Summary

Sintesi di nanoparticelle magnetiche funzionalizzate, la loro coniugazione con la feroxamina Sideroforo e la sua valutazione per il rilevamento dei batteri

Published: June 16, 2020
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Summary

Questo lavoro descrive i protocolli per la preparazione delle nanoparticelle magnetiche, il suo rivestimento con SiO2, seguito dalla sua funzionalizzazione dell’amine con (3-aminopropyl)triethoxysilane (APTES) e la sua coniugazione con deferoxamina utilizzando una moiety succinyl come linker. Una descrizione della caratterizzazione strutturale profonda e un assaggio di batteri di cattura utilizzando Y. enterocolitica per tutte le nanoparticelle intermedie e il coniugato finale sono anche descritti in dettaglio.

Abstract

Nel lavoro attuale, la sintesi delle nanoparticelle magnetiche, il suo rivestimento con SiO2, seguita dalla sua funzionalizzazione dell’ammine con (3-aminopropyl)triethoxysilane (APTES) e la sua coniugazione con deferoxamina, un siderophore riconosciuto da Yersinia enterocolitica,utilizzando una moiety succinyl come linker sono descritti.

Le nanoparticelle magnetiche (MNP) della magnetite (Fe3O4) sono state preparate con metodo solvothermal e rivestite con SiO2 (MNP@SiO2)utilizzando il processo di Stober seguito dalla funzionalizzazione con APTES (MNP@SiO2@NH2). Poi, la feroxamina è stata coniugata con il MNP@SiO2@NH2 da accoppiamento carbodimide per dare MNP@SiO2@NH2@Fa. La morfologia e le proprietà del coniugato e degli intermedi sono state esaminate con otto diversi metodi, tra cui la diffrazione in polvere X-Ray (XRD), la spettroscopia a infrarossi trasformata di Fourier (FT-IR), la spettroscopia Raman, la spettroscopia fotoelettronica a raggi X (XPS), la microscopia elettronica di trasmissione (TEM) e la mappatura di dispersione energetica x-Ray (EDX). Questa caratterizzazione esaustiva confermò la formazione del coniugato. Infine, al fine di valutare la capacità e la specificità delle nanoparticelle, sono state testate in un test di cattura batteri utilizzando Yersinia enterocolitica.

Introduction

I metodi di rilevamento dei batteri utilizzando MNP si basano sul riconoscimento molecolare di anticorpi, aptamers, bioproteine, carboidrati coniugati a MNP dai batteri patogeni1. Tenendo conto che i siderofori sono riconosciuti da recettori specifici sulla membrana esterna dei batteri, potrebbero anche essere collegati a MNP per aumentare la loro specificità2. I siderofori sono piccole molecole organiche coinvolte nell’assorbimento di Fe3 dai batteri3,,4. La preparazione di coniugati tra siderophores e MNP insieme alla loro valutazione per la cattura e l’isolamento dei batteri non è ancora stata segnalata.

Uno dei passaggi cruciali nella sintesi di coniugati di nanoparticelle magnetiche con piccole molecole è la selezione del tipo di legame o di interazione tra di loro per garantire che la piccola molecola sia attaccata alla superficie del MNP. Per questo motivo, la procedura per preparare il coniugato tra nanoparticelle magnetiche e feroxamina – il sideroforo riconosciuto da Yersinia enterocolitica– si è concentrata sulla generazione di una superficie modificabile dell’MNP per consentire il collegamento covalente al sideroforo dalla chimica del carbodicolo. Al fine di ottenere una nanoparticelle magnetite uniformi (MNP) e per migliorare la nucleazione e il controllo delle dimensioni, una reazione di solvosi con alcool benzileè è stata trasportata in un blocco termico senza agitare5. Poi, un rivestimento di silice è stato generato dal metodo St’ber per conferire protezione e migliorare la stabilità delle sospensioni nanoparticelle in un supporto acquoso6. Tenendo conto della struttura della ferosamina, l’introduzione di gruppi di ammina è necessaria per produrre nanoparticelle adatte (MNP@SiO2@NH2) da coniugare con il siderophore. Ciò è stato ottenuto condensando (3-aminopropyl)triethoxysilane (APTES) con i gruppi alcolici presenti sulla superficie delle nanoparticelle modificate di silice (MNP@SiO2)utilizzando un metodo sol-gel7.

Parallelamente, il complesso di ferro di ferosamina(III) è stato preparato con la complessità della deferoxamina disponibile in commercio con acetonato di acetil di ferro in soluzione aques. N-succinylferoxamina, recante gruppi di succinyl che fungeranno da linker, è stata ottenuta dalla reazione della feroxamina con anidride succinica.

La coniugazione tra MNP@SiO2@NH2 e N-succinylferoxamine per dare MNP@SiO2@NHFa è stata effettuata attraverso la chimica del carbodiimide utilizzando come reagenti di accoppiamento benzotriazole-1-yl-oxy-tris-(dimethylamino)-fosofanio esafluorofosfato (BOP) e 1-idrossibenzotriazolo (HOBt) in un supporto di base morbido per attivare il gruppo di acido terminale in N-succinylferoxamine8.

Una volta che gli MNP sono stati caratterizzati, abbiamo valutato le capacità delle nanoparticelle magnetiche nude e funzionaliste per catturare il tipo selvaggio (WC-A) e un mutante di Y. enterocolitica privo del recettore della feroxamina FoxA (FoxA WC-A 12-8). Gli MNP semplici, gli MNP funzionalizzati e i coniugati MNP@SiO2@NHFa sono stati autorizzati a interagire con ogni ceppo Y. enterocolitica. Gli aggregati battericoconiugi sono stati separati dalla sospensione dei batteri dall’applicazione di un campo magnetico. Gli aggregati separati sono stati sciacquati due volte con la salina tampina tamponata di fosfato (PBS), ri-sospesi in PBS per preparare le diluizioni seriali e poi, sono stati placcati per il conteggio delle coccie. Questo protocollo dimostra ogni fase della sintesi di MNP@SiO2@NH@Fa, la caratterizzazione strutturale di tutti gli intermedi e il coniugato, e un analisi di cattura del batterio come un modo semplice per valutare la specificità del coniugato in relazione agli intermedi. 9 (in vie

Protocol

NOTA: Per le reazioni eseguite in condizioni di atmosfera inerte, tutte le vetrerie sono state precedentemente essiccate in forno a 65 gradi centigradi, sigillate con un setto di gomma e eliminate con argon tre volte. 1. Sintesi di nanoparticelle magnetiche coniugate con feroxamina Sintesi di Fe3O4 nanoparticelle magnetiche (MNP) Aggiungere 0,5 g di Fe (acac)3 in una fiala di vetro da 20 mL e quindi mescolare con 10 mL di alcool benzile. …

Representative Results

Viene effettuata una caratterizzazione strutturale esaustiva al fine di determinare la morfologia e le proprietà di ogni intermedio e il coniugato finale. A tale scopo, le tecniche XRD, FT-IR, Raman spettroscopy, TGA, TEM, mappatura EDX e XPS sono utilizzati al fine di dimostrare la formazione del coniugato. Gli stati di ossidazione degli atomi sulla superficie delle nanoparticelle acquisite dalla spettroscopia fotoelettronica a raggi X (XPS) sono i dati più rilevanti per confermare la formazione di legami covalenti tr…

Discussion

Questo protocollo descrive la sintesi di un coniugato tra nanoparticelle magnetiche e la ferosamina sideroforo mediante incollaggio covalente. La sintesi della magnetite è stata effettuata utilizzando il protocollo riportato da Pinna et al.5 seguito dal rivestimento in silice per proteggere il nucleo magnetico della corrosione nei sistemi acquosi, per ridurre al minimo l’aggregazione e per fornire una superficie adatta per la funzionalizzazione6. Il processo di rivestiment…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori riconoscono con gratitudine il professor Klaus Hantke (Università di Tubinga, Germania) per aver gentilmente fornito i ceppi enterocolitica Yersinia utilizzati in questo lavoro. Questo lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni AGL2015-63740-C2-1/2-R e RTI2018-093634-B-C21/C22 (AEI/FEDER, UE) dell’Agenzia statale per la ricerca (AEI) della Spagna, cofinanziato dal programma FEDE dell’Unione europea. Il lavoro svolto nell’Università di Santiago di Santiago di Compostela e dall’Università di A Coruèa è stato sostenuto anche dalle sovvenzioni GRC2018/018, GRC2018/039 ed ED431E 2018/03 (gruppo strategico CICA-INIBIC) della Xunta de Galicia. Infine, vogliamo ringraziare Nuria Calvo per la sua grande collaborazione facendo la voce-off questo protocollo video.

Materials

1-Hydroxybenzotriazole hydrate
HOBT
Acros 300561000
2,2′-Bipyridyl Sigma Aldrich D216305
3-Aminopropyltriethoxysilane 99% Acros 151081000
Ammonium hydroxide solution 28% NH3 Sigma Aldrich 338818
Benzotriazol-1-yloxytris(dimethylamino)-phosphonium hexafluorophosphate BOP Reagent Acros 209800050
Benzyl alcohol Sigma Aldrich 822259
Deferoxamine mesylate salt >92,5% (TLC) Sigma Aldrich D9533
Ethanol, anhydrous, 96% Panreac 131085
Ethyl Acetate, Extra Pure, SLR, Fisher Chemical
Iron(III) acetylacetonate 97% Sigma Aldrich F300
LB Broth (Lennox) Sigma Aldrich L3022
N,N-Diisopropylethylamine, 99.5+%, AcroSeal Acros 459591000
N,N-Dimethylformamide, 99.8%, Extra Dry, AcroSeal Acros 326871000
Pyridine, 99.5%, Extra Dry, AcroSeal Acros 339421000
Sephadex LH-20 Sigma Aldrich LH20100
Succinic anhydride >99% Sigma Aldrich 239690
Tetraethyl orthosolicate >99,0% Sigma Aldrich 86578

References

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Martínez-Matamoros, D., Castro-García, S., Ojeda Romano, G., Balado, M., Rodríguez, J., Lemos, M. L., Jiménez, C. Synthesis of Functionalized Magnetic Nanoparticles, Their Conjugation with the Siderophore Feroxamine and its Evaluation for Bacteria Detection. J. Vis. Exp. (160), e60842, doi:10.3791/60842 (2020).

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