Dette arbejde beskriver protokoller for fremstilling af magnetiske nanopartikler, dens belægning med SiO2, efterfulgt af dens amine funktionalisering med (3-aminopropyl)triethoxysilane (APTES) og dens bøjning med deferoxamin ved hjælp af en succinyl moiety som linker. En dyb strukturel karakterisering beskrivelse og en fange bakterier assay ved hjælp af Y. enterocolitica for alle de mellemliggende nanopartikler og den endelige konjugat er også beskrevet i detaljer.
I dette arbejde, syntesen af magnetiske nanopartikler, dens belægning med SiO2, efterfulgt af dens amine funktionalisering med (3-aminopropyl)triethoxysilane (APTES) og dens konjugation med deferoxamin, en siderophore anerkendt af Yersinia enterocolitica, ved hjælp af en succinyl moiety som en linker er beskrevet.
Magnetitens magnetiske nanopartikler (MNP) (Fe3O4) blev fremstillet ved solvotermisk metode og belagt med SiO2 (MNP@SiO2) ved hjælp af Stöber-processen efterfulgt af funktionalisering med APTES (MNP@SiO2@NH2). Derefter blev feroxamin konjugeret med MNP@SiO2@NH2 ved carbodiimidekobling for at give MNP@SiO2@NH2@Fa. Konjugattens og mellemprodukternes morfologi og egenskaber blev undersøgt ved hjælp af otte forskellige metoder, herunder pulver røntgendiffraktion (XRD), Fourier transform infrarød spektroskopi (FT-IR), Raman-spektroskopi, røntgenfotoelektroskopi (XPS), transmissionseleklektronmikroskopi (TEM) og kortlægning af energispredning X-Ray (EDX). Denne udtømmende karakteristik bekræftede dannelsen af konjugatet. Endelig, for at vurdere kapaciteten og specificiteten af nanopartikler, de blev testet i en fange bakterier assay ved hjælp af Yersinia enterocolitica.
De bakteriedetektionsmetoder, der anvender MNP, er baseret på molekylær genkendelse af antistoffer, aptamere, bioprotein, kulhydrater, der er konjugeret til MNP af de patogene bakterier1. I betragtning af at siderophores er anerkendt af specifikke receptorer på den ydre membran af bakterier, de kunne også knyttet til MNP at øge deres specificitet2. Siderophores er små organiske molekyler involveret i Fe3 + optagelse af bakterier3,4. Udarbejdelsen af konjugater mellem siderophores og MNP sammen med deres vurdering for opsamling og isolering af bakterier er endnu ikke blevet rapporteret.
Et af de afgørende trin i syntesen af konjugater af magnetiske nanopartikler med små molekyler er valget af typen af binding eller interaktion mellem dem for at sikre, at det lille molekyle er fastgjort til overfladen af MNP. Af denne grund, proceduren for at forberede konjugat mellem magnetiske nanopartikler og feroxamin-den siderophore anerkendt af Yersinia enterocolitica-var fokuseret på generering af en modificerbar overflade af MNP at tillade forbinder det kovalent til siderophore af carbodiimide kemi. For at få en ensartet magnetit nanopartikler (MNP) og for at forbedre nukleation og størrelse kontrol, en solvolyse reaktion med benzylalkohol blev gennemført i en termisk blok uden at ryste5. Derefter blev en silica belægning genereret af Stöber metode til at give beskyttelse og forbedre stabiliteten af nanopartikler suspension i vandige medier6. Under hensyntagen til feroxaminens struktur er det nødvendigt at indføre amingrupper for at producere egnede nanopartikler (MNP@SiO2@NH2), der skal konjugeres med den siderophore. Dette blev opnået ved kondensation af (3-aminopropyl)triethoxysilane (APTES) med de alkoholgrupper, der var til stede på overfladen af de silica modificerede nanopartikler (MNP@SiO2) ved hjælp af en sol-gel metode7.
Parallelt hermed blev feroxaminjern(III)-komplekset fremstillet ved kompleksdannelse af det kommercielt tilgængelige deferoxamin med jernacetylacetont i vandig opløsning. N-succinylferoxamin, der bærer succinyl grupper, der vil fungere som linkere, blev opnået ved reaktionen af feroxamin med kortfattet anhydrid.
Konjugationen mellem MNP@SiO2@NH2 og N-succinylferoxamin for at give MNP@SiO2@NH@Fa blev udført gennem carbodiimidekemi ved hjælp af som koblingsreagenser benzotriazol-1-yl-yloxy-tris-(dimethylamino)-phosphonium hexafluorophosphat (BOP) og 1-hydroxybenzotriazole (HOBt) i et blødt grundlæggende medie til aktivering af terminalsyregruppen i N-succinylferoxamin8.
Når parlamentarikere blev karakteriseret, vi evalueret mulighederne i nøgne og funktionaliserede magnetiske nanopartikler til at fange vilde type (WC-A) og en mutant af Y. enterocolitica mangler feroxamin receptor FoxA (FoxA WC-A 12-8). Plain parlamentsmedlemmer, funktionaliserede parlamentsmedlemmer og konjugat MNP@SiO2@NH@Fa fik lov til at interagere med hver Y. enterocolitica stamme. De bakteriekonjugataggregater blev adskilt fra bakteriesuspensionen ved anvendelse af et magnetfelt. De separerede aggregater blev skyllet to gange med fosfatbufferet saltvand (PBS), re-suspenderet i PBS for at forberede serielle fortyndinger og derefter, de blev belagt til koloni tælling. Denne protokol viser hvert trin i syntesen af MNP@SiO2@NH@Fa, den strukturelle karakterisering af alle mellemprodukter og konjugat, og en bakterie fange assay som en nem måde at vurdere specificiteten af konjugat i forhold til mellemprodukter. kr.
Denne protokol beskriver syntesen af en konjugat mellem magnetiske nanopartikler og siderophore feroxamin ved kovalent binding. Syntesen af magnetit blev udført ved hjælp af den protokol, der er rapporteret af Pinna et al.5 efterfulgt af silicabelægning for at beskytte den magnetiske kerne af korrosion i vandige systemer, for at minimere aggregering og for at give en passende overflade til funktionalisering6. Silicabelægningsprocessen blev ændret. I stedet for at udfø…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne anerkender taknemmeligt professor Klaus Hantke (Universitetet i Tübingen, Tyskland) for venligt at levere Yersinia enterocolitica stammer, der anvendes i dette arbejde. Dette arbejde blev støttet af tilskud AGL2015-63740-C2-1/2-R og RTI2018-093634-B-C21/C22 (AEI/FEDER, EU) fra det statslige agentur for forskning (AEI) i Spanien, der er medfinansieret af FEDER-programmet fra Den Europæiske Union. Arbejdet på Universitetet i Santiago de Compostela og University of A Coruña blev også støttet af tilskud GRC2018/018, GRC2018/039 og ED431E 2018/03 (CICA-INIBIC strategisk gruppe) fra Xunta de Galicien. Endelig vil vi gerne takke Nuria Calvo for hendes store samarbejde gør voice-off denne video protokol.
1-Hydroxybenzotriazole hydrate HOBT |
Acros | 300561000 | |
2,2′-Bipyridyl | Sigma Aldrich | D216305 | |
3-Aminopropyltriethoxysilane 99% | Acros | 151081000 | |
Ammonium hydroxide solution 28% NH3 | Sigma Aldrich | 338818 | |
Benzotriazol-1-yloxytris(dimethylamino)-phosphonium hexafluorophosphate BOP Reagent | Acros | 209800050 | |
Benzyl alcohol | Sigma Aldrich | 822259 | |
Deferoxamine mesylate salt >92,5% (TLC) | Sigma Aldrich | D9533 | |
Ethanol, anhydrous, 96% | Panreac | 131085 | |
Ethyl Acetate, Extra Pure, SLR, Fisher Chemical | |||
Iron(III) acetylacetonate 97% | Sigma Aldrich | F300 | |
LB Broth (Lennox) | Sigma Aldrich | L3022 | |
N,N-Diisopropylethylamine, 99.5+%, AcroSeal | Acros | 459591000 | |
N,N-Dimethylformamide, 99.8%, Extra Dry, AcroSeal | Acros | 326871000 | |
Pyridine, 99.5%, Extra Dry, AcroSeal | Acros | 339421000 | |
Sephadex LH-20 | Sigma Aldrich | LH20100 | |
Succinic anhydride >99% | Sigma Aldrich | 239690 | |
Tetraethyl orthosolicate >99,0% | Sigma Aldrich | 86578 |