Summary
この研究は、磁気ナノ粒子の調製のためのプロトコル、SiO2でのコーティング、続いて(3-アミノプロピル)トリエトキシシラン(APTES)とのアミン官能化と、コクニル部分をリンカーとして使用したデフェキサミンとの結合を説明する。すべての中間ナノ粒子と最終コンジュゲートに対してY.エンゴコリティカを用いた深い構造特性評価の説明および捕獲細菌アッセイも詳細に説明する。
Abstract
本研究では、磁気ナノ粒子の合成、SiO2によるそのコーティング、2続いて(3-アミノプロピル)トリエトキシシラン(APTES)とのアミン官能化と、エルシニアエンゴコリチカによって認識される副腎泳動であるデフェオキシアミンとの共役が、コルチニル部分をリンカーとして用いた。
マグネタイト(Fe3O4)の磁性ナノ3粒子(MNP)をソルボ熱法で調製し、ステーバー法を用いてSiO2(MNP@SiO2)で被覆し、続いてAPTESとの官能化を行い、その後にAPTES(MNP@SiO2@NH2)を用いた。2 222次いで、フェロキサミンをカルボジイミドカップリングによりMNP@SiO2@NH2と共役し、MNP@SiO2@NH2@Faを与えた。222コンジュゲートおよび中間体の形態と特性は、粉末X線回折(XRD)、フーリエ変換赤外分光法(FT-IR)、ラマン分光法、X線光電子分光(XPS)、透過電子顕微鏡(TEM)、エネルギー分散X線(EDX)マッピングを含む8つの異なる方法で調べた。この徹底的な特徴付けにより、コンジュゲートの形成が確認された。最後に、ナノ粒子の容量と特異性を評価するために、それらは、エルシニアエンテオコリチカを用いた捕獲細菌アッセイで試験した。
Introduction
MNPを用いた細菌検出方法は、抗体の分子認識に基づく、アプタマー、バイオプロテイン、病原性細菌1によってMNPに結合した炭水化物。シレブロフォアは細菌の外膜上の特定の受容体によって認識されることを考慮に入れて、彼らはまた、それらの特異性を増加させるためにMNPにリンクすることができます2.シドロフォアは、細菌3、44によるFe3+取り込み3に関与する小さな有機分子である。サイドロフォアとMNPの間のコンジュゲートの調製と、細菌の捕獲および単離に対する評価はまだ報告されていない。
小分子を用いた磁性ナノ粒子のコンジュゲート合成における重要なステップの1つは、MNPの表面に小分子が結合していることを確認するために結合の種類または相互作用の選択である。このため、磁気ナノ粒子とフェロキサミン(エルシニア・エンゴコリチカが認識するシドロフォア)とのコンジュゲートを調製する手順は、MNPの変更可能な表面の生成に焦点を当て、カルボジイミド化学によってシデロフォアに共有結合することを可能にした。均一なマグネタイトナノ粒子(MNP)を得るために、核形成及びサイズ制御を改善するために、ベンジルアルコールとのソルボ分解反応を、振盪せずに熱ブロック中に運んだ。次いで、水性媒体6におけるナノ粒子懸濁液の保護と安定性を向上させるステーバー法によりシリカコーティングを生成した。フェロキサミンの構造を考慮して、シデロフォアと共役する適切なナノ粒子(MNP@SiO2@NH2)2を生成するためにアミン基の導入が必要である。2これは、ソルゲル法7を用いてシリカ改変ナノ粒子(MNP@SiO2)の表面に存在するアルコール基を用いて(3-アミノプロピル)トリエトキシシラン(apTES)の凝縮によって達成された。
並行して、フェロキサミン鉄(III)錯体は、水溶液中のアセチルアセトネートの鉄と市販のデフェオキサミンを複合化することによって調製した。N-スクシニルフェロキサミンは、リンカーとして作用するスクシニル基を持ち、コハク酸無水とフェロキサミンの反応により得られた。
MNP@SiO2@NH22とN-succinylferoxamineの間の結合は、MNP@SiO2@NH@Fa@を与えるために、カップリング試薬ベンゾトリアゾール-1-イルオキシトリス-()を使用してカルボジイミド化学を介して行った( ジメチルアミノ)-ホスホニウムヘキサフルオロリン酸(BOP)及び1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)を軟質塩基性培地中でN-スクシニルフェロキサミン8中の末端酸基を活性化する。 N2
MPが特徴付けられると、野生型(WC-A)およびフェロキサミン受容体FoxAを欠くY.エンテオコリチカ(FoxA WC-A 12-8)の変異体を捕捉する、裸で機能的な磁気ナノ粒子の能力を評価した。プレーンMP、機能化されたMPおよび共役MNP@SiO2@NH@Faは、各@Y.エンゴコリチカ株と相互作用することを許可した。バクテリア共役凝集体を、磁場の印加により細菌懸濁液から分離した。分離した凝集体をリン酸緩衝生理食塩液(PBS)で2回リンスし、PBSで再懸濁して連続希釈を調製し、次いでコロニー計数用にメッキした。このプロトコルは、MNP@SiO2@NH@Faの合成の各ステップ、全ての中間体および共役体の構造的特徴付け、および中間体に関するコンジュゲートの特異性を評価する容易な方法として細菌捕獲アッセイを示す。9
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
注:不活性雰囲気条件下で行われた反応については、すべてのガラス製品は、以前に65°Cでオーブンで乾燥し、ゴム中隔で密封し、アルゴンで3回パージしました。
1. フェロキサミンと共役した磁性ナノ粒子の合成
- Fe3O4磁性ナノ粒子(MP)の合成
- 20 mLガラスバイアルに0.5gのFe(acac)3を加え、10mLのベンジルアルコールと混ぜます。3
- この混合物を2分間超音波処理し、加熱ブロックに移し、180°Cで72時間加熱します。
- 反応が完了したら、バイアルを冷却し、ナノ粒子を4000 x gで4000 x gで30分間リンスし、遠心分離を少なくとも2回繰り返します。
- ネオジム(NdFeB)磁石を用いて磁力引力により上清からナノ粒子を分離し、残留溶媒を廃棄する。
- 96%エタノール繰り返し工程1.1.4でリンスする。そして溶媒が透明に見えるまで40 kHzで1分間の浴中で超音波処理と交互に上清を捨てます。
- 磁気ナノ粒子 SiO2コーティング(MNP@SiO2)
- 80 mLのイソプロパノールでMNPの2gの懸濁液を調製し、4 mLの21%アンモニア、7.5mLの蒸留水、0.56 mLのテトラエチルオルソケイ酸(TEOS)を磁気攪拌棒で丸底フラスコに加えます。
- 連続撹拌で40°Cで2時間加熱し、1時間超音波処理します。
- MNPを磁石で分離し、上清を捨て、イソプロパノールの30mLに分散させる。
- 手順 1.2.1 を繰り返します。および 1.2.2.
- 96%エタノールで磁気攪拌棒を取り出して洗浄し、すべての材料を回収します。
- 磁石を用いて磁力で上清からナノ粒子を分離する。
- 上清を捨て、超音波処理と交互に96%エタノールでナノ粒子をすすいだ。
- 室温でナノ粒子を真空下で12時間乾燥させます。
- トリエトキシシラン(3-アミノプロピル)を用いたMNP@SiO2の機能化
- 前工程から得られたMNP@SiO2の500mgを不活性雰囲気下でN,N-ジメチルホルムアミド(DMF)でリンスし、40kHzで1分間超音波処理する。その後、上清を捨てて、この処理を3回繰り返します。
- 丸い底フラスコで粒子を再懸濁し、磁気攪拌棒で攪拌し、9 mLのAPTESを加えます。
- 混合物を60°Cで12時間かき混ぜます。
- 上清を捨て、超音波処理と交互に96%エタノールでナノ粒子をすすいだ。
- フェロキサミンの合成
- 100mg(0.15ミリモル)のデフェキサミンメシル酸塩と53.0mg(0.15 mmol)のFe(acac)33を蒸留水5mLに5mLで溶解し、室温で一晩攪拌します。
- 得られた生成物を分離漏斗で20mLのEtOAcで3回洗浄し、次いで、回転エバポレーターを使用して真空下で有機溶媒を除去する。
- 水相を凍結乾燥させて、フェロキサミンを赤い固体として手に入れる。
- N-スクシニルフェロキサミンの合成
- 350mg(3.50 mmol)のコハク酸無水物を、不活性雰囲気下の50mLの丸底フラスコで5mLのピリジン中のフェロキサミン100mg(0.17ミリモル)の溶液に加えます。
- 得られた混合物を室温で16時間かき混ぜます。その後、回転エバポレーターで減圧下でピリジンの過剰を除去し、濃い赤色の固形物を得た。
- 反応粗物を3mLのメタノールに溶解する。
- メタノール溶液をセファデックスカラム(直径20mmの列に20cmのセファデックス)に移し、0.5 mL/minで溶出します。
- 赤い分画を収集し、回転エバポレーターを使用して真空下でメタノールを除去します。
- コンジュゲートMNP@SiO2@NH@Faの合成
- 乾燥MNP@SiO2の30mgをDMFで2回@NHし、ナノ粒子を100 mLのエルレンマイヤーフラスコで30分間不活性雰囲気下で30分間超音波処理します。
- N-スクシニルフェロキサミン(200mg、0.30ミリモル)、ベンゾトリアゾール-1-イルオキシトリス-(ジメチルアミノ)-六フッ化ホスホウ酸ホスホニウム(BOP、 173 mg, 0.45 mmol), 1-ヒドロキシベンゾトリアゾール (HOBt, 46 mg, 0.39 mmol) およびN,N-ジイソプロピレチルアミン (DIPEA, 128.8 mg, 1.21 mmol) DMF (混合 A) の 10 mL で DMF (混合 A) 下で 50 mL のラウンド底フラスコス.
- アルゴンガス雰囲気(Mix B)を2使用して、乾燥した無酸素条件下での超音波処理の下でDMFの3mLで2@NH2をすすったMNP@SiOを中断します。
- ミックスAを加える B ドロップワイズをミックスします。
- 室温でオービタルシェーカーを使用して最終混合物を一晩振ります。
- 得られたコンジュゲート(MNP@SiO2@NH@Fa)を磁石を用いて懸濁液から分離する。
- 得られた固体をリンスし、エタノールの10 mLでそれを5回超音波処理します。
- 真空下で固体を24時間乾燥させます。
2. ナノ粒子を用いた病原性細菌の捕獲を定量化するY.エンテゴコリチ株による細菌アッセイ
- 滅菌2 mLチューブで1mg/mLでPBS内のすべての中間ナノ粒子と最終コンジュゲートの懸濁液を調製します。
- ルリア・ベルタニ(LB)の5mLでY.エンゴコリティカの培養を37°Cで一晩インキュベートして準備します。
- 鉄欠損トリプティック大豆ブロス(TSB)の50 μLを10 mM 2,2′ビピリジルを加えて調製します。
- 5 mLの鉄欠乏性TSBをY.エンゴコリチの一晩培養物の50 μLで接種し、OD600 = 0.5\u20120.8に達するまで撹拌して37°Cでインキュベートする。
- ステップ2.4で得られた培養液の100μLを取り、900μLのPBSを含む2.0 mLチューブで希釈し、最初の1/10希釈を得た。次に、同じ手順を使用して最初の希釈から1/100希釈液を調製し、1 x 106コロニー形成ユニット(CFU)/mLで細菌細胞の濃度をほぼ得る。
- 2.0 mLチューブの細菌懸濁液1/100希釈液の1mg/mLで1mg/mLのナノ粒子懸濁液を100μL加え、渦で均質化します。
- 培養液を20°Cで1時間培養する。
- 磁石を用いてMNP/バクテリアの凝集体を分離し、上清を慎重に捨てます。
- ボルテックスを使用して1 mL PBSで分離したナノ粒子を2回リンスする。
- ナノ粒子をPBSの1 mLで懸濁し、CFU/mLでの細菌捕獲量をカウントします。
- 前の懸濁液から1 x10-4希釈に達するまで4回連続して1/10希釈液を調製する。
- 各希釈液を10μLずつTS寒天プレートにプレートし、一晩で37°Cでインキュベートします。
- エピホワイトモードでゲルデジタイザーでプレートを撮影します。個々のコロニーの数を数えるためにスポットを増幅するために適切なソフトウェアで画像を処理します。
注:各MNP中間体は、合成の進捗状況をフォローアップすることを特徴としました。まず、結晶構造を確認するためにXRDによって裸のMPを研究した。次いで、各中間体のFT-IRスペクトルを実行し、対応する反応で生じた変化をチェックした。また、各中間体のラマン分光分析もFT-IRスペクトルから推測された結論を確認するために行った。TGA分析により、有機材料を持つ中間体の重量の損失を推定することができました。各中間体の形態および大きさをTEMによって研究した。最後に、XPS分析は、各MNP中間表面における原子酸化状態を決定し、コンジュゲートMNP@SiO2@NH@Faにおける共有結合形成を確認するために重要であった。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
各中間体と最終コンジュゲートの形態と特性を決定するために、徹底的な構造特性化が行われます。この目的のために、技術XRD、FT-IR、ラマン分光法、TGA、TEM、EDXマッピングおよびXPSは、共役体の形成を実証するために使用される。X線光電子分光法(XPS)によって獲得されたナノ粒子の表面における原子の酸化状態は、ナノ粒子とシドロフォアとの間の共有結合の形成を確認するための最も関連するデータである。これらの結果に同意して、このプロトコルは再現可能です。
裸MNP、機能化されたMPおよび共役体は、PBS溶液中の各Y.エンゴコリチカ株と混合される。バクテリア-Mpの凝集体は磁石を使用して懸濁液から分離される。凝集体をPBSで2回リンスした後、PBSで再懸濁してコロニーカウント用にメッキされる連続希釈液を調製する。
このプロトコルを用いて調製した中間体および最終的な共役は、合成の各ステップで起こる変化を表示するためにいくつかの技術に提出された。赤外線およびラマン分光法は、合成の各ステップを監視するための簡単かつ迅速な方法を構成します。Si-O、C-Si-C、Fe-O、O=Cアミド振動、FT-IRおよびラマン(下記参照)スペクトルにおけるO=C-Nヒドロキサン酸振動(下記参照)スペクトルに対応する特徴的なバンドの存在は、合成の各ステップで磁気ナノ粒子の表面に起こっていた化学変化の最初の指標であった。
XRDディフラクトグラム
図1は、JCPDSファイル00-003-0863と比較してマグネタイトの合成磁性ナノ粒子(MNP)の組成および結晶構造を確認するために用いたXRD分析を示す。
TEM分析
図2Cは、(111)、(220)、(311)、(420)、(422)、(511)および(440)4.9、2.9、2.4、2.0、1.7、1.6、1.6と一致する電子回折パターンの明るいスポットを示す。一方、図2Dおよび図4Eは、非晶質無機有機材料に埋め込まれた分散MNP粒子(〜10nm)に対応するMNP@SiO2@NH2@FaのTEM画像を示す。2コーティングの厚さは、〜10nm以上です。
EDX分析
EDX マップは、表面上の要素 Fe、O、Si、および C の分布を表示します。図3Aは、MNP@SiO2の表面にSiが存在する様子を明確に示す。フェロキサミンによるアミンの機能化と共役の後、MNP@SiO2@NH@Faのナノ粒子表面上のCの増分が、正常な結合の証拠として図3Bに示されている。
IR分析
裸のMNP、MNP@SiO2、MNP@SiO2@NH2および2MNP@SiO2@NH@FaのFTIRスペクトルを2,図4に示す。2すべてのFTIRスペクトルは、Fe-O振動に関連した600 cm-1で分析のスペクトル範囲内のバンドの始まりを表示します。si-O-Si伸張振動に起因する1050 cm-1の広帯域の存在は、MNP@SiO2、MNP@SiO2@NH2、MNP@SiO2のFTIRスペクトル2に、シ2リカコーティングを確認@NH@Fa。22
MNP@SiO2の FTIR スペクトル (図 4) は、830 ~ 1275 cm -1 (Si-O 結合) の間の広いバンドを表示します。-1MNP@SiO 2@NH2の FTIR スペクトルにおける APTES との機能化の後、おそらく Si-C 結合 (1175 ~ 1250 cm-1の間で予想される) により、より激しくなります。最後に、2995cm-1(C-H伸縮結合)、1640cm-1(O=C-NHアミドII振動)および1577cm-1(O=C-Nヒドロキサミン酸振動)で観察されたバンドをMNP@SiO2のFTIRスペクトルにおいて観察@NH@Fa、ナノ粒子10とのフェロキサミンの結合を確認した。-1 -1 -1
サーモグラビメトリー解析
図5に、有機物や水の添加による重量損失を示すサーモグラビメトリーデータを示す。
ラマン分析
また、裸MNPのシリカコーティングと機能化は、各中間体およびMNP@SiO2@NH@Faのラマン分析によっても確認された(図6)。すべてのラマンスペクトルは、305.8、537.2および665.6cm-1でピークを示し、Fe-O振動(図6A)11)に対応し、713.5cm-1のピーク上の肩を、Si-O-Si振動に関連する(図6B)12。11APTESの官能化後、MNP@SiO2@NH2のラ2マンスペクトルは、SiO2の存在に対応する1001.5および1027.4cm-1で2強烈なピークを表示し、1578.6および1597.9cm-1でSi-C結合の形成を確認する。さらに、703.0cm-1でピークの肩の存在はまた-1、APTES(図6C)13、14の存在13,14を確認した。最後に、1490〜1700cm-1(-1中心1581cm-1)の間の-1広いピークは、MNP@SiO2@NH@FaのラマンスペクトルにおけるSi-C結合およびアミド基に相当する、共役体(図6D)14の形成と一14致している。
XPS 分析
表面上の原子の酸化状態の検討は、XPS分析により行い、構造中の結合形成を確認した。図 7は、さまざまな機能化された MN デバイスと異なる機能化された MN の XPS スペクトルを示しています。MNPの場合、C1の狭いピークは、合成中にサンプルを取り扱う際の不純物による可能性があります。炭素の導入は、MNP@SiO2@NH2および2MNP@SiO2@NH@FaスペクトルにおいてC-Cおよび2C-H結合として観察される。N1sスペクトルの399 eVでのピークの分析と、MNP@SiO2@NH@Faに対して観察された減衰は、MNP@SiO2@NH2とフェロキサミンとの間の2アミド結合の形成を確認する。また、ヒドロキサミック部分のN-O結合の存在は、402eVでピークの存在と一致している。Si2pの狭いスペクトルにおけるピークの存在は、全中間体および共役において、シロキサン群15,16,16に対する結合エネルギーと一致している。
Zポテンシャル
Z の潜在的な値は、表 1に示されています。結果は、それぞれMNPとMNP@SiO2の-25.21および-29.35 mV2の負です。aptesを使用して機能化し、MNP@SiO2@NH2を与え、表面電荷を負から正に変更しました。2この事実はアミン群に起因し、表面電荷はMNP@SiO2@NH@Faに対して正のままである。正の表面Z電位は、細菌(表面が陰性である)と共役17、18、19,18との相互作用を19説明することができる。
細菌捕獲アッセイ
MNP中間体とMNP@SiO2@NH@Faで捕捉されたY.エンゴコリチWC-AおよびFoxA WC-A 12-8の細胞数は、40\u201260コロニーを分離し、容易に視覚化した希釈液で定量化された。裸でキャプチャされたセルの数、MNP@SiO2、および MNP@SiO2@NH2は、それらの間に有意な違いを示さない (図 8)。MNP@SiO2@NH2の遊離アミン基による静電力と2細菌中のフェロキサミン膜受容体の低濃度は、期待される結合特異性の欠如を正当化する可能性がある。
このプロトコルは、主にカルボディイミド化学を使用するもの、異なるタイプのコンジュゲートの合成に適用することができます。より良い結果を得るために修正を導入するのに十分な汎用性があります。すべての中間体と最終的な共役の完全な特徴付けにより、記載された技術を用いて、1つの合成の各ステップに従い、欲望結合の形成を確認することができる。細菌捕獲アッセイ中のコロニーのカウントは、10 μLの低下を使用して、反復を取得し、異なる条件下でアッセイを実行することが容易になる1つのプレートで同時にすべてのサンプルをテストすることができます。
図1:MNP(Fe3O4)(紫)とマグネタイトパターン(黒)の比較
この図は、マルティネス・マタモロスら9.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:裸のMNP(A、BおよびC)およびMNP@SiO2@NH@Fa(D、EおよびF)の明2視野TEMおよび電子回折像。
画像は中解像度と高解像度です。この図は、マルティネス・マタモロスら9.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:MNP@SiO2のEDX2マップ:HAADF画像とA.MNP@SiO2とB.MNP@SiO2の対応するFe、Si、OおよびCマップMNP@SiO2@NH@Fa。2
この図は、マルティネス・マタモロスら9.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:無鉄酸化物のFT-IRスペクトル(Fe3O4)MNP、MNP@SiO2、MNP@SiO2@NH2および22342MNP@SiO2@NH@Fa(4)。
この図は、マルティネス・マタモロスら9.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:MNP、MNP@SiO2@NH2、およびMNP@SiO2@NH@Faのサーモグラメトリック分析。22
この図は、マルティネス・マタモロスら9.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6:裸酸化鉄(Fe3O4)MNP(A)、MNP@SiO2(B)、MNP@SiO2@NH2(C)及び24MNP@SiO2@NH@Fa(D)のラマンスペクトル。32 2
(*)APTES、(**)他の酸化相は、レーザーパワーによるマグネタイトの変質から形成される可能性が高い。この図は、マルティネス・マタモロスら9.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 7: XpS の狭いスペクトル MNP、MNP@SiO 2@NH2と MNP@SiO2@NH@Fa。この図は、マルティネス・マタモロスら9.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図8:Y.エンテゴコリチカのCFUは、磁性ナノ粒子の100μgあたり、裸、MNP@SiO2、MNP@SiO2@NH2、MNP@SiO2@NH@Faを100μgにキャプチャした。22 2
(A)WC-A(野生型)(B)FoxA WC-A 12-8(フェロキサミン受容体FoxAを欠く変異体)およびY.エンゴコリチカと相互作用するMNP@SiO2@NH@FaのSEM画像。ABこの図は、マルティネス・マタモロスら9.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| サンプル | Zポテンシャル |
| Mnp | -25.21 |
| MNP@SiO2 | -29.35 |
| MNP@SiO2@NH2 | 17.03 |
| MNP@SiO2@NH@Fa | 22.14 |
| MNP@SiO2@NHBoc@Fa | 19.16 |
| MNP@SiO2@NHCOOH@Fa | 10.96 |
表1:Z電位測定。この表は、マルティネス・マタモロスら9から得られた。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
このプロトコルは、共有結合による磁性ナノ粒子とシドロフォアフェロキサミンとのコンジュゲートの合成を記述する。マグネタイトの合成は、水系における腐食の磁気コアを保護するためにシリカコーティングを続けて、ピナら5によって報告されたプロトコルを用いて行い、凝集を最小限にし、機能化に適した表面を提供する6。シリカコーティング工程を改変した。Li et al.6によって報告された3つのコーティングを行う代わりに、Mpは、APTES7で機能化ステップを継続するのに十分であったこの方法(図2D)において2つのシリカ層でコーティングされた。
デフェソキサミンは、室温で数時間以内に分解しやすいため、鉄(III)と錯体した。鉄錯体を得る最良の方法は、液体-液体抽出による精製が非常に簡単であり、フェロキサミンが定量収率で得られるので、アセチルアセトネート鉄を使用することです。フェロキサミンは安定しており、コハクN酸無水を使用してN-succiニルフェルフェロキサミンを添加し、リンカーとして末端酸性基を添加するように改変することができる。サイズ排除クロマトグラフィーによる精製により、過剰なコハク酸無水物およびコハク酸をN-スクハクニルフェロキサミンから除去することができます。
アミンナノコンポジットを用い、表面にN-スクハニルフェロキサミンを共有結合させた。核磁気共鳴(NMR)は、鉄酸化物の常磁性挙動により、製品の構造解明には使用できません。このため、各反応ステップをFT-IRでモニタリングし、次いでラマン分光法により確認した。ピークのデコンボリューションとフィッティングは、ラマンスペクトルに3,000 sの合計測定時間を持つ10の尺度が含まれていることを考慮して便利なソフトウェアで作られました。Bコンジュゲートコーティング厚さ測定は、10 nmの均質層を示す(図2D、E)。E
ナノ粒子が磁気的性質と凝集する傾向のために個別に観察できるTEMフィールドを得ることは非常に困難です。EDXマッピングを使用して、表面上の各要素の組成に関する情報を得た(図3A)。炭素密度は、中間MNP@SiO2のMNP@SiOに比べて2@NH@Fa(図3B)で明らかに増加した。
細菌捕獲アッセイは、フェロキサミン外膜タンパク質受容体を介して細菌を捕捉するコンジュゲートの能力を試験するために設計された。エルシニア・エンテゴコリティカWC-A株はFoxAフェロキサミン受容体を発現し、成長しやすいため選択した。この手順の重要なステップは、捕捉されていない細菌の除去であった。これは、滅菌PBSでリンスおよびボルテックスを2回行い、続いて磁石を使用して細菌共役凝集体を回収することによって達成された。MNP中間体の各々によって捕捉された細胞の数は、制御として用いられ、かつコンジュゲートMNP@SiO2@NH@Faは、希釈法からコロニー計数により決定した。10 μLの滴を使用することは実験的プロシージャを促進し、プラークの数えるコロニーの古典的な方法と比較して時間および材料の点でテストの費用を減らす4つ以上のサンプルを扱うことを可能にする。
MNP@SiO2@NH@Faコンジュゲートの合成の最も重要な制限は、NMRによる結合形成を確認することができないということである。MNP@SiO2の@NH@Faの2調製は簡単に思えますが、共有結合を介してシドロフォアとMNPの間のリンクを確認するためには、構造的特性評価技術の使用が重要です。
本プロトコルに従って、カルボディイミド化学を用いてコンジュゲートを生成することができる。これを達成するためには、目的の化合物におけるMNPs表面上のアミノ基およびカルボン酸機能の存在が必要である。異なるリンカーをテストし、他の官能グループでMpNPs表面をコーティングして、正の電荷を生じないようにすると、細菌捕獲差別が改善される可能性があります。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
開示するものは何もありません。
Acknowledgments
著者らは、クラウス・ハントケ教授(ドイツ・テュービンゲン大学)が、この研究で使用されたエルシニア・エンテオコリティカ株を親切に供給してくれたことを感謝する。この研究は、欧州連合(EU)のFEDERプログラムが共同出資するスペインの国家研究機関(AEI/FEDER)からのAGL2015-63740-C2-1/2-RおよびRTI2018-093634-B-C22(AEI/FEDER、EU)からの助成金によって支えられました。サンティアゴ・デ・コンポステーラ大学とア・コルーニャ大学での研究も、GC2018/018、GRC2018/039、およびED431E 2018/03(CICA-INIBIC戦略グループ)の助成金によって支えられ、Xunta de Galiciaから。最後に、このビデオプロトコルのボイスオフを行う彼女の素晴らしいコラボレーションのためにヌリアカルボに感謝したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Hydroxybenzotriazole hydrate HOBT |
Acros | 300561000 | |
| 2,2′-Bipyridyl | Sigma Aldrich | D216305 | |
| 3-Aminopropyltriethoxysilane 99% | Acros | 151081000 | |
| Ammonium hydroxide solution 28% NH3 | Sigma Aldrich | 338818 | |
| Benzotriazol-1-yloxytris(dimethylamino)-phosphonium hexafluorophosphate BOP Reagent | Acros | 209800050 | |
| Benzyl alcohol | Sigma Aldrich | 822259 | |
| Deferoxamine mesylate salt >92,5% (TLC) | Sigma Aldrich | D9533 | |
| Ethanol, anhydrous, 96% | Panreac | 131085 | |
| Ethyl Acetate, Extra Pure, SLR, Fisher Chemical | |||
| Iron(III) acetylacetonate 97% | Sigma Aldrich | F300 | |
| LB Broth (Lennox) | Sigma Aldrich | L3022 | |
| N,N-Diisopropylethylamine, 99.5+%, AcroSeal | Acros | 459591000 | |
| N,N-Dimethylformamide, 99.8%, Extra Dry, AcroSeal | Acros | 326871000 | |
| Pyridine, 99.5%, Extra Dry, AcroSeal | Acros | 339421000 | |
| Sephadex LH-20 | Sigma Aldrich | LH20100 | |
| Succinic anhydride >99% | Sigma Aldrich | 239690 | |
| Tetraethyl orthosolicate >99,0% | Sigma Aldrich | 86578 |
References
- Pan, Y., Du, X., Zhao, F., Xu, B. Magnetic nanoparticles for the manipulation of proteins and cells. Chemical Society Reviews. 41 (7), 2912-2942 (2012).
- Zheng, T., Nolan, E. M. Siderophore-based detection of Fe(III) and microbial pathogens. Metallomics. 4, 866-880 (2012).
- Hider, R. C., Kong, X.
- Sandy, M., Butler, A. Microbial Iron Acquisition: Marine and Terrestrial Siderophores. Chemical Reviews. 109 (10), 4580-4595 (2010).
- Pinna, N., Grancharov, S., Beato, P., Bonville, P., Antonietti, M., Niederberger, M. Magnetite Nanocrystals : Nonaqueous Synthesis, Characterization. Chemistry of Materials. 17 (15), 3044-3049 (2005).
- Li, Y. S., Church, J. S., Woodhead, A. L., Moussa, F. Preparation and characterization of silica coated iron oxide magnetic nano-particles. Spectrochimica Acta - Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 76 (5), 484-489 (2010).
- Chen, J. P., Yang, P. C., Ma, Y. H., Tu, S. J., Lu, Y. J. Targeted delivery of tissue plasminogen activator by binding to silica-coated magnetic nanoparticle. International Journal of Nanomedicine. 7, 5137-5149 (2012).
- El-Boubbou, K., Gruden, C., Huang, X. Magnetic glyco-nanoparticles: a unique tool for rapid pathogen detection, decontamination, and strain differentiation. Journal of the American Chemical Society. 129 (44), 13392-13393 (2007).
- Martínez-Matamoros, D., et al. Preparation of functionalized magnetic nanoparticles conjugated with feroxamine and their evaluation for pathogen detection. RSC Advances. 9 (24), 13533-13542 (2019).
- Cozar, O., et al. Raman and surface-enhanced Raman study of desferrioxamine B and its Fe(III) complex, ferrioxamine B. Journal of Molecular Structure. 788 (1-3), 1-6 (2006).
- Shebanova, O. N., Lazor, P. Characterisation of a-C:H and oxygen-containing Si:C:H films by Raman spectroscopy and XPS. Journal of Solid State Chemistry. 174 (4), 424-430 (2003).
- González, P., Serra, J., Liste, S., Chiussi, S., León, B., Pérez-Amor, M. Raman spectroscopic study of bioactive silica based glasses. Journal of Non-Crystalline Solids. 320 (12), 92-99 (2003).
- Veres, M., et al. Characterisation of a-C:H and oxygen-containing Si:C:H films by Raman spectroscopy and XPS. Diamond and Related Materials. 14 (3-7), 1051-1056 (2005).
- You, Y., et al. Visualization and investigation of Si-C covalent bonding of single carbon nanotube grown on silicon substrate. Applied Physics Letters. 93 (10), 103111-103113 (2008).
- Graf, N., et al. XPS and NEXAFS studies of aliphatic and aromatic amine species on functionalized surfaces. Surface Science. 603 (18), 2849-2860 (2009).
- Michaeli, W., Blomfield, C. J., Short, R. D., Jones, F. R., Alexander, M. R. A study of HMDSO/O2 plasma deposits using a high-sensitivity and -energy resolution XPS instrument: curve fitting of the Si 2p core level. Applied Surface Science. 137 (1-4), 179-183 (2002).
- Liana, A. E., Marquis, C. P., Gunawan, C., Gooding, J. J., Amal, R. T4 bacteriophage conjugated magnetic particles for E. coli capturing: Influence of bacteriophage loading, temperature and tryptone. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 151, 47-57 (2017).
- Fang, W., Han, C., Zhang, H., Wei, W., Liu, R., Shen, Y. Preparation of amino-functionalized magnetic nanoparticles for enhancement of bacterial capture efficiency. RSC Advances. 6, 67875-67882 (2016).
- Zhan, S., et al. Efficient removal of pathogenic bacteria and viruses by multifunctional amine-modified magnetic nanoparticles. Journal of Hazardous Materials. 274, 115-123 (2014).
