात्रा में जोड़ा गया है। 15 माइक्रोग्राम प्रति लेन कुल प्रोटीन चलाएं।
- नमूना बफर जोड़ें, एजेंट को कम करने, और deionized पानी के रूप में तालिका 7में दिखाया गया है । कुरूप ने 10 मिन के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर सेल का लियट्स किया है।
- 8.95 ग्राम/एल ट्राइसिन, 6.06 ग्राम/एल ट्रिस बेस, 1.0 ग्राम/एल सोडियम डोडेसिल सल्फेट (एसडीएस) युक्त ट्रिस-एसीटेट रनिंग बफर तैयार करें।
- ट्राई-एसीटेट 3−8% जेल पर नमूना (20 माइक्रोन) लोड करें और 75 मिन के लिए 150 वी पर इलेक्ट्रोफोरेसिस करें।
- मेथनॉल के बिना ब्लॉटिंग बफर तैयार करें।
- मेथनॉल में 20 एस के लिए पीवीडीएफ झिल्ली को भिगोएं और फिर उपयोग (कम से कम 10 0) तक ब्लॉटिंग बफर में। मिडी जैल का उपयोग करके मिनी जैल और 8 x 12 सेमी का उपयोग करके पीवीडीएफ झिल्ली को 6 x 8 सेमी के आकार में काट लें।
- ब्लॉटिंग पेपर्स को पीवीडीएफ झिल्ली के समान आकार में काट लें और उपयोग तक ब्लॉटिंग बफर में उन लोगों को भिगो दें।
- इलेक्ट्रोफोरेसिस के बाद, जेल को पीवीडीएफ झिल्ली के समान आकार में काट लें और जेल को आसुत पानी में भिगो दें।
- सेमीड्राई ट्रांसफर उपकरण(चित्रा 1)पर ब्लॉटिंग पेपर, पीवीडीएफ झिल्ली और जेल रखें। 30 मिन के लिए 4 एमए/सेमी2 पर ट्रांसफर।
- आसुत पानी के साथ झिल्ली 2x कुल्ला।
- एंटी-डिस्ट्रोफिन (1:500) और एंटी-α-ट्यूबलिन (1:1,200) एंटीबॉडी को प्राथमिक एंटीबॉडी के रूप में तैयार करें।
- एक माध्यमिक एंटीबॉडी के रूप में एचआरपी-कॉन्जुगेड एंटी-माउस एंटीबॉडी (1:100) तैयार करें।
- प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ झिल्ली को इनक्यूबेट करें, वॉश बफर से धोएं, फिर कमरे के तापमान पर स्वचालित पश्चिमी प्रसंस्करण उपकरण(सामग्री की तालिका)का उपयोग करके माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट करें।
नोट: एंटी-α-ट्यूबलिन एंटीबॉडी आमतौर पर लोडिंग नियंत्रण के रूप में उपयोग किया जाता है। मिश्रित प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान, जिसमें 1:500 एंटी-डिस्ट्रोफिन और 1:1,200 एंटी-α-ट्यूबलिन एंटीबॉडी अच्छी तरह से काम करते हैं जब एंटीबॉडी प्रतिक्रिया एक साथ की जाती है। - आसुत पानी में झिल्ली कुल्ला।
- केमिल्यूमिनेसेंट डिटेक्शन रिएजेंट और चार्ज-कपल्ड डिवाइस (सीसीडी) कैमरा बेस्ड इमेजर का इस्तेमाल करप्रोटीन का पता लगाएं ।
- उपयुक्त सॉफ्टवेयर का उपयोग कर डेटा का विश्लेषण करें।
- इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री द्वारा लंघन के बाद डिस्ट्रोफिन का पता लगाना
- सीधे कोलेजन-लेपित 96 अच्छी प्लेट में मायोट्यूब में यूडीसी को 4.1−4.3 चरणों के अनुसार रीप्रोग्राम करें।
- 5.1.2 और 5.1.3 चरणों के अनुसार एएसओ और संस्कृति MYOD1-UDCS को स्थानांतरित करें।
- 2 सप्ताह के भेदभाव के बाद, कोशिकाओं को पीबीएस से धोएं और उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मीटर के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड में ठीक करें।
- कमरे के तापमान पर 10 न्यूनतम के लिए 0.1% nonionic डिटर्जेंट में MYOD1-UDCsPermeabilize और 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 min के लिए 10% बकरी सीरम के साथ उन ब्लॉक।
- कोशिकाओं को रात भर प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
- पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धोएं और कमरे के तापमान पर 30 न्यूनतम के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ उन को इनक्यूबेट करें।
नोट: यहां, माउस एंटी-डिस्ट्रोफिन (1:30) का उपयोग प्राथमिक एंटीबॉडी के रूप में किया जाता है, एंटी-माउस आईजीजी का उपयोग माध्यमिक एंटीबॉडी के रूप में किया जाता है, और होचस्ट (1:10,000) का उपयोग नाभिक धुंधला के लिए किया जाता है। - फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग करके प्लेटों को इमेज करें और एक एनालाइजर का उपयोग एक ही स्थिति के तहत हर कुएं में स्वचालित रूप से फ्लोरेसेंस सिग्नल को अर्धनिर्धारित करने के लिए करें।
Representative Results
हम यूडीसी को आसानी से और गैर-आक्रामक रूप से एकत्र कर सकते हैं। यूडीसी ने प्राथमिक सेल संस्कृति शुरू करने के एक सप्ताह के भीतर उपनिवेशों का गठन किया, हमने एक चिह्नित प्रसार क्षमता देखी। यूडीसी की संस्कृति सीधी थी, और जब प्रक्रिया को सही ढंग से किया गया था तो बैक्टीरियल या फंगल संदूषण दुर्लभ था।
चित्रा 2 प्राथमिक संस्कृति(चित्र ा 2ए)और MYOD1-UDCsभेदभाव के बाद एक सप्ताह के बाद एक सप्ताह के यूडीसी कॉलोनी के प्रतिनिधि चरण-विपरीत छवियों से पता चलता है(चित्र ा 2बी)। चित्रा 3 आरटी-पीसीआर द्वारा डीएमडी रोगियों से प्राप्त यूडीसी में एक्सोन लंघन का सफल पता दिखाता है। चित्रा 3ए डीजेडनेप में एंटीसेंस ओलिगोन्यूक्लियोटाइड उपचार के बाद डिस्ट्रोफिन के आरटी-पीसीआर विश्लेषण से पता चलता है-इलाज MYOD1-UDCs DMD जीन में एक exon 45-54 हटाने के साथ एक 6 वर्षीय पुरुष से व्युत्पन्न । खुले पढ़ने के फ्रेम एक्सोन ४४ लंघन द्वारा बहाल किया गया था । भेदभाव के बाद 14 दिन पर, हमने खुराक-निर्भर तरीके से लंघन करने वाले एक्सोन के शामिल होने की पुष्टि की(चित्रा 3बी)। ऊपरी बैंड देशी उत्पादों को निरूपित करते हैं, और निचले बैंड एक्सॉन 44-छोड़े गए उत्पादों को निरूपित करते हैं जिन्होंने खुले पढ़ने के फ्रेम को बहाल किया।
चित्रा 4 एक खुराक पर निर्भर तरीके से पश्चिमी दाग द्वारा डीएमडी रोगियों से प्राप्त UDCs में लंघन के बाद डिस्ट्रोफिन का सफल पता लगाने से पता चलता है । हमने इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री(चित्रा 5)का उपयोग करके बहाल डिस्ट्रोफिन अभिव्यक्ति का भी पता लगाया। हमने 96 अच्छी प्लेट(चित्रा 5ए)पर एंटीसेंस ओलिगोन्यूक्लियोटाइड (एएसओ) ट्रांसफेक्शन के 1 सप्ताह बाद फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के साथ डिस्ट्रोफिन की तीव्रता को मापा। MYOD1में स्पष्ट रूप से उच्च फ्लोरोसेंट संकेत देखे गए -यूडीसी का इलाज MYOD1-UDCsकी तुलना में एएसओ के साथ किया गया नियंत्रण एएसओ(चित्रा 5बी)के साथ इलाज किया गया ।
इन परिणामों से पता चलता है कि हमारी नई परख MOD1में कुशलता से लंघन एक्सोन का मूल्यांकन कर सकते है-UDCs MRNA और प्रोटीन स्तर पर DMD रोगियों से प्राप्त की ।
चित्रा 1: अर्धशुष्क पश्चिमी दाग के लिए स्थानांतरण ढेर का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। ब्लॉटिंग बफर में लथपथ दो कागजात निगेटिव टर्मिनल पर रखे गए थे और बफर में लथपथ दो पेपर इसी के ऊपर खड़ी थे । बफर में भिगोए गए जेल को पीवीडीएफ झिल्ली के ऊपर धीरे से रखा गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2: यूडीसी की प्रतिनिधि छवियां। (क)प्राथमिक संस्कृति के एक सप्ताह बाद यूडीसी की चरण-विपरीत छवि। स्केल बार = 200 माइक्रोन इनसेट: सफेद आयत में क्षेत्र की एक बढ़ाया छवि। (ख)अंतर के एक सप्ताह बाद MYOD1-UDCsकी चरण विपरीत छवि । स्केल बार = 50 माइक्रोन। इस आंकड़े को ताकिजावा एट अल7से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 3: आरटी-पीसीआर द्वारा डीएमडी रोगियों से प्राप्त मूत्र-व्युत्पन्न कोशिकाओं (यूडीसी) में लंघन का सफल मूल्यांकन। (A)3-deazaneplanocin एक हाइड्रोक्लोराइड (DZNep) में एंटीसेंस ओलिगोन्यूक्लियोटाइड उपचार के बाद डिस्ट्रोफिन का आरटी-पीसीआर विश्लेषण- इलाज MYOD1-UDCs ड्यूचेर्न मस्कुलर डिस्ट्रॉफी (डीएमडी) रोगी से प्राप्त एक एक्सॉन 45-54 हटाने के साथ। DZNep-इलाज MYOD1-UDCsभी नियंत्रण के रूप में 1-10 μM एकाग्रता पर नियंत्रण एंटीसेंस के साथ इलाज किया गया । ऊपरी बैंड अनस्किप्ड उत्पाद (पूर्व 45-54 विलोपन) थे जो पढ़ने के फ्रेम से बाहर रहे। निचले बैंड एक्सोन 44-छोड़ े गए उत्पाद (पूर्व 44-54 विलोपन और पूर्व 44 छोड़ े गए) थे जिन्होंने खुले पढ़ने के फ्रेम को बहाल किया। (ख)लंघन दक्षता की गणना माइक्रोचिप इलेक्ट्रोफोरेसिस प्रणाली का उपयोग करके (एक्सोन 44-छोड़ी गई प्रतिलिपि मोलारिटी) /(देशी + एक्सन 44-छोड़ी गई ट्रांसक्रिप्ट मोलारिटी [तीरों के साथ चिह्नित]) x 100% के रूप में की गई थी। बोनफेरोनी के पोस्ट हॉक टेस्ट के बाद एक तरह से एनोवा का उपयोग लंघन क्षमता (प्रत्येक समूह के लिए एन = 3, *****P < 0.0001) की तुलना करने के लिए किया गया था। डेटा मतलब ± एसईएम के रूप में व्यक्त कर रहे हैं । इस आंकड़े को ताकिजावा एट अल7से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 4: पश्चिमी दाग द्वारा डीएमडी रोगियों से मूत्र-व्युत्पन्न कोशिकाओं (यूडीसी) में लंघन एक्सोन का सफल मूल्यांकन। (A)डीजेडनेप में डिस्ट्रोफिन के लिए प्रतिनिधि पश्चिमी दाग-इलाज MYOD1-UDCsDMD रोगी से एक exon 45-54 हटाने के साथ ४४ लंघन के बाद । डिस्ट्रोफिन डिटेक्शन के लिए एंटी डिस्ट्रोफिन (सी-टर्मिनल के खिलाफ) का इस्तेमाल किया गया। (ख)α-tubulin अभिव्यक्ति के लिए सामान्यीकृत बैंड की सापेक्ष तीव्रता रोगी-व्युत्पन्न कोशिकाओं में एक तरह से ANOVA प्रदर्शन करके एक तरह से ANOVA प्रदर्शन द्वारा तुलना की गई थी (n = 3 प्रत्येक समूह के लिए, * * पी & ०.०१, ***P <०.००१, एचआई = स्वस्थ व्यक्ति) । इस आंकड़े को ताकिजावा एट अल7से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 5: DZNep में एंटीसेंस ओलिगोन्यूक्लियोटाइड उपचार के बाद डिस्ट्रोफिन के लिए इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री के हीटमैप्स-इलाज MYOD1-UDCsexon 45-54 हटाने के साथ DMD रोगी से प्राप्त की । (A)एक्सोन 45-54 को हटाने ने एक्सोन 44 के एक्सॉन लंघन के आधार पर ओपन रीडिंग फ्रेम को बहाल कर दिया। (ख)96 अच्छी प्लेट पर एंटीसेंस ओलिगोन्यूक्लियोटाइड ट्रांसफेक्शन के 1 सप्ताह के बाद फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग करके सिग्नल तीव्रता की मात्रा निर्धारित की गई थी। बोनफेरोनी के पोस्ट हॉक टेस्ट के बाद एक तरह से एनोवा का उपयोग तुलना (प्रत्येक समूह के लिए एन = 3-4, ***** पी एंड लेफ्टिनेंट; 0.0001) के लिए किया गया था। इस आंकड़े को ताकिजावा एट अल7से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
| अभिकर्मक | आयतन | अंतिम एकाग्रता |
| 2x पीसीआर प्रीमिक्स | 12.5 माइक्रोन | 1x |
| फॉरवर्ड प्राइमर | 5 बजे | 0.2 माइक्रोन |
| रिवर्स प्राइमर | 5 बजे | 0.2 माइक्रोन |
| टेम्पलेट | 80 एनजी | |
| स्टरलाइज्ड आसुत पानी | 25 माइक्रोन तक | |
| प्रति प्रतिक्रिया कुल मात्रा | 25 माइक्रोन |
तालिका 1: आरटी-पीसीआर द्वारा MYOD1 प्रवर्धन के लिए मिश्रण।
| 98 डिग्री सेल्सियस | 10 एस | |
| 55 डिग्री सेल्सियस | 10 एस | }35 चक्र |
| 72 डिग्री सेल्सियस | 10 एस |
तालिका 2: MYOD1 प्रवर्धन के लिए थर्मल साइकिलर के लिए शर्तें।
| अभिकर्मक | आयतन |
| 10x कश्मीर बफर | 2 माइक्रोन |
| रेट्रोवायरल वेक्टर (500 एनजी/μL) | 2 माइक्रोन |
| प्रतिबंध एंजाइम 1 (2−15 यू) | 1 μL |
| प्रतिबंध एंजाइम 2 (2−15 यू) | 1 μL |
| स्टरलाइज्ड आसुत पानी | 14 माइक्रोन |
| कुल मात्रा | 20 माइक्रोन |
तालिका 3: रेट्रोवायरल वेक्टर को पचाने के लिए ट्यूब के लिए मिश्रण।
| अभिकर्मक | आयतन |
| शुद्ध MYOD1 टुकड़ा | 100 एनजी |
| पचा रेट्रोवायरल वेक्टर | 100 एनजी |
| 5x एंजाइम प्रीमिक्स | 4 माइक्रोन |
| स्टरलाइज्ड आसुत पानी | 20 μL तक |
| कुल मात्रा | 20 माइक्रोन |
तालिका 4: इन-फ्यूजन क्लोनिंग प्रतिक्रिया के लिए मिश्रण।
| समाधान | वॉल्यूम/रिएक्शन (μL) | अंतिम एकाग्रता |
| RNase मुक्त पानी | चर | - |
| एक कदम आरटी-पीसीआर बफर | 4 | 1x |
| डीएनटीपी मिक्स (प्रत्येक डीएनटीपी के 10 एमएम युक्त) | 0.8 | प्रत्येक डीएनटीपी के 400 एमएम |
| फॉरवर्ड प्राइमर (10 एमएम) | 1.2 | 0.6 एमएम |
| रिवर्स प्राइमर (10 एमएम) | 1.2 | 0.6 एमएम |
| एक कदम आरटी-पीसीआर एंजाइम मिश्रण | 0.8 | - |
| RNase अवरोधक (वैकल्पिक) | चर | 5−10 इकाइयां/प्रतिक्रिया |
| टेम्पलेट आरएनए | 50−400 एनजी | |
| कुल मात्रा | 20 |
तालिका 5: एक चरण आरटी-पीसीआर की एक प्रतिक्रिया के लिए आवश्यक यौगिक।
| 1 चक्र | रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन | 30 मिन | 50 डिग्री सेल्सियस |
| 1 चक्र | प्रारंभिक पीसीआर सक्रियण कदम | 15 मिन | 95 डिग्री सेल्सियस |
| 1 चक्र | डेनेटुरिशन | 1 मिन | 94 डिग्री सेल्सियस |
| एनियलिंग | 1 मिन | 60 डिग्री सेल्सियस | |
| एक्सटेंशन | 1 मिन | 72 डिग्री सेल्सियस | |
| 1 चक्र | अंतिम विस्तार | 7 मिन | 72 डिग्री सेल्सियस |
| पकड़ | ∞ | 4 डिग्री सेल्सियस |
तालिका 6: एक कदम आरटी-पीसीआर के लिए थर्मल साइकिल रकवे की स्थिति।
| अभिकर्मक | आयतन |
| प्रोटीन (15 μg) | 10 माइक्रोन |
| नमूना बफर (4x) | 5 माइक्रोन |
| एजेंट को कम करना (10x) | 2 माइक्रोन |
| डिओनाइज्ड पानी | 3 माइक्रोन |
| कुल मात्रा | 20 माइक्रोन |
तालिका 7: सोडियम डोडेसिल सल्फेट पॉलीएक्रिलैमाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस (एसडीएस-पेज) के लिए नमूनों की तैयारी।
Discussion
यहां, हम डीएमडी रोगियों से प्राप्त MYOD1-परिवर्तितयूडीसी में एक्सोन लंघन के विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। परख प्रणाली का उपयोग करते हुए, हमने इष्टतम एंटीसेंस दृश्यों की कुशलता से जांच की। हम मानते हैं कि MYOD1-परिवर्तितयूडीसी रोग के रोगविज्ञान की जांच के लिए उपयोगी हो सकता है।
एमआरएनए स्तर पर रोगी-व्युत्पन्न कोशिकाओं का उपयोग करके लंघन करने वाले एक्सोन का मूल्यांकन नई दवाओं की स्क्रीनिंग और नैदानिक परीक्षण शुरू करने से पहले रोगी पात्रता का आकलन करने के लिए अपरिहार्य है । एक्सोन लंघन दक्षता की गणना केवल एमआरएनए स्तर पर मूल्यांकन किया जा सकता है।
प्रोटीन के स्तर पर लंघन एक्सोन का मूल्यांकन भी महत्वपूर्ण है क्योंकि डिस्ट्रोफिन बहाली एक किराए के बायोमार्कर के रूप में महत्वपूर्ण है एक्सॉन लंघन के लाभों की भविष्यवाणी करने के लिए । आज तक, एंटीसेंस ओलिगोन्यूक्लियोटाइड दृश्यों की स्क्रीनिंग अक्सर प्राथमिक मांसपेशी कोशिका रेखाओं का उपयोग करके की जाती है या मानव rhabdomyosarcoma (RD) कोशिकाओं सहित myoblast सेल लाइनों को अमर कर दिया जाता है, लेकिन हम मांसपेशियों की कोशिका रेखाओं या आरडी सेल लाइनों का उपयोग करके डिस्ट्रोफिन के स्तर की वसूली को माप नहीं सकते क्योंकि वे इस प्रोटीन को एंडोजेनेस से व्यक्त करते हैं। हम स्पष्ट रूप से डीएमडी रोगी-व्युत्पन्न MYOD1-UDCsमें डिस्ट्रोफिन की बहाली का पता लगा सकते हैं। हमारे नए परख में, हम मानते है कि पश्चिमी दाग द्वारा बहाल प्रोटीन का मूल्यांकन मात्रात्मकता में बेहतर है । दूसरी ओर, इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री द्वारा मूल्यांकन 96 अच्छी प्लेटों का उपयोग करके एक साथ कई उम्मीदवार यौगिकों की स्क्रीनिंग के लिए आदर्श है।
इस लेख में, हम एक कुशल मॉडलिंग DMD मांसपेशी के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन MYOD1का उपयोग कर-आरटी-पीसीआर, पश्चिमी दाग के साथ UDCs परिवर्तित, और इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री के साथ एकण लंघन के बाद mRNA और प्रोटीन के स्तर पर बहाल डिस्ट्रोफिन का मूल्यांकन करने के लिए । यूडीसी को गैर-आक्रामक रूप से और आसानी से एकत्र किया जा सकता है। इसलिए, हम मानते हैं कि मांसपेशियों के विकारों के प्रकार की परवाह किए बिना ब्रांड-न्यू इन विट्रो परख को बुनियादी और अनुवादअध्ययन की एक विस्तृत श्रृंखला पर लागू किया जा सकता है।
Disclosures
न्यूरोलॉजी और मनोरोग के राष्ट्रीय केंद्र अब एनएस-065/NCNP-01, DMD के लिए एक exon ५३ लंघन दवा विकसित कर रहा है, निप्पॉन Shinyaku कंपनी, लिमिटेड के साथ
Acknowledgments
इस काम को जापान सोसायटी फॉर द प्रमोशन ऑफ साइंस ग्रांट-इन-एड फॉर साइंटिफिक रिसर्च (सी) [ग्रांट नंबर 18के07544 से वाईए] का समर्थन किया गया था, तंत्रिका और मानसिक विकारों पर अनुसंधान के लिए अनुदान में सहायता [वाईए को अनुदान संख्या 28-6], और चिकित्सा अनुसंधान और विकास के लिए जापान एजेंसी [अनुदान नग 18ek0109239h0002, 18lm020303066h0001, और 18lm0203069h0001 को]
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% P/S Solution Stabilized | Thermo Fisher | 15070-063 | Cell culture |
| Amphotericin B | Sigma Aldrich | A2942 | |
| Anti-dystrophin | Abcam | ab15277 | Western blot (WB) |
| Anti-dystrophin | Leica | NCL-DYS1 | Immunocytochemistry(ICC) |
| Anti-mouse IgG, Dylight 488 | Vector Laboratories | DK-2488 | ICC |
| Anti-α-tubulin | Sigma | T6199 | Western bot and ICC |
| BZ-X800 | KEYENCE | BZ-800 | Fluorescent microscope |
| CELLBANKER | ZENOAQ | CB011 | Cell stock in liquid nitrogen |
| ChemiDoc MP Imaging System | Bio-Rad | 170-8280J1 | WB |
| CloneAmp HiFi PCR premix | Clontech | 639298 | Retroviral production |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693116001 | Protein extraction for WB |
| E.coli DH5 α Competent Cells | TAKARA | 9057 | |
| ECL Prime Western Blotting Detection Reagent | GE healthcare | RPN2232 | WB |
| EGF | Peprotech | AF-100-15 | Cell culture |
| Endo-Porter | GeneTools | 2922498000 | ASO transfection |
| Extra Thick Blot Filter Paper | Bio-Rad | 1703965 | WB |
| EzFastBlot HMW | Atto | AE-1460 | WB |
| fibroblast growth factor-basic | Sigma-Aldrich | F0291 | Cell culture |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | Cell culture |
| GP2-293 packaging cells | Clontech | 631458 | Retroviral production |
| Ham's F-12 Nutrient Mix | Thermo Fisher Scientific | 11765-054 | Cell culture |
| High glucose DMEM with GlutaMAX-I | Thermo Fisher Scientific | 10569-010 | Cell culture |
| High glucose DMEM without sodium pyruvate | GE Healthcare | SH30022.01 | Cell culture |
| HiSpeed Plasmid Purification Kit | QIAGEN | 12643 | Retroviral production |
| Histofine Simple Stain MAX PO | NICHIREI BIOSCIENCE INC. | 424151 | WB |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | ICC |
| Human PDGF-AB | Peprotech | 100-00AB-10UG | Cell culture |
| iBind Flex Solution | Thermo Fisher Scientific | SLF2020 | WB |
| iBind Flex Western Device | Thermo Fisher Scientific | SLF2000 | WB (Automated mestern-processing device) |
| Immobilon-P Transfer Membrane (PVDF) | MERCK | IPVH304F0 | WB |
| In-Fusion HD cloning Kit | Clontech | 639648 | Retroviral production |
| ITS Liquid Media Supplement | Sigma-Aldrich | I3146 | Cell culture |
| MILTEX HV 0.45 μm filter | MERCK | SLHV033RS | Retroviral production |
| MultiNA | SHIMADZU | MCE-202 | Microchip electrophoresis |
| MYOD1 (GFP-tagged) | ORIGENE | RG209108 | Retroviral production |
| NanoDrop | Thermo Fisher | ND-ONE-W | Spectrophotometer |
| Nonessential amino acids | Thermo Fisher | 11140-050 | Cell culture |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up Kit | Clontech | 740986.20 | PCR clean up |
| NuPAGE 3-8% Tris-Acetate Protein Gels | Invitrogen | EA03785BOX | WB |
| NuPAGE Antioxidant | Invitrogen | NP0005 | WB |
| NuPAGE LDS Sample Buffer | Invitrogen | NP0007 | WB |
| NuPAGE Sample Reducing Agent | Invitrogen | NP0009 | WB |
| NuPAGE Tris-Acetate SDS Running Buffer | Invitrogen | LA0041 | WB |
| One Step TB Green PrimeScript RT-PCR Kit | TAKARA | RR066A | Titer check of retroviral vector |
| PBS | Thermo Fisher Scientific | 14190-250 | Cell culture |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23227 | WB |
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Sigma-Aldrich | TR-1003 | Retroviral infection |
| pRetroX-TetOne-Puro Vector | Clontech | 634307 | Retroviral vecor |
| Puromycin | Clontech | 631305 | Cell culture |
| QIAGEN OneStep RT-PCR Kit | Qiagen | 210212 | PCR |
| REGM Bullet Kit | Lonza | CC-3190 | Material for growth medium of UDCs |
| REGM SingleQuots | Lonza | CC-4127 | Material for primary medium of UDCs |
| Retrovirus Titer Set | TAKARA | 6166 | Titer check of retroviral vector |
| Retro-X Concentrator | Clontech | 631455 | Retroviral production |
| RIPA buffer | Thermo Fisher Scientific | 89901 | WB |
| RNeasy kit | Qiagen | 74104 | RNA extraction for PCR |
| Tetracycline-free foetal bovine serum | Clontech | 631106 | Cell culture |
| Triton-X | MP Biomedicals | 9002-93-1 | ICC |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco | 25300054 | Cell culture |
| XCell SureLock Mini-Cell | Invitrogen | EI0001 | WB |
| Xfect transfection reagent | Clontech | 631317 | Transfection of plasmids into packaging cells |
References
- Hoffman, E. P., Brown, R. H., Kunkel, L. M. Dystrophin: the protein product of the Duchenne muscular dystrophy locus. Cell. 51, 919-928 (1987).
- Cirak, S., et al. Exon skipping and dystrophin restoration in patients with Duchenne muscular dystrophy after systemic phosphorodiamidate morpholino oligomer treatment: an open-label, phase 2, dose-escalation study. Lancet. 378, 595-605 (2011).
- Komaki, H., et al. Systemic administration of the antisense oligonucleotide NS-065/NCNP-01 for skipping of exon 53 in patients with Duchenne muscular dystrophy. Science Translational Medicine. 10 (437), (2018).
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- Kim, E. Y., Page, P., Dellefave-Castillo, L. M., McNally, E. M., Wyatt, E. J. Direct reprogramming of urine-derived cells with inducible MyoD for modeling human muscle disease. Skeletal Muscle. 6, 32 (2016).
