Summary
Het volgende manuscript beschrijft een nieuwe methode voor het ontwikkelen van een biologisch, gesloten lus neurale feedback systeem genoemd de samengestelde regeneratieve perifere zenuwinterface (C-RPNI). Deze constructie heeft de mogelijkheid om te integreren met perifere zenuwen om efferent motorsignalen te versterken en tegelijkertijd afferente zintuiglijke feedback te geven.
Abstract
Recente vooruitgang in neuroprotheses hebben mensen die leven met extremiteit verlies in staat gesteld om vele functies inheems in de afwezige extremiteit te reproduceren, en dit wordt vaak bereikt door integratie met het perifere zenuwstelsel. Helaas worden momenteel gebruikte methoden vaak geassocieerd met aanzienlijke weefselschade die langdurig gebruik voorkomt. Bovendien, deze apparaten missen vaak een zinvolle mate van zintuiglijke feedback als hun complexe constructie dempt alle trillingen of andere sensaties een gebruiker kan eerder afhankelijk zijn geweest bij het gebruik van meer eenvoudige protheses. De samengestelde regeneratieve perifere zenuwinterface (C-RPNI) werd ontwikkeld als een stabiele, biologische constructie met de mogelijkheid om efferentmotorzenuwsignalen te versterken en tegelijkertijd afferente zintuiglijke feedback te geven. De C-RPNI bestaat uit een segment van vrije huid en spiertransplantatie beveiligd rond een doel gemengde sensorimotorische zenuw, met preferentiële motorische zenuw reinnervation van de spiertransplantatie en zintuiglijke zenuw reinnervation van de huid transplantatie. Bij ratten heeft deze constructie de generatie van samengestelde spieractiemogelijkheden (CMAP's) aangetoond, waardoor het signaal van de doelzenuw van het micro- tot milli-voltniveau wordt versterkt, met signaal-ruisverhoudingen van gemiddeld ongeveer 30-50. Stimulatie van de huidcomponent van de constructie genereert samengestelde sensorische zenuwactie potentialen (CSP's) bij de proximale zenuw. Als zodanig heeft deze constructie veelbelovende toekomstige nut naar de realisatie van de ideale, intuïtieve prothese.
Introduction
Extremiteit amputaties beïnvloeden bijna 1 op 190 Amerikanen1, en hun prevalentie zal naar verwachting toenemen van 1,6 miljoen vandaag tot meer dan 3,6 miljoen in 20502. Ondanks gedocumenteerd gebruik voor meer dan een millennium, moet de ideale prothese nog worden gerealiseerd3. Momenteel bestaan er complexe protheses die in staat zijn om meerdere gewrichtsmanipulaties te maken met het potentieel om veel motorische functies van de inheemse extremiteit4,5te reproduceren. Deze apparaten worden echter niet als intuïtief beschouwd, omdat de gewenste prothesebeweging meestal functioneel gescheiden is van het ingangssignaal. Gebruikers beschouwen deze "geavanceerde protheses" doorgaans moeilijk te leren en daarom niet geschikt voor dagelijks gebruik1,6. Bovendien bieden complexe protheses die momenteel op de markt zijn geen noemenswaardige mate van subtiele zintuiglijke feedback voor adequate controle. Het gevoel van aanraking en proprioceptie zijn van vitaal belang voor het uitvoeren van dagelijkse taken, en zonder deze, eenvoudige handelingen zoals het oppakken van een kopje koffie worden belastend als het volledig afhankelijk is van visuele signalen7,8,9. Om deze redenen worden geavanceerde prothesen geassocieerd met een aanzienlijke mate van mentale vermoeidheid en worden ze vaak omschreven als omslachtig en onbevredigend5,10,11. Om dit aan te pakken, hebben sommige onderzoekslaboratoria protheses ontwikkeld die een beperkte mate van zintuiglijke feedback kunnen bieden via directe neurale interactie12,13,14,15, maar feedback is vaak beperkt tot kleine, verspreide gebieden op de handen en vingers12,13, en sensaties werden opgemerkt als pijnlijk en onnatuurlijk op keer15. Veel van deze studies missen helaas een merkbare follow-up op lange termijn en zenuwhistologie om lokale weefseleffecten af te lijnen, terwijl het opmerken interface mislukking op de schaal van weken tot maanden16.
Voor deze populatie, zou de ideale prothese apparaat high fidelity motorische controle naast zinvolle somatosensorische feedback uit de omgeving van het individu gedurende hun hele leven. Cruciaal voor het ontwerp van deze ideale prothese is de ontwikkeling van een stabiele, betrouwbare interface die gelijktijdige overdracht van afferente somatosensorische informatie met efferent motorsignalen mogelijk zou maken. De meest veelbelovende van de huidige mens-machine interfaces zijn die rechtstreeks interageren met het perifere zenuwstelsel, en recente ontwikkelingen op het gebied van neuro-geïntegreerde protheses hebben gewerkt aan het overbruggen van de kloof tussen bio-elektrische en mechanische signalen17. De huidige interfaces die worden gebruikt zijn: flexibele zenuwplaten14,15,18, extra neurale manchetelektroden13,19,20,21,22,23, weefseldoordringende elektroden24,25,31,32, en intrafascicular elektroden26,27 ,28. Elk van deze methoden heeft echter beperkingen aangetoond met betrekking tot zenuwspecificiteit, weefselletsel, axonale degeneratie, myelineuitputting en/of littekenweefselvorming geassocieerd met chronische inwonende reactie van het vreemde lichaam16,17,18,19. Meer recent, is het gepostuleerd dat een bestuurder achter uiteindelijke geïmplanteerde elektrode mislukking is het significante verschil in moduli Young's tussen elektronisch materiaal en inheemse neurale weefsel. Hersenweefsel is onderworpen aan aanzienlijke microbeweging op een dagelijkse basis, en het is theorie dat de shear stress veroorzaakt door verschillen in moduli Young veroorzaakt ontsteking en uiteindelijke permanente littekens30,31,32. Dit effect wordt vaak verergerd in de ledematen, waar perifere zenuwen zijn onderworpen aan zowel fysiologische microbeweging en opzettelijke extremiteit macromotion. Als gevolg van deze constante beweging, is het redelijk om te concluderen dat het gebruik van een volledig abiotische perifere zenuwinterface is niet ideaal, en een interface met een biologische component zou meer geschikt zijn.
Om aan deze behoefte aan een biologische component tegemoet te komen, ontwikkelde ons laboratorium een biotische zenuwinterface die de Regeneratieve Perifere Zenuwinterface (RPNI) wordt genoemd om getransecteerde perifere zenuwen in een resterende ledemaat te integreren met een protheseapparaat. RPNI fabricage omvat chirurgisch implanteren van een perifere zenuw in een autologe vrije spiertransplantatie, die vervolgens revasculariseert en reinnervates. Ons lab heeft deze biologische zenuwinterface in de afgelopen tien jaar ontwikkeld, met succes in het versterken en overbrengen van motorische signalen in combinatie met geïmplanteerde elektroden in zowel dier- als menselijke proeven, waardoor een geschikte prothesecontrole met meerdere vrijheidsgraden2,34. Daarnaast hebben we afzonderlijk aangetoond zintuiglijke feedback door het gebruik van perifere zenuwen ingebed in huidtransplantaties, de naam van de Dermal Sensory Interface (DSI)3,35. In meer distale amputaties, met behulp van deze constructies tegelijkertijd is haalbaar als motor en zintuiglijke fascicles binnen het doel perifere zenuw kan operatief worden gescheiden. Echter, voor meer proximale niveau amputaties, dit is niet haalbaar als gevolg van vermenging van motorische en zintuiglijke vezels. De Composite Regenerative Peripheral Nerve Interface (C-RPNI) is ontwikkeld voor meer proximale amputaties, en het gaat om het implanteren van een gemengde sensorimotorische zenuw in een constructie bestaande uit vrije spiertransplantatie beveiligd om een segment van dermale graft (Figuur 1). Perifere zenuwen tonen preferentiële gerichte reinnervation, dus zintuiglijke vezels zal re-innervate de huidtransplantatie en motorvezels, de spiertransplantatie. Deze constructie heeft dus de mogelijkheid om tegelijkertijd motorsignalen te versterken en tegelijkertijd somatosensorische feedback te geven36 (figuur 2),waardoor de ideale, intuïtieve, complexe prothese kan worden gerealiseerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierproeven worden uitgevoerd onder goedkeuring van het Committee on the Use and Care of Animals van de Universiteit van Michigan.
OPMERKING: Donorratten krijgen gratis toegang tot voedsel en water voorafgaand aan huid- en spierdonatieprocedures. Euthanasie wordt uitgevoerd onder diepe anesthesie, gevolgd door intra-cardiale kaliumchloride-injectie met een secundaire methode van bilaterale pneumothorax. Elke stam van rat kan theoretisch worden gebruikt met dit experiment; echter, ons laboratorium heeft consistente resultaten bereikt in zowel mannelijke als vrouwelijke Fischer F344 ratten (~ 200-250 g) op twee tot vier maanden oud. Donorratten moeten isogenisch zijn voor de experimentele ratten.
1. Bereiding van het huidtransplantaat
- Verdoven donorrat in een inductiekamer met behulp van een oplossing van 5% isoflurane in zuurstof op 0,8-1 L/min. Zodra de rat is verdoofd, verwijderen uit inductiekamer en plaats op een herademende neuskegel, het verlagen van de isoflurane tot 2-2,5% voor het behoud van anesthesie.
- Beheer een oplossing van 0,02-0,03 mL Carprofen (50 mg/mL) in 0,2 mL steriele zoutoplossing onderhuids tussen de schouderbladen voor analgesie.
- Breng kunstmatige tranen zalf aan beide ogen om hoornvlieszweren te voorkomen.
- Met behulp van tondeuse, scheer de gehele onderste achterpoot (s), enkel gebied, en zijden van de poot (s).
- Reinig gekozen achterpoot en plantaire oppervlak van poot met alcohol, gevolgd door iodopovidone oplossing, eindigend met een laatste reiniging met alcohol om resterende iodopovidone te verwijderen.
- Met behulp van een hand-held micro motor hoge snelheid boor met een verwijderbare ronde fijne grit polijsten steen (4000 rpm), bramen de plantaire oppervlak van de poot om de opperhuid te verwijderen. Tijdens het begraven, van toepassing druppels van zout om niet te verbranden van de huid. De onderliggende dermis zal een glanzend uiterlijk hebben met pinpoint bloeden.
- Breng een tourniquet aan op het onderste uiteinde om de bloedstroom te vertragen.
- Verwijder de plantaire huid scherp met een #15 scalpel en plaats in zoutbevochtigd gaas om uitdroging te voorkomen. Sommige tendineuze en bindweefsel zal inherent worden verwijderd met de huid in deze stap en zal later worden verwijderd.
- Breng gaaswrap aan op de bloedende voet om een langzame bloeding te vertragen. Herhaal stap 1.5-1.9 als u twee constructies maakt.
- Onder een microscoop (20x vergroting), verwijder het pezen en bindweefsel uit de diepe laag van de huidtransplantatie met behulp van micro-schaar. Zorg ervoor dat er geen gaten in het transplantaat worden. De verdunde huidtransplantatie moet licht ondoorzichtig zijn met alleen dermis, met een grootte van ongeveer 0,5 cm x 1,0 cm.
- Plaats in zoutbevochtigd gaas tot klaar voor C-RPNI construct fabricage. Grafts moeten worden gebruikt binnen 2 uur na de oogst.
2. Voorbereiding van de spiertransplantatie
- Maak een longitudinale incisie langs het voorste aspect van de onderste achterpoot van net boven de enkel tot net onder de knie met een #15 scalpel. Ontleed door onderhuids weefsel om het onderliggende spierstelsel bloot te leggen.
- Bij het distale aspect van de incisie, bloot de tendineuze invoegingen van de onderste ledematen spierstelsel. Tibialis anterior (TA) is meestal de grootste en meest voorste van de spieren, en net onder en achterste aan deze spier ligt de extensor digitorum longus (EDL). Isoleer de distale EDL-pees van de andere pezen in het gebied, waarbij ervoor wordt gezorgd dat de invoeging ervan op dit moment niet wordt ingesneden.
- Zorg voor isolatie van de juiste pees door beide tanden van een tang onder de pees in te brengen en opwaartse druk uit te oefenen door de tangen te openen om peesexcursie te veroorzaken. Manipulatie van deze pees moet ervoor zorgen dat alle tenen tegelijkertijd uit te breiden.
- Voer een distale tenotomy uit met een scherpe irisschaar en scheid de spier van de omliggende weefsels botweg met tenotomies (of andere bot-getipte schaar) die proximally werken om de tendineuze oorsprong te vinden.
- Zodra de proximale pees is gevisualiseerd, opnieuw uit te voeren een tenotomy gebruik te maken van scherpe iris schaar. Plaats de spiertransplantatie in een zoutbevochtigd gaas om uitdroging te voorkomen.
- Zodra alle gewenste grafts zijn verwijderd uit een donorrat, euthanaseren in de eerste plaats door intra-cardiale KCl injectie (1-2 mEq K +/kg), gevolgd door secundaire euthanasie met bilaterale punctie pneumothorax met een #15 mes.
3. Gemeenschappelijke peroneale zenuwisolatie en voorbereiding
- Verdoven en analgesie bieden aan de experimentele rat volgens protocol beschreven in de stappen 1.1-1.3.
- Scheer de gewenste dij en reinig met alcohol, betadine, eindigend met alcohol om sporen van betadine te verwijderen.
- Verplaats het dier van chirurgische prep tafel naar chirurgische microscoop tafel en plaats op verwarming pad met temperatuur sonde voor lichaamstemperatuur onderhoud. Handhaven isoflurane op 2-2,5% en zuurstof op 0,8-1 L/min.
- Markeer de incisie, die zich uitstrekt van alleen distale tot heupinkeping tot het inferieure gedeelte van de knie. Deze markering moet inferieur zijn aan, en schuin uit de buurt van, het dijbeen. Maak de incisie met een #15 mes ingesneden door de onderliggende biceps femoris fascia.
- Ontleden zorgvuldig door de biceps femoris spier met ofwel een hemostat of stomp-getipt micro-schaar aan de ruimte onderliggende biceps femoris.
OPMERKING: De heupzenuw reist ongeveer in dezelfde richting als de eerste incisie die werd gemaakt. Er zijn drie takken, meestal met suralzenuw achterste en gemeenschappelijke peroneale en tibiale zenuw reizen oppervlakkig en diep naar de knie, respectievelijk. - Na identificatie van de gemeenschappelijke peroneale (CP) zenuw, met behulp van een paar micro-, fijn getipttangen en micro-schaar, zorgvuldig isoleren van de CP zenuw van de andere heuptakken en verwijder eventuele aanhoudende bindweefsel distally.
- Op het punt waar de zenuw het oppervlak van de knie kruist, scherp transect de zenuw met een paar micro-schaar.
OPMERKING: Het gebruik van een scherpe schaar is uiterst belangrijk in deze stap als het veroorzaken van een aanzienlijk trauma aan de zenuw kan het risico van neuroma vorming te verhogen. - Maak het resterende bindweefsel voorzichtig vrij van de CP-zenuw en werk proximally om de zenuw vrij te maken tot een lengte van ongeveer 2 cm.
4. C-RPNI-constructie
- Verwijder de spiertransplantatie uit zoutbevochtigd gaas en verwijder alle centrale pezen weefsel evenals een klein centraal segment van epimysium. Laat de pezen eerige uiteinden intact.
- Met behulp van een 8-0 nylon hechting, zet het epineurium van het getransecteerde uiteinde van de CP-zenuw vast op het gebied van het spiertransplantat zonder epimysium met twee onderbroken steken aan weerszijden van de zenuw.
- Zet de spiertransplantatie vast aan het dijbeen periosteum met een enkele 6-0 nylon onderbroken steek zowel proximally als distally met de zenuw-spier verbinding naar buiten het dijbeen.
LET OP: Zet de spier zo vast dat deze op normale ontspannen lengte is. Probeer de spier niet aanzienlijk te rekken of laat te veel laksheid bij het beveiligen. - Plaats een 8-0 nylon steek op de inferieure, centrale marge van de spiertransplantatie epimysium, vast te stellen aan de CP zenuw epineurium op een manier om laksheid in de zenuw binnen de spiertransplantatie te creëren en te helpen om eventuele toekomstige spanning kan worden blootgesteld aan met latere ambulation te verlichten.
- Verwijder de huidtransplantatie uit het zoutbevochtigde gaas en schik het op de spiertransplantatie op een zodanige wijze om de zenuw en de meerderheid van de spier volledig te bedekken. Zorg ervoor dat de diepe marge van de dermis rust op de spier. Trim elke dermis die zich uitstrekt over de grens van de spier.
- Zet de huidtransplantatie schuin vast aan de spiertransplantatie met 8-0 nylon onderbroken hechtingen. Meestal worden 4-8 totale hechtingen gebruikt, afhankelijk van de grootte van de constructie.
- Sluit de biceps femoris fascia over de constructie op een lopende manier met 5-0 chromische hechting.
- Sluit de bovenliggende huid met 4-0 chromische hechting in loopwerk.
- Wattenstaafje van de chirurgische ruimte met een alcoholpad en breng antibiotica zalf.
- Stop met inademingsverdoving en laat de rat herstellen met voedsel en waterbronnen gescheiden van kooipartners.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Construct fabricage wordt beschouwd als niet succesvol als ratten ontwikkelen van een infectie of niet overleven chirurgische anesthesie. Uit eerder onderzoek is gebleken dat deze constructies ongeveer drie maanden nodig hebben om2,3,17,36te revasculariseren en te reinnervaten. Na de herstelperiode van drie maanden kunnen de constructietests worden voortgezet om de levensvatbaarheid te onderzoeken. Chirurgische blootstelling van de constructies na drie maanden zal onthullen revascularized spier en huid indien succesvol(figuur 3). Soms kunnen de vrije spier- en huidtransplantaties uitsluitend uit littekenweefsel bestaan en/of zal de zenuw niet aan de constructie worden bevestigd; deze bevindingen wijzen op een mislukte poging. Echter, indien succesvol, zachte knijpen van de gemeenschappelijke peroneale zenuw met tangen proximale aan de constructie zal resulteren in zichtbare spiercontractie(Video 1). Histologische analyse van constructies moet levensvatbare huid, zenuw en spieren aantonen(figuur 4). Immunostaining zal ook onthullen motorische en zintuiglijke zenuw reinnervation aan hun neuromusculaire knooppunten en sensorische eindorganen, respectievelijk (figuur 5). Als de gemeenschappelijke peroneale zenuw deze weefsels niet reinnervate, zal immunostaining geen individuele zenuwvezels binnen de constructie aantonen, met uitzondering van de geïmplanteerde zenuw zelf.
Elektrofysiologische tests kunnen worden uitgevoerd op deze constructies in vivo (figuur 6); eerder onderzoek is uitgevoerd op 3 en 9 maanden na C-RPNI fabricage36 (Tabel 1). Na maximale stimulatie met een haakelektrode bij de proximale gemeenschappelijke peroneale zenuw gewoon distaal aan de start van de heupzenuw, samengestelde spieractie potentials (CMAP's) kan worden gemeten bij de spiercomponent met zichtbare spiercontractie. Het type elektrode gebruikt bij de spier kan variëren afhankelijk van de voorkeur, maar epimysial patch, epimysial pad, en bipolaire sonde elektroden zijn met succes gebruikt in dit onderzoek. De gemiddelde CMAP amplitude geregistreerd bij de spier was 8,7 ± 1,6 mV op 3 maanden en 10,2 ± 2,1 mV op 9 maanden. De gemiddelde geleidingssnelheid was 10 ± 1,2 m/s bij 3 maanden en 9,5 ± 0,6 m/s bij 9 maanden. Ter vergelijking, CMAP's gegenereerd door fysiologische EDL spier variëren meestal van 10-18 mV37. Na stimulatie bij de huidcomponent van de C-RPNI werden samengestelde sensorische zenuwwerkingspotentialen (CNAPs) geproduceerd bij de proximale gemeenschappelijke peroneale zenuw, met een gemiddelde CSNAP-amplitude van 113,7 ± 35,1 μV bij 3 maanden en 142,9 ± 63,7 μV bij 9 maanden. Figuur 7 illustreert single en sommatie CMAP en CSNAP signalen verkregen tijdens elektrofysiologische testen in een grafisch formaat.
De C-RPNI dient om het inherente microvoltsignaal van een zenuw te versterken, en eerder onderzoek heeft voldoende versterking aangetoond van de microvolt tot millivoltniveau38. Daarom, als een constructie niet dat niveau van versterking biedt, wordt het niet als succesvol beschouwd. Als ofwel de huid, spier, of beide componenten van de C-RPNI mislukken, testen zou resulteren in opnames die het gebruikte stimulatiesignaal na te bootsen. Voor de spiercomponent specifiek, een suboptimaal resultaat (maar een die nog steeds wordt beschouwd als operationeel) zou er een zijn die CMAP amplitude en geleidingssnelheid in het bereik dat valt tussen de signaalstimulatie waarde en die van fysiologische EDL spier heeft. Bovendien kunnen deze signalen verzwakt raken en de karakteristieke CMAP-golfvorm(figuur 8A )missen. Suboptimale resultaten op het niveau van de huidcomponent kunnen optreden, maar zijn moeilijk te kwantificeren, aangezien ratten de kwaliteit van het gevoel dat ze ervaren niet kunnen uitdrukken. Deze suboptimale resultaten omvatten meestal het dempen van de golfvorm met significant achtergrondgeluid (figuur 8B). Echter, als er aanzienlijke littekens of eelt van de huid transplantatie, of minimale graft overleefd, geen CSP's zal worden gewaardeerd op de proximale gemeenschappelijke peroneale zenuw, ongeacht de stimulatie waarde.
Figuur 1: Illustratief schema van de C-RPNI constructie. De gemeenschappelijke peroneale zenuw kan worden gezien beveiligd tussen de bovenste huidlaag en onderste spierlaag. Deze constructie wordt bevestigd aan het dijbeen periosteum proximally en distally via de tendineuze knooppunten EDL's. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Een picturale weergave van de C-RPNI bij een patiënt met een transradiale amputatie. De gebruiker vormt een gewenste motorische intentie op het cerebrale niveau (bijvoorbeeld tanggreep), die via de geïmplanteerde perifere zenuw als een efferentmotorisch signaal naar de C-RPNI wordt overgebracht. Dit signaal genereert een samengestelde spieractie potentieel (CMAP) op de spiercomponent, die wordt geregistreerd door geïmplanteerde elektroden en herkend door het prothese apparaat, het genereren van de gewenste beweging. Sensoren op de vingertoppen van het apparaat herkennen de hoeveelheid gegenereerde druk en geven die informatie door aan een elektrode geïmplanteerd in de huidcomponent van de C-RPNI. Deze signalen activeren de overeenkomstige sensorische eindorganen, het genereren van een afferent samengestelde sensorische zenuw actie potentieel (CSNAP) overgedragen via de perifere zenuw naar de sensorische cortex. Een voorbeeldsignaal dat bij elk onderdeel wordt gegenereerd, wordt weergegeven in de blauwe vakken die naast elk onderdeel worden afgebeeld. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: C-RPNI in vivo. (A) Een C-RPNI onmiddellijk na de fabricage en op (B) 3 maanden na de bouw op het moment van elektrofysiologische testen. De spiercomponent is de diepe laag van de constructie en de huid, het oppervlakkige. Spierweefsel wordt gekenmerkt door (M), dermis (D), en gemeenschappelijke peroneale zenuw (N). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: C-RPNI histologie 6 maanden. C-RPNI H&E op 6 maanden in (A) dwarsdoorsnede en (B) longitudinale sectie. Spier genoteerd door (M), dermis (D), en zenuw (N). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: Immunostaining van de C-RPNI. (A) Representatief voorbeeld van een dwarsdoorsnede van spierweefsel, met rode pijlen die neuromusculaire verbindingen identificeren. Een hogere vergroting van de centrale neuro-gespierde kruising (NMJ) is afgebeeld rechtsonder. (B) Close-up van een neuromusculaire kruising die in het monster is vermeld. Voor (A) en (B), rode vlekken (alfa-bungarotoxine) geeft de aanwezigheid van cholinerge receptoren in spierweefsel; blauw (neurofilament 200) specificeert de aanwezigheid van neurofilamenten in neuronal weefsel; en groen (choline acetyltransferase) merkt specifiek motorneuron aanwezigheid. (C) Representatief voorbeeld van een iDISCO beeld gericht op de huid kruising, met rode pijlen markering sensorische neuronen (wit) het invoeren van de dermis. (D) On-lay uitzicht van iDISCO demonstreren meerdere sensorische neuronen (wit, neurofilament 200). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6: Elektrofysiologisch testschema. De bovenste afbeelding is een illustratie van de standaard elektrode opstelling voor het testen van de C-RPNI constructies. Er is een pleister en/of sondeelektrode geplaatst op zowel de spier- als dedermale componenten van de C-RPNI, met een dubbele haakelektrode geplaatst op de gemeenschappelijke peroneale zenuwproximally. De onderste afbeelding is een in vivo voorbeeld van de testopstelling over een rattenonderwerp. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 7: Typische C-RPNI elektrofysiologische signalering. (A) Een enkel CMAP-signaal dat bij de spiercomponent is opgenomen na een 5,00 mA-signaal dat op de CP-zenuw is aangebracht. (B) 24 CMAP's gegenereerd door 5,00 mA stimulatie aan de zenuw. (C) Een enkel CSNAP-signaal dat is opgenomen uit de proximale CP-zenuw na huidcomponentstimulatie bij 900 μA. (D) Een reeks CNAPs die zijn opgenomen uit de proximale CP-zenuw na toenemende stimulatie bij de huidcomponent van 500 μA tot 1000 μA. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 8: Abnormale C-RPNI signalering. (A) Een reeks CMAP's verkregen tijdens het opvoeren van CP zenuwstimulatie van 0,2 tot 4 mA. Golfvormen pieken op verschillende punten en keren niet terug naar de basislijn, wat mogelijk wijst op defecte elektroden of onvoldoende algehele constructiefunctie. (B) Sommatie van CNAP's verkregen terwijl het stimuleren van huidcomponenten, helling 0,1 tot 5 mA. Deze bevindingen kunnen optreden om een veelheid van redenen, met inbegrip van defecte elektrode (s), huidtransplantatie littekens, en / of zenuwschade. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Gegevens van 3 maanden | CMAP Data (Stimuleer CP zenuw en record van spiertransplantatie) | CSNAP Data (Stimuleer huidtransplantatie en record van CP zenuw) | |||||
| Rat ID-nummer | Bouwgewicht (g) | Stimulatie amplitude (mA) | Geleidingssnelheid (m/s) | V Peak-to-Peak (mV) | Stimulatie amplitude (mA) | Geleidingssnelheid (m/s) | V Peak-to-Peak (μV) |
| 4607 | 0.087 | 4.17 | 11.3 | 10.3 | 18 | 11.1 | 121 |
| 4608 | 0.15 | 1.65 | 11.1 | 17.1 | 7.7 | 6.5 | 136 |
| 4611 | 0.113 | 8.3 | 9.6 | 11.2 | 10 | 10 | 121 |
| 4613 | 0.116 | 3.18 | 10 | 9.6 | 1.44 | 8.3 | 134 |
| 4614 | 0.189 | 3 | 10.8 | 9.6 | 7.39 | 9 | 151 |
| 4616 | 0.122 | 5.2 | 9.4 | 14.9 | 1.8 | 9.1 | 100 |
| 4620 | 0.118 | 2.91 | 7.6 | 7.4 | 8.7 | 10 | 219 |
| Gegevens van 9 maanden | CMAP Data (Stimuleer CP zenuw en record van spiertransplantatie) | CSNAP Data (Stimuleer huidtransplantatie en record van CP zenuw) | |||||
| Rat ID-nummer | Bouwgewicht (g) | Stimulatie amplitude (mA) | Geleidingssnelheid (m/s) | V Peak-to-Peak (mV) | Stimulatie amplitude (mA) | Geleidingssnelheid (m/s) | V Peak-to-Peak (μV) |
| 4687 | 0.238 | 1.35 | 9.6 | 18.2 | 0.99 | 11 | 181 |
| 4688 | 0.131 | 1.08 | 10 | 8.8 | 1.11 | 8 | 132 |
| 4689 | 0.26 | 1.26 | 9.6 | 21.8 | 1.9 | 8.6 | 237 |
| 4690 | 0.192 | 4.2 | 8.3 | 12.8 | N/a | N/a | N/a |
| 4691 | 0.213 | 1.38 | 10 | 18.6 | 6.6 | 8 | 153 |
| 4693 | 0.178 | 1.11 | 9.6 | 15.1 | 8.7 | 8.3 | 306 |
Tabel 1: Elektrofysiologische testen van C-RPNO's bij 3- en 9 maanden na de bouw. Om CMAP's te verkrijgen, werd een opname-elektrode op de spier geplaatst met een stimulerende elektrode op de proximale gemeenschappelijke peroneale zenuw. Een reeks stimulaties die in amplitude toeneemt, werd op de zenuw toegepast totdat maximale CMAP-waarden werden verkregen en de resultaten werden geregistreerd. Een soortgelijke methode werd toegepast op de huidcomponent, maar met de opname-elektrode geplaatst op de zenuw en het stimuleren van elektrode op de dermis. Voor de sensorische evaluatie van rat 4690 op 9 maanden, de huidtransplantatie bleek te zijn getekend om te kunnen testen.
Video 1: Spiercontractie binnen een C-RPNI. Een paar tangen kan worden gezien aan de linkerkant van de video zachtjes knijpen de proximale gemeenschappelijke peroneale zenuw. Dit resulteert in samentrekking van de spiercomponent van een 3 maanden oude C-RPNI die zichtbaar is voor de kijker. Klik hier om deze video te bekijken (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De C-RPNI is een nieuwe constructie die gelijktijdige versterking van de motorische signalen van een doelzenuw biedt met afferente zintuiglijke feedback. In het bijzonder, de C-RPNI heeft een uniek nut voor degenen die leven met proximale amputaties als hun motor en zintuiglijke fascicles kan niet gemakkelijk mechanisch worden gescheiden tijdens de operatie. In plaats daarvan maakt de C-RPNI gebruik van de inherente preferentiële reinnervation eigenschappen van de zenuw zelf aan te moedigen zintuiglijke vezel reinnervation aan dermale zintuiglijke eindorganen en motorvezels neuromusculaire knooppunten.
Aangezien C-RPNI fabricage is gebaseerd op de reinnervation vaardigheden van de doelzenuw, zorgvuldige behandeling van de zenuw is van het grootste belang tijdens de procedure. Tijdens dissectie, vermijd directe manipulatie van, en trauma aan, de doelzenuw. Als de zenuw moet worden behandeld, wordt aanbevolen om in plaats daarvan epineurium of omringend bindweefsel te manipuleren. Hoewel ons laboratorium geen neuromavorming binnen deze constructie heeft ondervonden, kan een significant zenuwtrauma theoretisch het risico verhogen. Een extra belangrijke stap in het proces is het oogsten van de huidtransplantaties. Alle epidermale weefsel moet worden verwijderd uit de hindpaw graft als bewaard opperhuid kan het risico van infectie en opname cysten tijdens het genezingsproces te verhogen. Bovendien moet het huidtransplantaat voldoende worden uitgedund om imbibitie en revascularisatie gedurende het transplantaat te bevorderen en significante ischemie en necrose te voorkomen.
Hoewel de meerderheid van de studies uitgevoerd met de C-RPNI zijn uitgevoerd op de gemeenschappelijke peroneale zenuw, elke gemengde sensorimotorische zenuw kan worden vervangen. Een zuivere motor of zuivere sensorische zenuw kan worden gebruikt, maar de resultaten zijn moeilijk te voorspellen en zou waarschijnlijk resulteren in een grotendeels spier of dermale reinnervation, respectievelijk. Met betrekking tot de spiertransplantatie, zolang epimysium wordt verwijderd uit het gedeelte contact met de zenuw, elke spiertransplantatie vergelijkbaar in grootte kan worden gebruikt, zolang het bevatte tendineuze of fasciale weefsel aan beide uiteinden geschikt voor verankering aan het nabijgelegen periosteum. Voor de huidtransplantatie, glabrous weefsel wordt specifiek gebruikt als gevolg van het potentieel voor haargroei na het enten. Niet-glabre huid werd eerder geprobeerd, maar vanwege de moeilijkheid van het verwijderen van individuele haarzakjes, alle resulterende constructies hadden aanzienlijke haargroei, ontsteking, en littekens na de periode van drie maanden rijping. Bovendien kunnen andere rattensoorten worden gebruikt, maar Lewis en Fischer ratten worden aanbevolen voor dit experiment als veel andere rattensoorten zullen zelf verminken secundair aan zenuwtransectie39,40.
Gezien de vertraging tussen de procedure en de resultaten is het moeilijk om van tevoren te weten of de methode moet worden gewijzigd. Infectie is een theoretisch risico zelden ondervonden door ons laboratorium, maar als infectie optreedt, het is meestal responsief op antibiotica. Af en toe kauwen ratten op hun incisies die dehiscence veroorzaken, en dit kan worden behandeld met washout, debridement en re-closure. Als na drie maanden op het moment van blootstelling, de constructie niet-functioneel en/of getekend blijkt te zijn, zijn er verschillende mogelijke oorzaken. Soms, als de zenuw niet correct aan de constructie met minstens drie hechtingen wordt vastgemaakt, kan de zenuw met ambulation uit de constructie scheuren. Bovendien kunnen de spier- en/of huidtransplantaties necrose, waardoor falen. Typisch, Dit is een gevolg van een herhaalde infectie, de huidtransplantatie te dik, of de spier te beschadigd bij de oogst om goed te herstellen. Bovendien, als de spier niet is vastgezet aan periosteum bij rustlengte, kan contractie worden aangetast waardoor onvoldoende signalen tijdens het testen. Soms zal de constructie levensvatbaar lijken, maar niet voldoende CMAP's / CSP's produceren op het testen (5-10% van de constructies, gemiddeld). Dit kan secundair zijn aan falen in apparatuur, verhoogde elektrodeimpedantie, of significante huid oproep. Het bellen van de huid kan het transductie van signalen dempen en volledig blokkeren als de dermis niet goed wordt uitgedund tijdens de fabricage. Als een van de voorgaande beschreven gebeurtenissen tijdens het testproces vaak wordt gezien, moet men terugkeren naar het protocol en passende wijzigingen aanbrengen. In de ervaring van ons laboratorium met meer dan 90 succesvolle C-RPNI constructies, is ons faalpercentage <5% en meestal toegeschreven aan chirurgische fouten tijdens de fabricage.
Methoden die gewoonlijk worden gebruikt om zenuwsignalen te versterken of op te nemen, zijn onder andere flexibele zenuwplaten18, extraneurale manchetelektroden19,20,21,22,23, weefselpenetrerende elektroden24,25,31,32, en intrafasciculaire elektroden26,27,28, die allemaal zijn geassocieerd met weefselletsel, axonale degeneratie en/of littekenweefselvorming. Deze littekens wordt vaak toegeschreven aan chronische inwonende vreemde lichaam reactie29 en scheren stress veroorzaakt door verschillen in moduli Young's30. De C-RPNI, echter, is een biologische constructie en dus niet induceren vreemde lichaam reactie in zenuwweefsel. Bovendien zijn de mechanische eigenschappen verschillende factoren dichter bij zenuwweefsel dan elektroden. Histologische analyse van deze monsters heeft geen significante mate van littekenweefselvorming in de zenuw aangetoond bij chronisch gebruik, waardoor de C-RPNI gedurende langere perioden met de zenuw kan communiceren in vergelijking met de hierboven genoemde methoden. Hoewel deze methode zeer effectief is bij het verheerlijken van efferent motorsignalen, is het beperkt met betrekking tot sensorische afferent signaalproductie. We hebben gemeten en gekarakteriseerd signaal transductie geproduceerd met mechanische en elektrische stimulatie van de huidcomponent van de C-RPNI36; deze rattenonderwerpen kunnen echter niet in aanmerking komen voor het type of de mate van sensaties die worden opgewekt door stimulatie van deze constructie. Als zodanig is het op dit moment onmogelijk om te weten wat voor effect de C-RPNI produceert met betrekking tot sensatie. Toekomstige richtingen voor deze constructie omvatten karakterisering van signalen geproduceerd in de proximale zenuw na specifieke verstrekte stimuli (bijvoorbeeld warmte, pijn, druk, enz.) evenals correlatie met somatosensorische opgeroepen potentials gegenereerd in de sensorische cortex van de knaagdierhersenen. Het is het doel van ons laboratorium om een uitgebreide basis te leggen voor C-RPNO's die de weg vrijmaken voor klinische vertaling naar menselijke proefpersonen.
De voorganger van de C-RPNI, de RPNI (regeneratieve perifere zenuwinterface), bestaat uit een vrije spiertransplantatie aan een getransected zenuw, met motorvezels die eerder gedenredeerde neuromusculaire knooppunten reinnervating. De RPNI heeft aangetoond nut bij menselijke proefpersonen, met verschillende patiënten controle geavanceerde protheses van signalen versterkt door-en opgenomen uit-deze RPNIs34. Bovendien hebben deze RPNO's gunstige behandelingseffecten aangetoond buiten de prothetische controle, met verschillende voorlopige retrospectieve en prospectieve studies die verminderde neuromavorming, chronische pijn en fantoompijn in de ledematen aantonen bij patiënten met extremiteitamputaties. Ondanks deze successen, een gemeenschappelijke klacht voor degenen die gebruik maken van deze geavanceerde protheses, echter, is de noodzaak om de prothese te visualiseren tijdens het gebruik als deze protheses gebrek aan proprioceptie en bieden minimale zintuiglijke feedback. De C-RPNI zou een oplossing kunnen zijn voor deze gemeenschappelijke kritiek door een manier te bieden om zintuiglijke feedback te geven via de huidcomponent, wat leidt tot de realisatie van de felbegeerde, ideale prothese.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen onthullingen.
Acknowledgments
De auteurs willen Jana Moon bedanken voor deskundige technische bijstand. Studies gepresenteerd in deze paper werden gefinancierd door middel van een R21 (R21NS104584) subsidie aan SK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #15 Scalpel | Aspen Surgical, Inc | Ref 371115 | Rib-Back Carbon Steel Surgical Blades (#15) |
| 4-0 Chromic Suture | Ethicon | SKU# 1654G | P-3 Reverse Cutting Needle |
| 5-0 Chromic Suture | Ethicon | SKU# 687G | P-3 Reverse Cutting Needle |
| 6-0 Ethilon Suture | Ethicon | SKU# 697G | P-1 Reverse Cutting Needle (Nylon suture) |
| 8-0 Monofilament Suture | AROSurgical | T06A08N14-13 | Black polyamide monofilament suture on a threaded tapered needle |
| Experimental Rats | Envigo | F344-NH-sd | Rats are Fischer F344 Strain |
| Fluriso (Isofluorane) | VetOne | 13985-528-40 | Inhalational Anesthetic |
| Micro Motor High Speed Drill with Stone | Master Mechanic | Model 151369 | Handheld rotary tool; kit comes with multiple fine grit stones |
| Oxygen | Cryogenic Gases | UN1072 | Standard medical grade oxygen canisters |
| Potassium Chloride | APP Pharmaceuticals | 63323-965-20 | Injectable form, 2 mEq/mL |
| Povidone Iodine USP | MediChoice | 65517-0009-1 | 10% Topical Solution, can use one bottle for multiple surgical preps |
| Puralube Vet Opthalmic Ointment | Dechra | 17033-211-38 | Corneal protective ointment for use during procedure |
| Rimadyl (Caprofen) | Zoetis, Inc. | NADA# 141-199 | Injectable form, 50 mg/mL |
| Stereo Microscope | Leica | Model M60 | User can adjust magnification to their preference |
| Surgical Instruments | Fine Science Tools | Various | User can choose instruments according to personal preference or from what is currently available in their lab |
| Triple Antibiotic Ointment | MediChoice | 39892-0830-2 | Ointment comes in sterile, disposable packets |
| VaporStick 3 | Surgivet | V7015 | Anesthesia tower with space for isofluorane and oxygen canister |
| Webcol Alcohol Prep | Coviden | Ref 6818 | Alcohol prep wipes; use a new wipe for each prep |
References
- Biddiss, E. A., Chau, T. T. Upper limb prosthesis use and abandonment: A survey of the last 25 years. Prosthetics and Orthotics International. 31 (3), 236-257 (2007).
- Kung, T. A., et al. Regenerative peripheralnerve interface viability and signal transduction with an implanted electrode. Plastic and Reconstructive Surgery. 133 (6), 1380-1394 (2014).
- Larson, J. V., et al. Prototype Sensory Regenerative Peripheral Nerve Interface for Artificial Limb Somatosensory Feedback. Plastic and Reconstructive Surgery. 133 (3 Suppl), 26-27 (2014).
- Hijjawi, J. B., et al. Improved myoelectric prosthesis control accomplished using multiple nerve transfers. Plastic and Reconstructive Surgery. 118 (7), 1573-1578 (2006).
- Pylatiuk, C., Schulz, S., Döderlein, L. Results of an Internet survey of myoelectric prosthetic hand users. Prosthetics and Orthotics International. 31 (4), 362-370 (2007).
- Baghmanli, Z., et al. Biological and electrophysiologic effects of poly(3,4-ethylenedioxythiophene) on regenerating peripheral nerve fibers. Plastic and Reconstructive Surgery. 132 (2), 374-385 (2013).
- Dhillon, G. S., Horch, K. W. Direct neural sensory feedback and control of a prosthetic arm. IEEE Transactions on Neural Systems and Rehabilitation Engineering. 13 (4), 468-472 (2005).
- Romo, R., Hernández, A., Zainos, A., Salinos, E. Somatosensory discrimination based on cortical microstimulation. Nature. 392, 387-390 (1998).
- O'Doherty, J., et al. Active tactile exploration using a brain-machine-brain interface. Nature. 479, 228-231 (2011).
- Stein, R. B., Walley, M. Functional comparison of upper extremity amputees using myoelectric and conventional prostheses. Archives of Physical Medicine and Rehabilitation. 64 (6), 243-248 (1983).
- Millstein, S. G., Heger, H., Hunter, G. A. Prosthetic Use in Adult Upper Limb Amputees: A Comparison of the Body Powered and Electrically Powered Prostheses. Prosthetics and Orthotics International. 10 (1), 27-34 (1986).
- Zollo, L., et al. Restoring tactile sensations via neural interfaces for real-time force-and-slippage closed-loop control of bionic hands. Science Robotics. 4 (27), eaau9924 (2019).
- Tan, D. W., et al. A neural interface provides long-term stable natural touch perception. Science Translational Medicine. 6 (257), 257ra138 (2014).
- Stieglitz, T., et al. On Biocompatibility and Stability of Transversal Intrafascicular Multichannel Electrodes-TIME. Converging Clinical and Engineering Research on Neurorehabilitation II. 15, 731-735 (2017).
- Petrini, F. M., et al. Six-months assessment of a hand prosthesis with intraneural tactile feedback. Annals of Neurology. 85 (1), 137-154 (2019).
- Jung, R., Abbas, J., Kuntaegowdanahalli, S., Thota, A. Bionic intrafascicular interfaces for recording and stimulating peripheral nerve fibers. Bioelectronics in Medicine. 1 (1), 55-69 (2018).
- Micera, S., Navarro, X., Yoshida, K. Interfacing With the Peripheral Nervous System to Develop Innovative Neuroprostheses. IEEE Transactions on Neural Systems and Rehabilitation Engineering. 17 (5), 417-419 (2009).
- Stieglitz, T., Schuettler, M., Schneider, A., Valderrama, E., Navarro, X. Noninvasive measurement of torque development in the rat foot: measurement setup and results from stimulation of the sciatic nerve with polyimide-based cuff electrodes. IEEE Transactions on Neural Systems and Rehabilitation Engineering. 11 (4), 427-437 (2003).
- Polasek, K. H., Hoyen, H. A., Keith, M. W., Tyler, D. J. Human nerve stimulation thresholds and selectivity using a multi-contact nerve cuff electrode. IEEE Transactions on Neural Systems and Rehabilitation Engineering. 15 (1), 76-82 (2007).
- Nielson, K. D., Watts, C., Clark, W. K. Peripheral nerve injury from implantation of chronic stimulating electrodes for pain control. Surgical Neurology. 5 (1), 51-53 (1976).
- Waters, R. L., McNeal, D. R., Faloon, W., Clifford, B. Functional electrical stimulation of the peroneal nerve for hemiplegia. Long-term clinical follow-up. Journal of Bone and Joint Surgery. 67 (5), 792-793 (1985).
- Larsen, J. O., Thomsen, M., Haugland, M., Sinkjaer, T. Degeneration and regeneration in rabbit peripheral nerve with long-term nerve cuff electrode implant: a stereological study of myelinated and unmyelinated axons. Acta Neuropathologica. 96 (4), 365-378 (1998).
- Krarup, C., Loeb, G. E., Pezeshkpour, G. H. Conduction studies in peripheral cat nerve using implanted electrodes: III. The effects of prolonged constriction on the distal nerve segment. Muscle Nerve. 12 (11), 915-928 (1989).
- Micera, S., Navarro, X. Bidirectional interfaces with the peripheral nervous system. International Review of Neurobiology. 86, 23-38 (2009).
- Urbanchek, M. G., et al. Microscale Electrode Implantation during Nerve Repair: Effects on Nerve Morphology, Electromyography, and Recovery of Muscle Contractile Function. Plastic and Reconstructive Surgery. 128 (4), 270e-278e (2011).
- Yoshida, K., Horch, K. Selective stimulation of peripheral nerve fibers using dual intrafascicular electrodes. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 40 (5), 492-494 (1993).
- Branner, A., Stein, R. B., Normann, R. A. Selective stimulation of cat sciatic nerve using an array of varying length microelectrodes. Journal of Neurophysiology. 85 (4), 1585-1594 (2001).
- Zheng, X. J., Zhang, J., Chen, T., Chen, Z. Longitudinally implanted intrascicular electrodes for stimulating and recording fascicular physioelectrical signals in the sciatic nerve of rabbits. Microsurgery. 23, 268-273 (2003).
- del Valle, J., Navarro, X. Interfaces with the peripheral nerve for the control of neuroprostheses. International Review of Neurobiology. 109, 63-83 (2013).
- Stiller, A. M., et al. A Meta-Analysis of Intracortical Device Stiffness and Its Correlation with Histological Outcomes. Micromachines. 9 (9), 443 (2018).
- Hanson, T., Diaz-Botia, C., Kharazia, V., Maharbiz, M., Sabes, P. The "sewing machine" for minimally invasive neural recording. bioRxiv. , Published online (2019).
- Yang, X., et al.
- Irwin, Z. T., et al. Chronic recording of hand prosthesis control signals via a regenerative peripheral nerve interface in a rhesus macaque. Journal of Neural Engineering. 13 (4), 046007 (2016).
- Kubiak, C. A., et al. Abstract 24: Successful Control of Virtual and Robotic Hands using Neuroprosthetic Signals from Regenerative Peripheral Nerve Interfaces in a Human Subject. Plastic and Reconstructive Surgery Global Open. 6 (4), 19-20 (2018).
- Sando, I. C., et al. Dermal-Based Peripheral Nerve Interface for Transduction of Sensory Feedback. Plastic and Reconstructive Surgery. 136 (4 Suppl), 19-20 (2015).
- Kubiak, C. A., et al. Abstract 36: Viability and Signal Transduction with the Composite Regenerative Peripheral Nerve Interface (C-RPNI). Plastic and Reconstructive Surgery Global Open. 7 (4), 26-27 (2019).
- Kubiak, C. A., et al. Abstract QS18: Neural Signal Transduction with the Muscle Cuff Regenerative Peripheral Nerve Interface. Plastic and Reconstructive Surgery Global Open. 7 (4 Suppl), 114 (2019).
- Woo, S. L., et al. Utilizing nonvascularized partial skeletal muscle grafts in peripheral nerve interfaces for prosthetic control. Journal of the American College of Surgeons. 219 (4), e136-e137 (2014).
- Sporel-Özakat, R. E., Edwards, P. M., Hepgul, K. T., Savas, A., Gispen, W. H. A simple method for reducing autotomy in rats after peripheral nerve lesions. Journal of Neuroscience Methods. 36 (2-3), 263-265 (1991).
- Carr, M. M., Best, T. J., Mackinnon, S. E., Evans, P. J. Strain differences in autotomy in rats undergoing sciatic nerve transection or repair. Annals of Plastic Surgery. 28 (6), 538-544 (1992).
